Препарат одноклеточной суспензии из кишечника нильской тилапии для секвенирования одноклеточных клеток

Резюме

Здесь мы демонстрируем приготовление высококачественной одноклеточной суспензии кишечника тилапии для одноклеточного секвенирования.

Аннотация

Нильская тилапия является одним из наиболее часто культивируемых видов пресноводных рыб во всем мире и является широко используемой исследовательской моделью для изучения аквакультуры рыб. Приготовление высококачественных одноклеточных суспензий имеет важное значение для исследований на уровне одной клетки, таких как одноклеточная РНК или секвенирование генома. Тем не менее, не существует готового к использованию протокола для видов рыб аквакультуры, особенно для кишечника тилапии. Эффективные ферменты диссоциации варьируются в зависимости от типа ткани. Поэтому оптимизация протокола диссоциации тканей путем выбора соответствующего фермента или комбинации ферментов для получения достаточного количества жизнеспособных клеток с минимальным повреждением имеет важное значение. Это исследование иллюстрирует оптимизированный протокол приготовления высококачественной одноклеточной суспензии из кишечника нильской тилапии с комбинацией ферментов коллагеназы / диспазы. Эта комбинация очень эффективна для диссоциации с использованием бычьего сывороточного альбумина и ДНКазы для уменьшения агрегации клеток после пищеварения. Клеточный выход удовлетворяет требованиям к секвенированию отдельных клеток, с 90% жизнеспособностью клеток и высокой концентрацией клеток. Этот протокол также может быть модифицирован для приготовления одноклеточной суспензии из кишечника других видов рыб. Это исследование обеспечивает эффективный эталонный протокол и снижает потребность в дополнительных испытаниях при приготовлении одноклеточных суспензий для видов рыб аквакультуры.

Введение

Клетки являются фундаментальными единицами организмов. По сравнению с исследованиями объемных тканей, исследования на уровне отдельных клеток могут отражать гетерогенность клеток и предоставлять информацию с более высоким разрешением¹. В последние годы исследователи применили технологии секвенирования отдельных клеток для геномных, транскриптомных, эпигеномных или мультиомных исследований на уровне отдельных клеток у млекопитающих, рыбок данио-рерио и других модельных организмов и сообщили о больших прорывах 2,3,4,5,6,7 . В то время как большинство исследований было сосредоточено на модельных организмах, существует несколько справочных протоколов или коммерческих наборов для диссоциации для секвенирования отдельных клеток у хозяйственных видов рыб, что ограничивает применение секвенирования отдельных клеток в исследованиях аквакультуры. Поэтому разработка протоколов диссоциации тканей, которые производят высококачественные одноклеточные суспензии с высокой жизнеспособностью клеток и целостностью нуклеиновых кислот, имеет решающее значение.

Оптимизация протокола диссоциации тканей с помощью соответствующего фермента или комбинации ферментов для получения достаточного количества жизнеспособных клеток с минимальным повреждением имеет важное значение. