微多孔性アニール粒子足場用ミクロゲルビルディングブロックのマイクロ流体合成

要約

このプロトコルは、様々な再生医療用途に使用することができる微多孔性アニール粒子足場のためのミクロゲルビルディングブロックを合成するための一連の方法を記載している。

要約

微多孔性アニール粒子(MAP)足場プラットフォームは、粒状ヒドロゲルのサブクラスである。これは、二次光ベースの化学架橋工程(すなわち、アニーリング)に続いて、その場で細胞スケールの空隙率を有する構造的に安定な足 場 を形成することができるミクロゲルの注入可能なスラリーからなる。MAP足場は、皮膚創傷治癒、声帯増強、幹細胞送達など、さまざまな再生医療用途で成功を収めています。この論文では、MAPスキャフォールドを形成するためのビルディングブロックとして、ポリ(エチレングリコール)(PEG)ミクロゲルの合成および特性評価の方法について説明します。これらの方法には、カスタムアニーリングマクロマー(MethMAL)の合成、ミクロゲル前駆体ゲル化速度論の決定、マイクロ流体デバイス作製、ミクロゲルのマイクロ流体生成、ミクロゲル精製、およびミクロゲルサイジングおよびスキャフォールドアニーリングを含む基本的なスキャフォールド特性評価が含まれる。具体的には、本明細書に記載されるハイスループットマイクロ流体法は、特に再生医療の分野において、任意の所望の用途のためのMAP足場を生成するために使用することができる大量のミクロゲルを生成することができる。

概要

MAP足場プラットフォームは、架橋時に細胞スケールのマイクロ多孔性を提供するヒドロゲル微粒子(ミクロゲル)で完全に構成された注射可能な生体材料であり、分解に依存しない細胞遊走およびバルク組織集積を可能にする¹。MAP足場プラットフォームは、宿主組織と迅速に統合する能力と本質的に低い免疫原性により、真皮創傷治癒の加速を含む多種多様な再生医療療法²、3、⁴、⁵、⁶、⁷、^8、9、10の前臨床適用性を実証しています^1,3,¹¹,血管再生脳脳卒中空洞⁷,間葉系幹細胞²の送達^,及び血餅不全を治療するための組織増量の提供⁶。MAPはまた、M2マクロファージ³の動員を介して宿主組織に抗炎症効果を伝えることが示されており、Th2「組織修復」免疫応答を促進するように調整することさえできる⁸。MAP足場プラットフォームのこれらの好ましい特性により、多様な臨床用途に拡張することができます。

MAP足場形成のためのミクロゲルを生成するための以前に公表された方法には、フロー集束液滴マイクロフルイディクス¹、⁴、^7、9、エレクトロ^{スプレー5,12、}およびバッチエマルジョン^6,10によるオーバーヘッドスピニングが含まれる。液滴マイクロ流体法は、高い単分散性の粒子を生成することができるが、粒子の収率(μL/h)が低い非常に遅い流速を使用する。あるいは、エレクトロスプレー法およびバッチエマルジョン法は、大量の粒子を、高い粒子多分散性で製造することができる。このプロトコルは、de Rutte et al¹³による研究に基づいて、ハイスループットマイクロ流体法を使用して、単分散集団を有するミクロゲルを製造する。この方法は、ソフトリソグラフィー技術を利用して、フォトマスクからポリジメチルシロキサン(PDMS)マイクロ流体デバイスを作成し、それをスライドガラスに接着する。装置設計は、大量のミクロゲル粒子(mL/h)を生成するために段階乳化に依存しています。この方法で達成できる単分散性は、単分散ミクロゲルがより均一な細孔径を有する足場を形成することができるので、他の技術と比較して空隙率の優れた制御を提供する²。

MAP足場のビルディングブロックとして作用することができる個々のミクロゲルを合成し、特徴付けるための方法は、特に、ミクロゲルゲル化のためのチオール官能化架橋剤による効率的なマイケル型付加に容易に関与する、マレイミド(MAL)基を有するPEG骨格からなるミクロゲルを作成するという点で、この原稿内で概説されている。マイクロゲルゲル化をMAP足場アニーリングから切り離すために、この論文では、ヘテロ官能性メタクリルアミド/マレイミド4アームPEGマクロマーである、公開されている¹⁴ カスタムアニーリングマクロマーMethMALを合成する方法についても説明します。メタクリルアミド官能基は、フリーラジカル光重合(ミクロゲルアニーリング用)に容易に関与し、MAL官能基に対するマイケル型付加を促進する条件に対して比較的不活性なままである。

さらに、この論文では、PDMSマイクロ流体デバイスの作成、マイクロゲルゲル化速度の決定、およびミクロゲルサイズの特性評価のためのプロトコルの概要を説明します。原稿の最後の部分は、MAP足場アニーリングを詳述しています.これは、ミクロゲルの表面を共有結合で結合する二次的な光開始架橋ステップを経て、ミクロゲルがその場 で バルク足場に移行するときです。前述のように、酵素媒介アニーリングなどの光ベースの化学に依存しないMAPスキャフォールドシステムで実装できる他のアニーリング方法があることに注意することが重要です¹。全体として、これらの方法は、直接使用することも、異なるヒドロゲル製剤化学(例えば、ヒアルロン酸ベース)と共に使用して、任意の用途のためのMAP足場を生成することもできる。

プロトコル

1. メタマールアニーリングマクロマー合成

注:このプロトコルは、特に1gのPEG-マレイミドを修飾するためのものですが、より大きなバッチを作るためにスケールアップすることができます。

1. 1gの4アーム20kDaPEG-マレイミドを、攪拌子付きの小さなガラスビーカー中の10mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH7.4)10mLに加える。PEGが完全に溶解するまで溶液を300rpmで撹拌する(〜30分)。
2. 14.65 mgの2-アミノエタンチオール(0.67:1のチオール[SH]対マレイミド[MAL]モル比)を300rpmで攪拌しながら反応物に加える。
   注:2-アミノエタンチオール上のチオール基は、マイケル型付加を介してPEG-MALの約3つのアームに付加され、アミン末端基が残る。
   1. 追加する2-アミノエタンチオールの量について、次の計算例を観察します。
      
      
      
      注:非常に少量の測定を避けるため、1mLの1x PBS(pH 7.4)に100 mgの2-アミノエタンチオールを溶解し、その溶液を146.5 μLを反応に加えます。
3. ステップ1.2の後、1時間10分待ってから、160.1mgの4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロリド(DMTMM、PEGに対する12:1のモル比)と32.77μLのメタクリル酸(PEGに対する8:1モル比)を5mLの1x PBS(pH 7.4)に新しいガラスビーカーに混合し、300rpmで攪拌しながら50分間反応させる。
   注:このステップでは、メタクリル酸はDMTMMと反応して反応性の高いエステルを形成し、PEG上の利用可能なアミン基に結合することができます。
   1. 追加する DMTMM の量を計算するための次の計算例を確認します。
      
      
      
   2. 追加するメタクリル酸の量を計算するための次の計算例を観察します。
      
      
      
      
4. メタクリル酸/DMTMM溶液を20kDaのPEG-MAL/2-アミノエタンチオール溶液とともにビーカーに加える。
5. 53.56 μLのトリエチルアミン(メタクリル酸に対する1:1モル比)をビーカーに加え、300rpmで攪拌しながら一晩反応させる。ビーカーをホイルで覆い、ほこりやその他の汚染物質がビーカーに入らないようにします。
   1. 追加するトリエチルアミンの量について、次の計算例を観察します。
      
      
6. 反応液をスネークスキン透析チューブに移す(分画分子量:3,500Da)。
7. 透析チューブを脱イオン(DI)水(容量はチューブ全体を覆うべきである)に1 M NaClを入れた大きなビーカーに入れ、300rpmで3日間攪拌する。1 M NaCl 溶液を毎日 2 回交換し、合計 6 回の洗浄を行います。
8. DI水で6時間透析する。DI水を1時間ごとに交換して、合計6回の洗浄を行います。
9. 反応液を50mL円錐管に移し、−80°Cで凍結する。
10. 0 °C まで、開始温度 -70 °C、温度ランプ 0.01 °C/分でチューブを少なくとも 72 時間凍結します。
11. 25 mgのMethMALを700 μLのクロロホルム-dに溶解し、NMRチューブに移して ^、1H-NMR用のサンプルを調製する。
12. 1H-NMRスペクトルを取得する。
    メモ:このプロトコルのスペクトルは、掃引幅 = 6,467.3 Hz、時間遅延 = 13.1 s、集録時間 = 5.1 s、パルス時間 = 5.1 μs、スキャン回数 = 8 のパラメータを持つ500 MHz分光器を使用して集録されました。
13. 分析のために、マレイミドピークを基準として積分し(約6.76ppm)、次に2つのメタクリルアミドピーク(〜5.35ppmおよび5.6ppm)を積分する。メタクリルアミドピーク面積の比率を3つのピークすべての合計面積で除し、メタクリルアミドで修飾されたアームの割合を求めた。
    注:許容可能な修飾は、67%〜75%のメタクリルアミド官能基置換である。MethMALの1H-NMRスペクトルの例を図1に示す。
    1. 置換度式として式(1)を使用します。
       (1)

図1:MethMALの化学構造と1H-NMRスペクトル。 (A)化学構造:MethMALアニーリングマクロマーは、3つのメタクリルアミドアームで修飾された20kDaの4アームポリ(エチレングリコール)で構成されています。(B)この構造は、PEG-MALスペクトルには存在しない5.36ppm(3)および5.76ppm(2)にピークを生成し、6.71ppmにピークを生成する1つのマレイミドアーム(1)。溶媒クロロホルムは7.26ppmにピークを生成し、このサンプルの残留水は2.2ppm(スペクトルで標識)にピークを生成しました。MethMALスペクトルにおいて、マレイミドピークの積分面積は0.27であり、メタクリルアミドピークの面積の合計は0.73(0.37 + 0.36)であった。メタクリルアミド修飾の割合は73%(0.73/(0.27+0.73))であった。この図はPfaffら^{14からのものである}。著作権(2021)アメリカ化学会。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

2. ミクロゲル前駆体ゲル化速度論

注:ゲル化時間は、ゲル前駆体成分を溶解するために使用される緩衝液のpHを調整することによって変更することができる。PEG−マレイミドヒドロゲルの場合、より酸性のpHは、典型的には、より低い^pH15でチオレート濃度が低下するので、より遅いゲル化時間に対応する。

1. ポリマー、架橋剤、およびその他のゲル前駆体成分(すなわち 、ペプチド、グリコサミノグリカン)の所望の濃度を予め決定する。PEG-MAL、RGD、および MethMAL (PEG 骨格) を 10x PBS (pH 1.5) に、MMP-2 架橋剤を 1x PBS (pH 7.4) に溶解させます。
   注:このプロトコールでは、ゲル前駆体溶液は、45.88 mg/mL 4アームPEG-MAR(10 kDa)、0.82 mg/mL RGD、8.06 mg/mL MethMAL、および4.62 mg/mL MMP-2架橋剤(酵素分解性架橋剤)からなる公開製剤³です。
2. 0.4mmのギャップサイズ、1.0のせん断ひずみ、1.0Hzの周波数、および10,800秒の持続時間を使用して、貯蔵および損失係数を監視するために、粘度計または同等の機器を準備します。
   1. 35 mm プレート ローター (P35/Ti) ジオメトリを取り付けます。加湿されたチャンバーまたは湿ったスポンジを使用して、ジオメトリの周囲に加湿された環境を維持します。
   2. PEG骨格とMMP架橋剤を1:1の体積比で混合します。
   3. ゲル前駆体溶液400 μLを粘度計ステージの中央にピペットで流す。
   4. 所定のギャップサイズ0.4mmに達するまでジオメトリをステージ上にゆっくりと下げ、室温で最大6時間、貯蔵(G ')および損失(G'')モジュライの監視を直ちに開始します。
      注:ゲル化は、貯蔵弾性率が損失弾性率よりも大きくなったときに開始すると考えられ、貯蔵弾性率がプラトーになるとゲル化は完了したと見なされます。代表的なゲル化速度曲線を 図2に示す。

図2:粘度計によって決定されたMAPゲル前駆体溶液(pH4.5)のゲル化動態の代表的な曲線。 ゲル化は貯蔵(G ́)弾性率の急速な増加から始まり、ゲル化はG'曲線がプラトーに達したときに完了する。G''は損失弾性率を示す。この図はPruettら^{3からのものである}。Copyright (2021) Wiley-VCH GmBH. この図の拡大版を見るにはここをクリックしてください。

3. マイクロ流体デバイス作製

注:このプロトコルは、図3Aに見られるde Rutteら¹³から適合したマイクロ流体ステップ乳化装置設計のデバイス製造を記述しています。ただし、このプロトコルは、SU-8ウェーハにエッチングされる任意のデバイス設計で使用できます。SU-8シリコンウェーハマスター製造は、適切なクリーンルーム設備が製造に利用可能でない限り、外部委託することをお勧めします。

1. SU-8ウェーハフォトマスクから最初のポリジメチルシロキサン(PDMS)マイクロ流体デバイスを作成します。
   1. 主剤と硬化剤を10:1 w/w比で混合して〜200gのPDMSを調製する( 材料表を参照)。
   2. SU-8ウェーハを培養皿に入れ(ウェーハの端をディッシュにテープで留めます)、マイクロ流体設計を上向きにします。
   3. PDMSを皿に注ぎ、ウェーハの上に厚さ1〜1.5cmの層を作成します。皿を真空下に置き、泡を取り除きます。
   4. PDMSを固化(室温で24時間または60°Cで約2時間)まで硬化させます。
   5. PDMSが硬化したら、カミソリの刃またはメスを慎重に使用して、ウェーハ上の設計の周りに0.5〜1cmのマージンがあるように、PDMSを通して長方形を切断します。
      メモ:ウェーハの損傷(割れ、引っ掻き傷など)を避けるために、圧力をあまり使用せず、非常に穏やかにしてください。
   6. ヘラをカットの1つにくさび込み、カットに沿ってスライドさせてPDMSをウェーハから分離します。
      メモ:PDMSがウェーハから分離すると、PDMSの下に気泡が形成され始めます( 図3Bを参照)。
   7. ヘラを使用して、PDMSの長方形を皿から静かに持ち上げます。
      メモ:ウェーハの上のPDMSに生じるギャップは、マイクロ流体デバイスの金型になります。
2. SU-8ウェーハフォトマスクから後続のPDMSマイクロ流体デバイスを作成します。
   1. ベースと硬化剤を10:1の比率で混合することによって、金型あたり〜15〜20gのPDMSを準備する。
   2. 金型内の長方形の隙間にPDMSを注ぎ、ウェーハの上に5mmのPDMS層を作成します。金型を真空下に置き、気泡を除去します。
   3. PDMSが完全に固化するまで硬化させます(室温で24時間または60°Cで2時間)。
   4. PDMSが硬化したら、カミソリの刃またはメスを使用して、長方形の端の周りのPDMSを切断します。
      メモ:ウェーハの損傷(ひび割れなど)を避けるために、圧力をあまり使用せず、非常に穏やかにしてください。
   5. ヘラをカットの1つにくさび込み、カットに沿ってスライドさせてPDMSをウェーハから分離します。
      メモ:PDMSがウェーハから分離すると、PDMSの下に気泡が形成され始めます。
   6. 1.5 mm 生検パンチを使用して、2 つの入口と出口に PDMS 長方形に穴を開けます ( 図 3B を参照)。
   7. 1枚のウェーハに複数のデバイスがある場合は、ヘラまたはカミソリの刃を使用して各デバイス間のPDMSを軽くスコアリングし、PDMSが単独で非常にきれいに分離するように、スコア付けされた線に沿ってPDMSを静かに折ります。
   8. PDMSデバイスは、ほこりのない容器に保管してください。
3. PDMSマイクロ流体デバイスをスライドガラスに接着します。
   1. PDMSマイクロ流体デバイスごとにスライドガラスを1枚用意する。テープ、ろ過空気、またはイソプロピルアルコール(IPA)洗浄を使用して、スライドからほこりを取り除きます。次の手順に進む前に、スライドが完全に乾いていることを確認してください。
   2. スライドガラスとPDMSデバイスをデザイン面を上にして、小さなプラスチックトレイ(96ウェルプレートの蓋がこれに適しています)に隣り合わせに置き、プラズマクリーナーに入れます。ドアとエアフローバルブを閉じ、真空ポンプをオンにします。少なくとも30秒間実行してから、電源を切ります。
   3. 酸素タンクガス管を気流バルブに接続します。プラズマチャンバを酸素で30秒間満たした後、酸素をオフにして気流バルブを閉じます。
   4. 真空ポンプの電源を入れ、無線周波(RF)レベルを ハイに設定します。チャンバーが紫色 - ピンク色に変わるまで待ちます( 図3Bを参照)。30秒経過します。
   5. タイマーがオフになったら、プラズマと真空をオフにします。その後、気流弁をゆっくりと開き、真空を解除します。プラズマクリーナーからトレイを取り外します。
   6. PDMSデバイスをスライドガラスにそっとひっくり返して接着します。接合が行われると、PDMSの透明性のわずかな違いを観察します。
      メモ:最良の結果を得るには、ボンディングしたデバイスを使用直前まで60°Cで保管してください。
4. PDMSマイクロ流体デバイスの表面処理
   1. PFOCTS(トリクロロ(1H,1H,2H,2H-パーフルオロオクチル)シラン)をノベックオイル(1:50)で希釈して表面処理を調製する。3 ~ 4 個のデバイスには 1 mL を使用してください。容量を1mLシリンジに移し、25G針を取り付けます。
      メモ:このプロトコルで使用される針は斜めになっているため、シャープな取り扱いには注意してください。必要に応じて鈍い針を使用することもできます。
   2. 処理するデバイスごとに10〜12cmのタイゴンチューブを切断します。
   3. PEEKチューブの長さを約7cmカットします。 図 4A に示すように、数ミリメートルの PEEK チューブをタイゴン チューブの端に挿入して、針がタイゴン チューブの入口に穴を開けないようにします。
   4. 加熱されたチャンバーからデバイスを取り出し、タイゴンチューブの非PEEK端を水性入口穴に挿入します。
   5. 表面処理シリンジの針をPEEKチューブに挿入し、オイルチャンバ出口穴を覆います( 図3B参照)。
   6. 治療をゆっくりとデバイスに注入し、気泡なしでデバイスを満たしていることを確認します。水性チャンバーが最初に満たされるのを待ち、次に小さなチャネル、次にオイルチャンバーが充填されるのを待ちます。タイゴンチューブをデバイスから取り外します。デバイスが満たされたら、室温で10分間休ませます。
   7. 5 mL シリンジにオイルのみ (シランなし) を充填し、25 G 針を取り付けます。
   8. 表面処理を吸気口と出口を通して装置から吸引します。タイゴンチューブを水性入口に挿入し、オイルを入れたシリンジをPEEKチューブに挿入し、各デバイスをオイルで洗い流します。装置からオイルを吸引します。
   9. オイルフラッシュをさらに2倍繰り返します。タイゴンチューブを取り外します。
      メモ: デバイスを使用する準備ができました。

図3:マイクロ流体PDMSデバイス(A)マイクロ流体デバイス設計のコンピュータ支援設計(AutoCAD)図面。ミクロゲル液滴形成は、拡大された露頭に見られるように、油チャネルの両側のチャネルにおいて生じる。(B)PDMSデバイス製造の概要。略語:PDMS=ポリジメチルシロキサン。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

4. ミクロゲルのマイクロ流体生成

1. ポリマー、架橋剤、およびその他のゲル前駆体成分(すなわち 、ペプチド、グリコサミノグリカン)の所望の濃度を予め決定する。PEG-MAL、RGD、および MethMAL (PEG 骨格) を 10x PBS (pH 1.5) に、MMP-2 架橋剤を 5 μM のビオチン-マレイミドとともに 1x PBS (pH 7.4) に溶解します。
   注:このプロトコールでは、ゲル前駆体溶液は、45.88 mg/mL 4アームPEG-MAR(10 kDa)、0.82 mg/mL RGD、8.06 mg/mL MethMAL、および4.62 mg/mL MMP-2架橋剤(酵素分解性架橋剤)からなる公開製剤³ です。以下に概説する方法は、〜3mLのミクロゲルを得る。
2. 原液5%フルオロサーファクタントをNovecオイルで少なくとも1%に希釈して、6mLの界面活性剤溶液を調製する。この溶液を10mLシリンジに加える。
   注:フッ素化界面活性剤は水と混和しないため、精製工程でのPBS洗浄中に水相へのゲル移行中に容易に除去することができます。
3. シリンジポンプの高さに適した長さのタイゴンチューブを3枚切ります。
4. 長さ約1インチのPEEKチューブを2枚切ります。 図 4A に示すように、2 枚のタイゴン チューブの端に数ミリメートルの PEEK チューブを挿入して、針がタイゴン チューブの入口に穴を開けないようにします。
5. タイゴンチューブの非PEEK端をマイクロ流体デバイスの入口に挿入します。 図 4C に示すように、タイゴン チューブの残りの部分 (端に PEEK チューブがない) をマイクロ流体デバイスの出口に挿入します。
6. 5mLのプラスチックシリンジに少なくとも3mLのオイルを加え、25G針に取り付けます。タイゴンの入口の1つにあるPEEKチューブに針を慎重に挿入します。チューブとデバイスをオイルで静かに洗い流します。出口から油を円錐形のチューブに集めます。もう一方のタイゴンインレットでオイルフラッシュを繰り返します。
7. シリンジポンプを所望の流量に設定します。
   注: このプロトコルでは、水性流量に 3 mL/h、オイル流量に 6 mL/h を使用します。2つの別々のシリンジポンプを使用する必要があるかもしれません。
8. 界面活性剤を含むシリンジを25Gニードル( 図4A参照)を介してオイルインレットに接続し、マイクロ流体デバイスのチューブとオイルチャネルをプライムするのに十分なオイルを静かに分配します。
9. 装置とオイルインレットがセットアップされたら、ゲル前駆体を含む新しい5 mLシリンジに0.5 mLのオイルを追加します。この少量のオイルの目的は、運転の終わりに向かってマイクロフイリディック装置を通して前駆体溶液を洗い流すのを助けることです。
10. 円錐管内で、1.5 mLのPEG骨格溶液と1.5 mLの架橋剤溶液を組み合わせる。ボルテックスを30秒間行い、合わせたゲル前駆体溶液を5mLシリンジに素早く移した。
11. ゲル前駆体溶液を含むシリンジを25G針を介して水性入口に接続します。チューブと水性チャネルをプライムするのに十分な溶液を静かに分配します。
12. シリンジをそれぞれのシリンジポンプにクランプし、 実行 を押します( 図4Bを参照)。水性チャネルとオイルチャネルの両方を流れる液体があることを確認します。
    注:PDMSデバイス内のミクロゲル形成を視覚化するには、顕微鏡を使用することをお勧めします。
13. チャンネルから均一なサイズのパーティクルを探します( 図4D参照)。出口からミクロゲルを円錐形のチューブに集めます。

図4:マイクロ流体のセットアップ (A)PEEKチューブ(上部)とタイゴンチューブをシリンジの25G針(下部)に接続する方法の描写。(B)シリンジポンプ、チューブ、デバイス、および顕微鏡によるマイクロ流体セットアップ。(C)2つの入口(水性および油)と1つの出口を有するマイクロ流体装置セットアップの画像。(d)マイクロ流体装置の概略図およびステップ乳化装置におけるチャネルから予想されるミクロゲル形成の代表的な明視野画像。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

5. ミクロゲルの精製・殺菌

1. ゲル化が完了したら(ゲル化速度論特性評価における貯蔵弾性率プラトーまでの時間として決定)、ピペットを使用してチューブの底部から油相を慎重に除去します( 図5参照)。これをフッ素化廃棄物用の適切な廃棄物容器に預けてください。
   注:ゲル化時間は、有機可溶性塩基(例えば、トリエチルアミン)を収集管に添加することによって促進することができるが、強塩基を添加すると未反応のマレイミドが加水分解される可能性があることに注意することが重要です。ゲル化後に過剰なマレイミドを介してミクロゲルを官能化したい場合は、トリエチルアミンの添加をスキップする。
2. 1:1の比率でミクロゲル収集管にさらに油を加える。収集チューブを静かに反転させて混合します。渦を巻かないでください。
3. 集塊チューブを約5分間沈降させて、相を分離させます。下部の油相と上部の水相(ミクロゲル)を探します( 図5参照)。
4. オイル洗浄を少なくとも2倍以上繰り返します。
5. ゲルに1:1の比率でオイルを追加し、ゲルに4:1のPBSの比率で1x PBSを追加します。反転して数回混ぜる。層を分離するには、チューブを約 2,000 x g で約 30 秒間遠心分離します。チューブの下部に油相、中央にゲル、上部にPBSがあるかどうかを確認します( 図5参照)。
6. 油相をピペットで取り出し、廃容器に捨てる。
   メモ: PBS を取り外さないでください。元の収集チューブが 15 mL の場合は、より大きな円錐形チューブを使用して洗浄を続行します。
7. オイルとPBSを繰り返すと、さらに2倍洗浄されます。 図5に示すように、最終洗浄によって不透明から透明に移行するゲルを探し、界面活性剤が除去され、ゲルがPBS相にあることを示す。
8. すべてのオイルを取り除きます。円錐管からPBSを取り外さないでください。
9. 化学ヒュームフードで、ガラスピペットを使用して、PBSに等量でヘキサンをチューブに加えます。円錐形のチューブを30秒間、または完全に混合するまで渦巻きます。4,696 x g で 5 分間遠心分離します。
10. 分離後、最上層にヘキサン、中央にPBS、下部にゲルを探します( 図5参照)。ヘキサン層を取り出し、有機廃棄物用の容器に捨てる。PBSを吸引します。
11. ヘキサンとPBSで少なくとも2倍以上、またはゲルがほぼ半透明に見えるまで洗浄を繰り返します( 図5参照)。残りのヘキサンが除去されるように、PBS 1xでゲルを1倍以上洗浄する。4,696 x g で 5 分間遠心分離します。PBS層を吸引します。ゲルペレットを乱さないように注意してください。
    1. ミクロゲル中の未反応のマレイミドをキャップまたはクエンチするには、1x PBS中のN-アセチル-L-システインの100 mM溶液を調製し、この溶液をゲルに加える。チューブ回転子上に37°Cで一晩置き、続いてPBSで何度も洗浄を行い、未反応のN-アセチル-L-システインを除去した。
    2. 長期保存(最大1年)の場合は、ミクロゲルを70%IPAに再懸濁し、4°Cで保存して、ミクロゲル上の細菌の増殖を防ぎます。
    3. ミクロゲルを滅菌するには、バイオセーフティフードに70%IPAを4:1 v/v比でゲルに加えます。チューブを30秒間ボルテックスし、次いで4,696 × g で5分間遠心分離する。バイオセーフティフード内のゲルペレットからIPA上清を吸引する。さらに2倍のIPA洗浄を行い、続いて滅菌1x PBSで3倍の洗浄を行います。
       注:細胞または動物と一緒にゲルを使用する前に、すべてのIPAを除去する必要があります。

図5:ミクロゲル精製手順の概要。 略語:PBS=リン酸緩衝生理食塩水;IPA=イソプロピルアルコール。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

