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要約

ここでは、シングルセルシーケンシングのためのティラピア腸の高品質のシングルセル懸濁液の調製を実証します。

要約

ナイルティラピアは、世界で最も一般的に養殖されている淡水魚種の1つであり、養殖魚の研究に広く使用されている研究モデルです。高品質のシングルセル懸濁液の調製は、シングルセルRNAやゲノムシーケンシングなどのシングルセルレベルの研究に不可欠です。ただし、養殖魚種、特にティラピアの腸については、すぐに使用できるプロトコルはありません。有効な解離酵素は、組織の種類によって異なります。したがって、適切な酵素または酵素の組み合わせを選択して組織解離プロトコルを最適化し、最小限の損傷で十分な生細胞を得ることが不可欠である。この研究は、ナイルティラピア腸から高品質の単一細胞懸濁液を調製するための最適化されたプロトコルを示しています コラゲナーゼ/ディスパーゼの酵素の組み合わせ。この組み合わせは、ウシ血清アルブミンとDNaseを利用して解離に非常に効果的であり、消化後の細胞凝集を低減します。細胞出力は、90%の細胞生存率と高い細胞濃度で、シングルセルシーケンシングの要件を満たしています。このプロトコルは、他の魚種の腸から単細胞懸濁液を調製するように変更することもできる。この研究は、効率的な参照プロトコルを提供し、養殖魚種の単一細胞懸濁液の調製における追加の試験の必要性を減らします。

概要

細胞は生物の基本単位です。バルク組織研究と比較して、単一細胞レベルの研究は細胞の不均一性を反映し、より高解像度の情報を提供することができます1。近年、研究者は、哺乳類、ゼブラフィッシュ、およびその他のモデル生物の単一細胞レベルでのゲノム、トランスクリプトーム、エピゲノム、またはマルチオミクス研究にシングルセルシーケンシング技術を適用し、大きなブレークスルーを報告しています2,3,4,5,6,7 .ほとんどの研究はモデル生物に焦点を当てていますが、経済的な魚種におけるシングルセルシーケンシングのための参照プロトコルまたは市販の解離キットはほとんどなく、水産養殖研究におけるシングルセルシーケンシングの適用が制限されています。したがって、高い細胞生存率と核酸完全性を備えた高品質の単一細胞懸濁液を生成する組織解離プロトコルの開発が重要です。

適切な酵素または酵素の組み合わせで組織解離プロトコルを最適化して、最小限の損傷で十分な生細胞を得ることが不可欠です。組織解離に最も効果的な酵素は、組織の種類によって異なります。哺乳類では、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、トリプシン、パパイン、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、リベラーゼ、アキュターゼ、およびTrypLE8,9を含む、哺乳類の固形組織用の単一細胞懸濁液を調製するためにいくつかの酵素が使用されてきました。機械的破壊と組み合わせたトリプシン消化は、魚の細胞培養のために組織を解離するために一般的に使用されてきました10、11、12、13、14。トリプシンはまた、ラット腸15およびゼブラフィッシュ鰓組織16における組織解離のための消化カクテルに使用または添加されている。ただし、いくつかの理由から、トリプシンはシングルセルシーケンシングに最適なオプションではありません。トリプシン単独では通常、組織解離には効果がありません。さらに、トリプシンはDNA鎖切断17,18およびRNA分解19を誘導する。

パパインは、細胞間のタイトジャンクションを構成するタンパク質を分解します。哺乳類の神経および平滑筋細胞において、パパインは他のプロテアーゼよりも効率的で破壊が少ない20,21。しかしながら、トリプシンと同様に、パパインは酵素消化中に起こる細胞溶解のために細胞の遊離DNA誘導凝集をもたらす9。エラスターゼは、皮膚、肺、靭帯、腱、血管組織に通常見られるエラスチンを分解します22。肺組織8を解離させるために、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、またはトリプシンと組み合わせて使用 されることがよくあります。ヒアルロニダーゼはヒアルロン酸のグリコシド結合を切断し、さまざまな結合組織や皮膚の細胞外マトリックスの消化に寄与します9,23。

一般に、コラゲナーゼとディスパーゼは細胞外マトリックス分解のための良い選択肢です。それらは、ヒト、マウス、およびゼブラフィッシュの腸の解離に使用されています24、25、26、27。コラゲナーゼはコラーゲン中のペプチド結合を破壊し、細胞外マトリックスの消化を促進し、細胞を懸濁液に放出するため、コラゲナーゼは、肝臓28,29、脾臓30、膵臓31、および腸25を含むヒトおよびマウスの固体組織の解離によく使用されます.ディスパーゼは、非極性アミノ酸残基のN末端ペプチド結合を加水分解するプロテアーゼであり、コラゲナーゼよりもマイルドです。フィブロネクチン、IV型コラーゲン、および程度は低いがI型コラーゲンなどの細胞外マトリックス成分を、細胞間接合部に影響を与えることなく切断します。ディスパーゼは、腸25,32、脳33、肝臓34などの組織解離のために、別々にまたは他の酵素と共に使用される。さらに、リベラーゼ、アキュターゼ、trypLEなどの市販の消化カクテルも、特に皮膚、肝臓、腎臓の固形組織解離の優れた代替品です8,9。

ナイルティラピア(オレオクロミスニロティカス)は、スズキ目シクリッド科に属します。熱帯および亜熱帯地域で最も養殖されている淡水魚種の1つであり、2022年の年間生産量は450万トンです35。これは、十分に注釈が付けられたゲノムを持つ、最もよく研究されている養殖魚種の1つです。ナイルティラピアは、その短い世代時間、飼育の容易さ、および幅広い飼育環境への適応性により、養殖魚種にとって理想的な研究モデルです。腸は栄養の消化吸収、代謝、粘膜免疫の器官であるため、研究上の大きな関心を集めています。腸は微生物集団の生息地であり、必須の免疫組織である36。マクロファージ、B細胞、顆粒球、T細胞など、さまざまな種類の免疫細胞が存在するため、免疫学的に活性です。

現在の研究では、養殖魚種の単一細胞レベルの研究を容易にするために、ナイルティラピア腸から高品質の単一細胞懸濁液を調製するためのプロトコルを開発しました。これらの組織特異的酵素の特性と予備作業によると、コラゲナーゼ/ディスパーゼはティラピア腸組織の解離に適しています。単一細胞懸濁液を調製する際に考慮すべき最後の酵素タイプはDNase-Iであり、これはアポトーシス経路9を開始せずに酵素消化中に死細胞溶解によって放出される遊離DNAを分解することによって細胞凝集を防ぎ、生 細胞収量を増加させる36。さらに、ウシ血清アルブミン(BSA)を洗浄バッファーに添加して、細胞の凝集を減らし、細胞の生存率を向上させます。いくつかの試薬会社は、BSAを酵素安定剤として説明しています。PBS(リン酸緩衝生理食塩水)への0.04%-1%BSAの添加は、副作用のないシングルセルシーケンシング懸濁液を調製するための洗浄液の開発に使用されています38。低比率のBSAを添加することで、細胞の生存率を維持し、細胞溶解による遊離DNAによる細胞の凝集を回避できる可能性があります。このプロトコルは、他の養殖魚種の腸からの細胞解離プロトコルを開発するための貴重なリファレンスも提供できます。

プロトコル

この研究中のすべての動物プロトコルは、海南大学施設動物管理および使用委員会によって承認されました(プロトコル番号:HNUAUCC-2022-00063;承認日:2022-03-03)。この実験で使用した機器と消耗品のリストは、 材料表にあります。現在のプロトコルの概要を 図1に示します。

1.魚の準備

  1. 信頼できる情報源から平均体重100 gの生後6か月のナイルティラピアを入手してください。病気の兆候がない魚を選択してください。
  2. 次のステップに進む前に、魚の餌やりを24時間停止します。
    注: 魚の絶食は腸の内容物の量を減らし、腸の部分の準備を容易にします。
  3. 魚をよく通気した滅菌水で15分間すすぎ、体表面のゆるく結合したバクテリアを洗い流します。
  4. すべての動きが止まるまで、300 mg / Lのトリカインメタンスルホン酸塩(MS-222)で約10分間魚を安楽死させます。

