Isolement des cellules de la lignée monocyte-macrophage à partir d’os de rat par la méthode d’adhérence secondaire

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour l’isolement des BMM chez les rats SD, appelé méthode d’observance secondaire.

Résumé

Avec une diminution de la densité minérale osseuse, les os sont plus susceptibles de se fracturer, affectant ainsi négativement la qualité de vie d’un patient. La croissance et le développement des os sont principalement régulés par les ostéoblastes et les ostéoclastes. Il a été largement admis que les ostéoclastes sont dérivés de cellules monoculo-macrophages (BMM) de la moelle osseuse. Les BMM et autres cellules souches hématopoïétiques sont situées dans la cavité de la moelle osseuse. Par conséquent, isoler des BMM stables uniques à partir de populations cellulaires différentes et hétérogènes est un énorme défi. Nous présentons ici un protocole pour l’isolement des BMM chez les rats SD, appelé méthode d’observance secondaire. Des cellules adhérentes cultivées pendant 24 à 48 h en culture primaire ont été collectées. L’analyse cytométrique en flux a montré qu’environ 37,94 % des cellules étaient CD11b/c+ (antigène de surface monocyte-macrophage). La coloration à la phosphatase acide résistante au tartrate (TRAP) et l’analyse par transfert western ont démontré que les MGM pouvaient se différencier en ostéoclastes in vitro. Les résultats ci-dessus suggèrent que les cellules d’adhérence secondaires pourraient être considérées comme un modèle cellulaire approprié pour la recherche sur la différenciation des ostéoclastes.

Introduction

Il a été rapporté que les cellules de la lignée monocyte-macrophage existant dans la moelle osseuse peuvent se différencier en monocytes sanguins et macrophages tissulaires ^1,2. Les cellules ci-dessus, qui peuvent se différencier en ostéoclastes pour équilibrer la croissance et le développement osseux, sont couramment utilisées comme modèle cellulaire pour induire des ostéoclastes in vivo ^3,4. La moelle osseuse est un tissu spécial contenant plusieurs types de cellules, qui comprennent, mais ne sont pas limités aux cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse, aux cellules monocytaires-macrophages de la moelle osseuse (BMM), aux cellules souches hématopoïétiques, aux cellules endothéliales et aux cellules immunitaires. En fait, plusieurs études antérieures ont suggéré que les cellules adhérentes se précipitaient hors de la cavité de la moelle osseuse de l’os long pourraient se différencier en ostéoblastes, ostéoclastes, chondrocytes ou adipocytes 5,6,7,8. Bien que différentes méthodes d’isolement et de culture aient été utilisées pour produire différentes populations cellulaires homogènes, il existe encore de grands défis dans l’isolement et la culture de MGM à partir d’une variété de types cellulaires différents.

Plusieurs méthodes ont été mises au point pour extraire les macrophages mononucléaires de la moelle osseuse (BMSC). Cependant, la majorité de ces méthodes sont complexes ^9,10,11. Par exemple, la centrifugation par gradient de densité nécessite un kit spécialisé et l’opération prend du temps et est lourde. Cette méthode convient à l’isolement des BMM à partir d’échantillons de sang à volume élevé, mais pas d’échantillons de moelle osseuse ^9,12,13. En outre, l’extraction d’échantillons de tissus à l’aide de la digestion à la collagénase est une procédure complexe et longue; cette méthode n’est pas recommandée pour l’isolement des BMM à partir d’échantillons de moelle osseuse^14,15. En outre, bien que la séparation des flux puisse entraîner des populations de monocytes/macrophages hautement purifiées, elle nécessite des échantillons de très grande taille et des exigences élevées en instruments et en équipement^10,16. De plus, la méthode d’enrichissement des microbilles est extrêmement coûteuse et n’est pas réalisable dans un laboratoire général¹⁷.

Par conséquent, dans la présente étude, une méthode pratique, rapide et bon marché a été proposée pour isoler les macrophages mononucléaires de la moelle osseuse. Les cellules de la moelle osseuse adhérées à différents moments ont été utilisées pour isoler les MMO à l’aide d’une méthode d’adhérence secondaire. Les BMM extraits avec la méthode ci-dessus pourraient induire la formation d’ostéoclastes in vitro, fournissant ainsi un modèle cellulaire simple et pratique pour l’étude future de l’ostéoporose in vitro.

Protocole

Toutes les expériences de cette étude ont été menées conformément aux directives d’expérimentation animale du Centre de recherche sur les animaux de laboratoire de l’Université médicale chinoise du Zhejiang (numéro d’approbation: IACUC-20181029-11).

1. Extraction cellulaire

1. Placez les rats Sprague-Dawley (rats SD, âgés de 1 à 10 jours, mâles ou femelles) dans les cages d’euthanasie remplies de CO₂ à un taux équilibré de 30% à 70% de volume de récipient / minute. Après que les rats ont perdu conscience (20-60 min), euthanasier le rat par luxation cervicale pour assurer une mort indolore.
2. Immerger les rats dans de l’alcool à 75% pendant 10 min pour désinfection.
3. Retirez soigneusement tous les membres du rat avec des ciseaux et des pinces, aspirez avec du PBS à l’aide d’une pipette et rincez le sang adhérant aux membres.
4. Ajouter 5 mL de solution de pénicilline/streptomycine dans 500 mL de DMEM et bien mélanger. Prendre un tube de centrifugeuse stérile de 50 mL, ajouter 5 mL de FBS et 45 mL de milieu DMEM et bien mélanger pour obtenir une solution de DMEM FBS à 10 % contenant 1 % de pénicilline/streptomycine. Ajouter 2 mL du milieu de culture ci-dessus dans un tube de 5 mL.
5. Transférer les os des membres dans le tube de 5 mL. Utilisez des ciseaux pour couper les os des membres dans le tube en petits morceaux (1-3 mm) et mélangez l’homogénat pour suspendre à nouveau les cellules de la moelle osseuse dans le milieu de culture. Rester debout pendant 5 min jusqu’à ce que les fragments de tissu se déposent au fond du tube.
6. Ajouter 10 mL de 10 % de FBS DMEM dans une antenne de culture de 100 mm, puis transférer le surnageant dans la parabole de culture. Lorsque vous aspirez le surnageant, évitez de transférer les débris tissulaires dans la boîte de culture.
7. Incuber à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant environ 24 h. Après cette période d’incubation, la majorité des cellules souches mésenchymateuses adhéreront à la paroi de la boîte de culture et se développeront lentement, tandis que la plupart des MMO seront toujours suspendues dans le milieu de culture.
8. Transférer la suspension cellulaire dans la boîte de culture de 100 mm dans une nouvelle fiole^{de 25 cm 2} et continuer à cultiver les cellules à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 24 h supplémentaires. Les MGB adhéreront à la paroi de la fiole à 24-48 h de culture. Retirez soigneusement l’ancien milieu et remplacez-le par un milieu frais une fois que les MGM ont adhéré à la paroi de la fiole.
9. Sous-culture lorsque les cellules de la fiole ont atteint une confluence de 80% à 90%.
   NOTE: Toutes les cellules ont été cultivées à 37 ° C et à 5% de CO₂. Au cours de la culture, la morphologie cellulaire a été progressivement unifiée. Les cellules étaient grandes, de forme irrégulière, en croissance radiale et attachées à la fiole sous forme de disque, où plusieurs noyaux pouvaient être observés.

2. Coloration FACS de la cellule

1. La trypsine est digérée à l’aide de 1 à 2 mL de trypsine commerciale à 37 °C et de 5 % de CO₂ pendant 5 min et compte les cellules adhérentes secondaires pour assurer un nombre final de cellules de 100 000/échantillon (cellules de comptage avec l’hémocytomètre Neubauer).
2. Divisez les cellules en trois groupes (500 μL de PBS contient 100 000 cellules) : (1) le groupe témoin vide contenant des cellules non colorées ; 2° le groupe témoin de l’isotype; et (3) le groupe expérimental (coloration CD11b/c).
3. Incuber des anticorps primaires (pas d’anticorps pour le groupe témoin vierge; contrôle de l’isotype anti-CD11 pour le groupe témoin de l’isotype, 0,6 μL d’anticorps/échantillon, 1 μg/échantillon; anti-CD11b/c pour le groupe expérimental, 1 μL d’anticorps/échantillon, 1 μg/échantillon) sur de la glace pendant 30 min.
4. Centrifuger à 300-350 x g pendant 5 min, jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension avec 500 μL de PBS. Répétez la procédure ci-dessus une fois pour vous assurer que les anticorps primaires non liés sont lavés.
5. Incuber l’anticorps secondaire correspondant (pas d’anticorps pour le groupe témoin vierge; IgG anti-lapin de chèvre pour le contrôle de l’isotype et les groupes expérimentaux, anticorps/échantillon de 0,25 μL, 1:2 000) sur de la glace dans l’obscurité pendant 30 min.
6. Centrifuger à 300-350 x g pendant 5 min, jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension avec 500 μL de PBS. Répétez la procédure ci-dessus une fois pour vous assurer que les deuxièmes anticorps non liés sont lavés.
7. Détecter les cellules CD11b/c positives par cytométrie en flux (10 000 cellules/échantillon) et analyser les données par logiciel (par exemple, FlowJo 7.5).
   NOTE: Pour obtenir le pourcentage final de cellules CD11b / c +, la formule suivante a été utilisée: Pourcentage de cellules CD11b / c + dans le groupe expérimental - le pourcentage de cellules CD11 + dans le groupe témoin isotype.