6. ミクロゲルサイズ特性評価

注:サイズを決定する前に、ミクロゲル粒子を37°Cで一晩1x PBS中で平衡化させて最終直径まで膨潤させることをお勧めします。

1. ゲル粒子を画像化する。
   1. MAPゲルを4,696 × g で5分間スピンダウンし、上清を吸引します。
   2. 正置換ピペットを使用して、ゲルペレットから5μLのミクロゲルを取り出し、微量遠心管内のPBS1mLに希釈する(1:200希釈)。必要に応じてこの希釈率を調整します。
      注:ゲル前駆体溶液の製剤化中に、5 μMのビオチン-マレイミドを添加し、フルオロフォアでミクロゲルを標識する代わりに使用することができます。この場合、ストレプトアビジン-フルオロフォアを1:300希釈(1mg/mLストックから)で添加することができます。イメージングの前に、ストレプトアビジンとのインキュベーションを少なくとも15分間許可します。
   3. 正置換ピペットを用いて、100 μLの希釈ミクロゲルを透明な96ウェルプレートのウェルに移す。
   4. 広視野顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して、10倍の対物レンズでミクロゲルを視覚化します。分析のためにミクロゲルの画像を取得します。
   5. ミクロゲルの代表的な共焦点画像については 、図6 を参照されたい。
2. ImageJ によるパーティクルのサイジング
   1. 顕微鏡から画像ファイルをImageJで開きます。
   2. [|の分析] を選択します。スケールを設定し、顕微鏡の対物レンズに応じて画像スケールを設定します。
   3. 画像|を選択タイプ|8 ビット。
   4. 画像|を選択|の調整しきい値を選択し、ドロップダウンボックスから「大津」自動しきい値オプションを選択します。
   5. [分析]|をクリックします。「測定値」を設定し、「フェレの直径」を選択し、「しきい値に限定」を選択します。
   6. [分析]|をクリックします。パーティクルを分析し、ミクロゲルに期待される領域サイズ範囲(ピクセル^2単位)を入力します(小さな破片を分析から除外するため)。円形度を 0.75-1.00 に変更し、[|を表示] を選択します。アウトライン。「表示結果」と「エッジで除外」を確認します。
      メモ: 円形度形状フィルターは、不正確な直径測定をもたらす可能性のある画像境界上のミクロゲルを除外します。
   7. パーティクルの 分析 モジュールを実行します。
   8. 出力 (各粒子のフェレットの直径) を待ち、これらの結果をスプレッドシートにエクスポートします。
   9. このプロトコルでは、多分散度指数(PDI)を計算して、ミクロゲルサイズにおける不均一性を決定する。少なくとも 100 個のミクロゲルを分析して集団を定義する: PDI 範囲 1.00 ~ 1.05 は単分散集団を定義し、PDI が 1.05 より大きい場合は多分散集団を定義します。式 (2)、式 (3)、および式 (4) を使用して、以下に説明するように PDI を計算します。
      (2)
      (3)
      (4)

(A)ミクロゲル集団Aの蛍光共焦点画像、(B)閾値ミクロゲルの画像、および(C)ImageJ分析後の粒子輪郭。(D)ミクロゲル集団Bの蛍光共焦点像および(E)ミクロゲルの透過光像(ミクロゲルはほぼ半透明である)。(F)このプロトコルで概説されているImageJ分析からの代表的な結果の描写。両方のミクロゲル集団は、比較的単分散のPDIを有する。ミクロゲルの両方の集団を、3mL/hの水性流速および6mL/hの油流速で合成した。しかしながら、ミクロゲルサイズの違いは、マイクロ流体デバイスステップサイズの違いによるものである。例えば、ミクロゲル集団Aは、チャネルステップサイズ11μmのマイクロ流体デバイスで合成し、ミクロゲル集団Bは、ステップサイズ40μmのデバイスで合成した。スケールバー = 100 μm。略語: PDI = 多分散度指数。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

微多孔性アニール粒子(MAP)足場アニール

1. 2 mM リチウムフェニル-2,4,6-トリメチルベンゾイルホスフィネート(LAP)の原液を1x PBS(pH 7.4)中に作成します。
2. LAP 原液をゲル体積に相当する 1x PBS の容量で 0.2 mM に希釈します。LAP光開始剤を細胞研究または動物実験に使用する場合は、使用前に必ず溶液を滅菌してください。
3. MAPゲルを4,696 × g で5分間スピンダウンし、上清を吸引する。
4. 正置換ピペットを使用して、所望の体積のゲルを微量遠心チューブに移す。
5. 0.2 mM LAP を 1:1 の体積比でゲルに加えます (最終 LAP 濃度は 0.1 mM)。
6. 混合物をボルテックスし、暗闇の中で少なくとも15分間インキュベートする。
7. 混合物を18,000 × g で5分間遠心分離し、ゲルをペレット化する。
8. ゲルペレットから上清を慎重に取り除きます。
9. MAPゲルを正置換ピペットで標的位置に移す。
10. 集束光(365nm、8.66mW/^cm2)をサンプルに113秒間照射し、足場をアニールします。
    注:113秒のアニーリング時間は、0.1mM¹⁴のLAP濃度に対して以前に公開されたように最適化されていますが、異なる光開始剤濃度に対して追加の最適化が必要な場合があります。

図7:MAP足場焼鈍(A)MAP足場焼鈍の概略図。光開始剤および光に曝露されると、MethMALマクロマー上のメタクリルアミド官能基は、ミクロゲルの表面を互いに結合するクリック光重合反応を受ける。(B)MAPミクロゲル(緑色)を3Dパック状にアニールし、細孔内にデキストラン(赤色)をアニールした2光子顕微鏡画像の3Dレンダリング(Imaris)の描写。(C)蛍光70kDaデキストラン(赤色)で灌流されたMAP足場の空隙率を示す2光子顕微鏡画像の3Dレンダリング(イマリス)の描写。スケールバー=(B)100μm、(C)70μm。略語:MAP=微多孔性アニール粒子;MethMAL = カスタムアニーリングマクロマー。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

結果

このプロトコルの目的は、MAPスキャフォールドで使用されるミクロゲルビルディングブロックを合成するために必要なすべてのステップを概説することです。MethMALアニーリングマクロマーは、非常に選択的かつ効率的であり、複数のポリマー主鎖¹⁴と適合性がある。高いアニーリング効率を確保するためには、20kDaPEG-マレイミドの少なくとも67%〜75%がメタクリルアミド官能基で修飾されていることが重要です。修飾パーセントは、図1に示すように、1H-NMRスペクトルピークを分析することによって最も容易に決定することができる。粘度計によって決定されるゲル化速度論は、各ゲル製剤について考慮すべき重要な測定基準である。このプロトコルは、ミクロゲルゲル化のためにチオール官能化架橋剤と効率的に反応するMAL基を有するPEG骨格からなるゲル前駆体溶液を使用する。しかしながら、多くのヒドロゲル化学は、本明細書に記載されるハイスループットマイクロ流体法を介してミクロゲルを作製するために使用することができる。ゲル化の開始までの時間は、マイクロ流体ミクロゲル生成の持続時間に関する洞察を提供する。ゲル化を開始できるゲル前駆体pHを30分(図2)から2時間の間で選択することをお勧めします。