2. 試薬調製

  1. 0.08%BSA-ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(BSA-DPBS、細胞のすすぎと再懸濁用)を調製します。0.08 g の BSA (0.8% w/v) を 100 mL の 1x DPBS に溶解します。4°Cで保存し、使用時は氷上で予冷してください。
    注:BSAの添加は、細胞の凝集を最小限に抑えるのに役立ちます。BSA比は、細胞の凝集条件に応じて0.04%から1%まで高めることができます。
  2. 酵素細胞解離試薬を調製する。
    1. コラゲナーゼ/ディスパーゼを1x PBSで最終濃度1 mg/mL(0.1 U/mLコラゲナーゼおよび0.8 U/mLディスパーゼ)に希釈します。DPBS ではなく PBS が使用されていることを確認します。
      注:PBSは、酵素が適切に機能するために必要なカルシウムイオンを提供します。DPBSはCa2+/Mg2+を含まないため、このステップでは使用しないでください。さらに、コラゲナーゼタイプIが現在のプロトコルで使用されています。
    2. 滅菌した0.22 μmメンブレンフィルターで希釈液をろ過します。
    3. 95%容量のコラゲナーゼ/ディスパーゼ溶液と5%容量のウシ胎児血清(FBS)で構成される細胞解離試薬を調製します。
      注:解離試薬は、使用するたびに新鮮にする必要があります。5%FBSを使用すると、消化中の細胞生存率を維持するのに役立ちます。
  3. トリパンブルー溶液を調製する。
    1. 4°Cの冷蔵庫からトリパンブルー溶液を取り出し、沈殿を防ぐために使用前に15〜20°Cで数分間保管してください。
    2. 滅菌した0.22 μmメンブレンで溶液をろ過します。

3.機器の準備

  1. 使用前に冷蔵遠心分離機を4°Cに予冷してください。
  2. 滅菌RNaseフリーの1.5 mL遠心チューブ、50 mLコニカルチューブ、ワイドボアガラスピペットとチップ、メンブレンフィルター、セルストレーナー、およびすべての低保持チューブとチップを入手してください。
  3. オートクレーブガラスピペットと鉗子、はさみ、メスなどの解剖ツールをRNase除去溶液で前処理して、単一細胞RNA-seqに対するRNaseの悪影響を防ぎます。

4.組織解剖と細胞解離

  1. 安楽死させた魚を氷の上に置いて解剖します。無菌的に、腸の中央部の3〜4 cmを収集し、できるだけ多くの脂肪と腸間膜を切除します。腸の表面に付着した脂肪と弾力性と可鍛性の透明な粘膜の層を鉗子で慎重に取り除きます。
    注:脂肪と腸間膜は腸の外面に付着しています。
  2. 解離プロトコルへの悪影響を防ぐために、できるだけ多くの脂肪を取り除きます。注射器を使用して、滅菌氷冷PBSで断片を数回穏やかにすすぎ、腸の内容物と粘液を洗い流します。乱暴な取り扱いは避けてください。
  3. 腸のセグメントを小片に解剖し、1 mLの氷冷PBSで満たされた1.5 mLチューブに移します。
  4. 300 × g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を穏やかに取り除き、氷冷した0.08%BSA-DPBS1 mLと交換します。ガラスピペットを使用して穏やかな吸引によって組織片を再懸濁します。この手順を 2 回繰り返します。
  5. 上清を除去し、1 mLの酵素解離試薬(950 μLのコラゲナーゼ/ディスパーゼ溶液および50 μLのFBS)を用いて組織断片を37°Cの水浴中で30〜60分間消化します。
    1. さらに、サンプルがシングルセルRNAシーケンシング用に調製されている場合は、5 μLのRNase阻害剤(ストック溶液中に40 U / μL)を解離試薬に追加します。
      注:コラゲナーゼ/ディスパーゼミックスの最終濃度は1 mg/mLで、0.1 U/mLのコラゲナーゼと0.8 U/mLのディスパーゼを含みます。
  6. 30〜60分の水浴中に5分間隔でチューブを手動で反転させます。
    注:正確なインキュベーション時間は、使用する組織によって異なります。バルク組織が見られなくなるまで、顕微鏡で解離の進行状況を確認します。10 μLの細胞懸濁液をピペットでスライドガラス上に置き、顕微鏡で調べます。細胞が完全に解離していない場合は、消化時間を長くします。
  7. チューブを300 × g で4°Cで5分間スピンダウンし、ワイドボアチップを使用して酵素細胞解離試薬を静かに除去します。氷冷した0.08%BSA-DPBSを1 mL加え、ワイドボアガラスピペットを使用して細胞を静かに上下に1分間ピペットで移動します。
    1. この手順を 2 回繰り返します。
      注:ピペッティングの上下は、細胞の破壊を防ぐために、ワイドボアで低保持のチップを使用して慎重に行う必要があります。
  8. 40 μmのセルストレーナーを0.08%BSA-DPBSで事前に濡らし、50 mLのコニカルチューブに入れます。細胞懸濁液をストレーナーに通します。さらに200 μLのDPBSでタップしてすすぎ、チューブの底に懸濁液を回収します。
  9. 懸濁液を1.5 mLチューブに移します。5 μLのDNase I(1 U/μL)を加え、15-20°Cで15分間インキュベートします。 300 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
  10. 上清を除去し、細胞ペレットを400 μLの氷冷DPBS(Ca2+/Mg2+ フリー)に再懸濁します。ワイドボアチップでゆっくりと上下にピペットで動かし、細胞を混合します。この手順を 2 回繰り返します。

5.染色と顕微鏡検査

  1. 染色には、細胞懸濁液を0.4%トリパンブルー溶液と1:1の比率で混合します。室温で3分間インキュベートします。
  2. 5〜10μLの混合物を血球計算盤に加え、顕微鏡で調べます。
    注:生細胞は染色されていない細胞質を持ち、死んだ細胞は青い細胞質を持ちます(図2)。
  3. 顕微鏡下で3つの異なるフィールドで生細胞と死細胞を数えます。生存細胞の数をフィールド内の細胞の総数で割ることにより、細胞生存率を計算します。
    注:細胞生存率は85%以上でなければならず、細胞濃度は1 x 105-1 x10 7 / mL以上でなければなりません。細胞懸濁液の背景は、塊、破片、または不純物がなく、きれいでなければなりません。

結果

このプロトコルでは、シングルセルシーケンシング用のナイルティラピア腸の高品質のシングルセル懸濁液の調製について説明します(図1)。この研究は、コラゲナーゼ/ディスパーゼミックスが良好な解離効果を有し、腸組織に対して穏やかであることを示しています。最適な消化酵素の選択は、高品質の単一細胞懸濁液を調製するために不可欠です。予備作業では、一...

ディスカッション

このプロトコルは、ナイルティラピア腸の高品質の単一細胞懸濁液の調製を記載しています。解離する前に、特に脂肪の多い肉食性の魚の腸では、腸からの脂肪と腸間膜の除去が必要です。腸の内容物を洗い流すために硬い掻き取りの代わりに注射器を使用すると、細胞への機械的損傷が減少します。細胞の生存率を確保するためには、組織解剖およびすすぎステップの温度を20°C以下に維?...

開示事項

著者は、開示すべき利益相反はありません。

謝辞

著者らは、中国海南省自然科学財団(NO.320QN211)および広東省水生動物疾病管理および健康文化研究基金プログラム(NO. PBEA2021ZD01)からの支援に感謝したい。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22-μm Sterile FilterSolarbio Life SciencesSLGV033RBIt is used to filter and sterilize the enzyme solution.
40-μm Cell StrainerSolarbio Life SciencesF8200Cell Strainer is applied to eliminate undigested tissue pieces.
Bovine serum albumin (BSA)Sigma-AldrichSRE0098Powder; dilute 0.04 g BSA with 100 mL 1× DPBS to prepare 0.04% BSA-DPBS washing bffer. Store at 2 - 8 °C.
Collagenase IISangon BiotechA004202Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
Collagenase/dispaseRoche10269638-001Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
DispaseSigma-AldrichD4818Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
DNase ISigma-AldrichAMPD1DNase I helps reduce cell clumping.
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+/Mg2+-freeSolarbio Life SciencesE607009-0500Store at room temperature.
ElastaseSangon BiotechA600438Dilute with PBS to a final concentration of 0.5 mg/mL.
Fetal bovine serum (FBS)Gibco16000-044Serum, used at volume of 5% in digetstion solution.
Inverted MicroscopeLeicaqTOWER3GIt is used to examine cell viability.
LiberaseRoche5401119001Dilute with PBS to a final concentration of 0.25 mg/mL.
Nile tilpia (Oreochromis niloticus)ProGift Aquaculture Technology Co. Ltd.NAHealthy fish with no disease signs (Mean body weight: 100 g). 
Phosphate-buffered saline (PBS)Solarbio Life SciencesP1020Store at room temperature.
Refrigerated CentrifugeEppendorf5424It is used to spin down the tissue and cell petet.
RNase inhibitorNEBM0314LInhibit RNase activity
Solid-phase RNase-Be-Gone ReagentSangon BiotechB644201-0050It is used to remove the RNase from tools such as dissecting scissors and glass pipettes. Store at room temperature.
Tricaine methanesulfonate (MS-222)Sigma-AldrichE10521For fish euthanasia. 
Trypan BlueInvitrogenC0040It is used for staining dead cells.
TrypsinSangon BiotechE607001Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.

参考文献

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