3. Coloration de Wright-Giemsa

1. Ensemencer les cellules secondaires adhérentes qui ont été passées trois fois sur des feuilles grimpantes de 35 mm ಠcellules (1 × 10⁶ cellules/puits) et les mettre en culture à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 24 h.
2. Jeter le milieu de culture et laver trois fois avec du PBS.
3. Ajouter la solution de colorant Wright-Giemsa (0,5 mL-0,8 mL) à la feuille d’escalade cellulaire pendant 1 min.
4. Mélanger le colorant avec de l’eau distillée (0,5 mL-0,8 mL) avec un coton-tige et laisser reposer pendant 10 min.
5. Lavez la solution de colorant avec de l’eau distillée, puis séchez pendant 1 à 3 minutes. Observez au microscope.

4. Coloration TRAP

1. Ensemencer les cellules secondaires adhérentes qui ont été passées trois fois sur des feuilles grimpantes de 35 mm ಠcellules (1 × 10⁶ cellules/puits) et les mettre en culture à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 24 h.
2. Remplacer l’ancien milieu par le DMEM FBS à 10 % ou le milieu d’induction des ostéoclastes complété par un activateur du récepteur 50 ng/mL du ligand du facteur nucléaire κB (RANKL) et 30 ng/mL du facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF), et la culture à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 7 jours supplémentaires.
3. Tassez les cellules avec le kit de coloration TRAP selon le protocole du fabricant et observez au microscope.
   REMARQUE: Les cellules TRAP-positives ont été définies comme des ostéoclastes, qui étaient violets au microscope optique. Le nombre de cellules TRAP-positives a été mesuré à l’aide du logiciel ImageJ.

5. Transfert western

1. Ensemencer les cellules secondaires adhérentes qui ont été passées trois fois sur des feuilles grimpantes de 35 mm^{à 2} cellules (1 × 10^{à 6} cellules/puits) et les cultiver pendant 24 h.
2. Remplacer l’ancien milieu par du DMEM FBS frais à 10 % ou un milieu d’induction ostéoclaste (50 ng/mL de RANKL et 30 ng/mL de M-CSF) et cultiver pendant 7 jours supplémentaires à 37 °C et 5 % de CO₂.
3. Extraire les protéines cellulaires totales avec un tampon RIPA, séparé par 10% SDS-PAGE, et transférer dans les membranes de fluorure de polyvinylidène^18,19.
4. Bloquer avec 5% de poudre de skimmilk (25 mL) pendant 2 h et laver trois fois, pendant 10 min à chaque fois, avec TBS-Tween 20 (TBST).
5. Incuber les anticorps primaires à 4 °C pendant la nuit (anti-β-actine, anti-TRAP et anti-cathepsine K; tous les anticorps primaires ont été dilués 1:1 000, 10 mL d’anticorps dilués /bande), et laver trois fois avec TBST.
6. Incuber l’anticorps secondaire (IgG anti-lapin de chèvre, dilution 1:2 000, anticorps/bande dilué de 10 mL) à température ambiante pendant 2 h et laver trois fois avec tbST. Visualisez les bandes protéiques à l’aide d’une solution en développement.
   REMARQUE: Les niveaux d’expression des protéines ci-dessus ont été normalisés à β-actine.

Résultats

La population de cellules adhérentes secondaires était stable et uniforme. Avec la prolifération cellulaire continue, la majorité des cellules sont devenues plus grandes, de forme irrégulière et se sont développées en un disque adhérent radial (Figure 2C, D). La cytométrie en flux a montré que le pourcentage de cellules exprimant CD11b/c, un marqueur moléculaire à la surface des cellules de la lignée monocyte-macrophage, était ...

Discussion

Les ostéoclastes sont l’un des types de cellules les plus importants impliqués dans l’apparition et le développement de maladies osseuses, ainsi que l’un des principaux objets de la recherche sur les maladies^{osseuses 20}. Les monocytes/macrophages peuvent se différencier en ostéoclastes. Étant donné que les macrophages mononucléaires (cellules RAW264.7) sont trop chers à l’achat et sont facilement activés pendant la culture, il est difficile d’effectuer des expériences de d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm2 cell climbing slices	NEST Biotechnology	80102
Anti-cathepsin K	Abcam	ab19027	1:1,000
Anti-CD11 isotype control	Abcam	ab172730	1 μg/test,1.675 mg/Ml
Anti-CD11b/c	Absin	abs124232	1μg/test, 1 mg/mL
Anti-TRAP	Abcam	ab191406	1:1,000
Anti-β-actin	Beyotime	AF5003	1:1,000
Cell climbing slices	NEST Biotechnology	80102
Cell culture dish	corning	430167
Cell culture flask	corning	430168
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Gibco	C11995500BT
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10099141C
Goat anti-rabbit IgG	Abcam	ab150077	for IF, 1:2,000
goat anti-rabbit IgG	Abcam	ab6721	for WB, 1:2,000
M-CSF	Pepro tech	400-28
PBS	Biosharp	BL302A
RANKL	Pepro tech	400-30
SD rat	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd		1-10 days old
SDS-PAGE gel preparation kit	Solarbio	P1200
TRAP/ALP Staining Kit	Wako	294-67001
Trypsin-EDTA solution	Biosharp	BL512A
Wright-Giemsa solution	Keygen Biotech	KGA225-1