ゲル化時間が速すぎると、ゲル前駆体溶液はマイクロ流体デバイス内で重合し始め、チャネルを詰まらせます。さらに、チオル化リガンド濃度(RGDなど)の変化は、ゲル化中のネットワーク形成に影響を与える可能性があり、製剤を調整することによって考慮する必要があるかもしれないことに注意することが重要です。マイクロ流体デバイスの製造手順は面倒な作業ですが、正常に接着されたデバイスの代表的な結果を図3に示します。このプロトコルは、de Rutte et ^al.13の設計から適応された高スループット、並列化、ステップ乳化マイクロ流体デバイスを使用し、シリコンウェーハ製造はマイクロ流体技術会社に委託されました。ただし、このプロトコルで概説されている手順は、SU-8シリコンウェーハフォトマスクにエッチングされた任意のデバイス設計で使用できます。フォトマスク上のチャネルのステップサイズは、ミクロゲル粒子のサイズに影響を与えるため、デバイス製造中に最適化する必要があることに注意することが重要です。

マイクロ流体によるミクロゲル生成の流量は、ゲル化時間、所望の粒子サイズ、マイクロ流体デバイス設計などの要因に基づいて、ゲル製剤ごとに最適化する必要があります。ハイスループットデバイスを使用する場合、水相の流量は5 mL/hまで高くなることがあります。 図4B は、このプロトコルで使用されるハイスループットデバイスのセットアップを示しています。デバイスが正しく動作している場合、ミクロゲルの形成は 図4Dに示すものと類似しているはずです。精製前に、ミクロゲルは不透明になります。さまざまなオイル、PBS、およびヘキサン洗浄を完了した後、ゲルは 図5の代表画像のように鮮明に見えるはずです。蛍光色素分子をミクロゲルに組み込む場合、精製物はわずかに着色された色合いを有するかもしれないが、依然として半透明に近いはずである。精製および膨潤後、ミクロゲルのサイズは非常に均一で、 図 6 に示すように 1.00 ~ 1.05 の PDI を持つ必要があります。種々の光開始剤が、MAP足場のフォトアニールに使用され得る。本明細書に記載されるLAPの代替物を使用する場合、先に記載したようにアニーリング動力学を決定しなければならない¹⁴。さらに、光源が光開始剤と対応する限り、様々な光源をフォトアニーリングに用いてもよい。光源を校正して焦点を合わせる必要があります。アニーリング時間および光強度は、ゲル製剤および光開始剤濃度に基づいて最適化される必要があるかもしれない。このプロトコールで概説されているアニーリング方法は、 インビトロ および インビボ研究に 使用することができる。アニーリング後、ミクロゲルは、2光子顕微鏡で可視化できる多孔質足場を形成する(図7B−C)。

ディスカッション

このプロトコルは、微多孔性アニール粒子(MAP)足場のビルディングブロックとして機能するミクロゲルを合成および特徴付けるための方法を記載している。このプロトコルは、ハイスループットマイクロ流体アプローチを使用して大量の均一なミクロゲルを生成するが、これは、フロー集束マイクロフルイディクス1,4,7,9 (高単二性、低収率)、バッチエマルジョン^6,10、およびエレクトロ^{スプレー5,12}などの他の方法では達成できない。 (低単分散性、高収率)。本明細書に記載の方法を用いて、単分散ミクロゲルを、様々な再生医療用途(例えば、細胞送達、創傷治癒)に使用することができるMAP足場での使用のために作製することができる。

このプロトコルの重要なステップは、PDMSマイクロ流体デバイスの作成です。デバイスが正しく作られていない場合、これはミクロゲルの形成と単分散性にマイナスの下流に影響を与える可能性があります。PDMSが硬化する前に、PDMSにアーチファクト(気泡、ほこり)が入らないようにすることが重要です。これをできるだけ軽減するには、テープを使用してほこりを取り除き、デバイスをほこりのない容器に保管し、可能であればほこりのないフードで作業する必要があります。また、表面処理で最良の結果を得るために、デバイスを60°Cで保管することも推奨されます。

PDMS装置を注ぐ場合、生検パンチの長さとほぼ等しいかそれ以下の均一な厚さを維持することが重要です。装置が厚すぎると、生検パンチは最後まで貫通することができません。また、生検パンチでパンチしたり、チューブを挿入したりしている間に、PDMSデバイスの入口/出口を引き裂かないことも重要です。PDMSデバイスの裂け目は、入口/出口からの漏れを引き起こし、ゲル前駆体溶液の損失を引き起こす可能性があります。PDMSデバイスに漏れがある場合、最善の解決策は、できるだけ早く新しいデバイスと交換することです。

装置をプラズマ処理する場合、純酸素の使用と30秒間のプラズマ処理は、PDMSをスライドガラスに接着するための最良の結果をもたらしました。デバイスが正しく接着しない場合(つまり、プラズマ処理後にPDMSをスライドガラスから持ち上げることができる場合)、プラズマ処理器が正しく動作していること、およびデバイスとスライドが完全に洗浄されていることを再確認する必要があります。また、正しいシラン表面処理を使用することも重要であり、最良の結果を得るには、PDMSデバイスを使用前に直接表面処理する必要があります。化学蒸着などの他の表面処理方法も使用することができる。

もう1つの重要なステップは、PDMSマイクロ流体デバイスを使用してマイクロゲル形成に正しく使用することです。少なくとも2:1の流量比(このプロトコルは6mL/hのオイル流量と3mL/hの水性流量を使用します)を使用することをお勧めしますが、これは所望のミクロゲルサイズを達成するために調整することができます。ミクロゲル前駆体溶液のpHはまた、装置の目詰まりを防止するために最適化するための重要な測定基準でもある。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)は、マイケル型付加化学におけるチオレート形成を促進し、このプロトコルで使用されるPBS濃度は、マイクロ流体デバイスにおけるミクロゲルゲル化に最良の結果をもたらす。シリンジポンプが開始されると、マイクロ流体チャネルに気泡が存在する可能性がありますが、これは数分後に平衡化するはずです。顕微鏡でミクロゲル形成を監視することをお勧めします。流れがこのビデオのように似ていない場合、および/または大きな粒子を生成するチャネルがいくつかある場合は、表面処理ステップの問題が原因である可能性があります。最善の解決策は、デバイスを新しく表面処理されたものに交換することです。

ミクロゲルが合体しているように見える場合、これはフッ素系界面活性剤の濃度が不十分であることが原因である可能性があります。推奨される解決策は、油相中の界面活性剤の重量%を増加させることである。しかしながら、高濃度の界面活性剤を使用することに対する1つの制限は、精製工程中に除去することがより困難であり得ることである。マイクロ流体デバイスを一度だけ使用することをお勧めしますが、使用直後にNovecオイルで洗い流して、デバイス内でゲル化してチャネルを詰まらせる可能性のある水溶液を除去すると、デバイスを再利用できます。1つのマイクロ流体デバイスは高スループット量のマイクロゲル(mL/h)を生成できますが、この生産速度は、複数のマイクロ流体デバイスを並行して使用することによってスケーリングできます。

MAP足場アセンブリのアニーリング工程は、ラジカル重合の光活性化光開始剤の使用に依存しており、光開始剤は、所望の用途に基づいて選択することができる。例えば、LAP光開始剤は、長波UV光を使用する場合に速いアニーリング時間(<30秒)を有し、これはインビトロでの細胞生存率への影響を最小限に抑えます¹⁴。しかしながら、この波長は組織¹⁶によって高度に吸収され、インビトロほど高いアニーリング有効性をインビボで有さない可能性がある。

Eosin Yは、可視波長(505nm)によって活性化される別の光開始剤であり、組織へのより深い浸透を有し、これはMAP足場が組織の下でアニーリングされる能力を高める。しかしながら、Eosin Yアニーリングに必要な長い光曝露時間は、フリーラジカルへの細胞曝露を延長し、インビトロでの細胞生存率に影響を与える可能性がある¹⁴。これらの方法をハイスループットで均一性の高いミクロゲルビルディングブロックを生成することで、MAP足場に重点を置いた研究が加速し、再生医療用の注射用多孔質材料の分野における知識が進歩します。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-aminoethanethiol hydrochloride	Acros Organics	AC153770250	For MethMal Synthesis MW: 113.61 Da
35 mm plate rotor	HAAKE	P35/Ti	Geometry for HAAKE viscometer
4-arm PEG-Maleimide (10 kDa)	NOF AMERICA Corporation	SUNBRIGHT PTE-100MA	For microgel precursor solution
4-arm PEG-Maleimide (20 kDa)	NOF AMERICA Corporation	SUNBRIGHT PTE-200MA	For MethMal Synthesis Molecular weight specific to each batch
BD Syringe with Luer-Lok Tips	Becton Dickinson		Disposable plastic syringes
Biopsy punch	Mitex	MLTX33-31A-P/25	1.5 mm diameter
Chloroform-d	Acros Organics	AC209561000	For MethMal Synthesis
Collimated LED Light Source	ThorLabs	M365LP1-C1	365 nm
Culture dish (15 cm)	Corning	CLS430599	150 mm x 25 mm
DMTMM(4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methyl-morpholinium chloride)	Oakwood Chemical	151882	For MethMal Synthesis MW: 276.72 Da
Fluorosurfactant	Ran Technologies	008-Flurosurfactant-5wtH-200G	5 weight percent of 008-Flurosurfactant in HFE7500
FreeZone Triad Freeze Dry System	Labconco	7400000 Series	For MethMal Synthesis Lyophilizer
Glass slides	Fisher Scientific	12-550-A3	Plain glass slides, uncoated
HAAKE Rheowin viscometer	HAAKE
ImageJ			version 1.8.0_172
KDS Legato 210 Dual Prong Syringe Pump	Kd Scientific
LED Driver	ThorLabs	DC2200
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)	Sigma-Aldrich	900889	Photoinitiator
Methacrylic Acid	Sigma Aldrich	155721	For MethMal Synthesis MW: 86.09 Da Density: 1.015g/mL
Microfluidic device SU8-Si master wafer	FlowJem	N/A	Custom-made, with silanization
MMP-2 degradable crosslinker	FlowJem		Sequence: Ac-GCGPQGIAGQDGCG-NH2
Needles (25 G, beveled)	BD	305122	Length: 15.88 mm Gauge: 0.5 mm
Novec 7500	3M	7100025016	Fluorinated oil
Oxygen	Praxair	UN1072	Compressed
Peek tubing	Trajan Scientific	03-350-523	1/32" Outer Diameter; 0.02" Inner Diameter; 10' Length
PFOCTS (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane)	Sigma-Aldrich	448931	For surface treatment
Phosphate Buffered Saline	Fisher BioReagants	BP3994	Diluted to 1x in ultrapure water, pH = 7.4
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-001-HP
Razor blade	Fisher Scientific	12-640
RGD cell adhesive peptide	WatsonBio Sciences		Sequence: Ac-RGDSPGGC-NH2
Rheowin software	HAAKE		Software compatible with HAAKE viscometer
Scalpel blade	Bard-Parker	371210	Size: #10
Scalpel handle	Bard-Parker	371030	Size: #3
Sodium Chloride	Fisher BioReagents	BP358-1	For MethMal Synthesis MW: 58.44 Da
Sylgard 184 silicone elastomer kit	DOW Chemical	2065622	Base and curing agent
Triethylamine	Fisher Scientific	O4884-100	For MethMal Synthesis MW: 101.19 Da Density: 0.73g/mL
Tygon tubing	Saint Gobain Performance Plastics	AAD04103	ID: 0.51 mm OD: 1.52 mm
Varian Inova 500 Spectrometer	Varian		NMR Located in the UVA Biomolecular Magnetic Resonance Facility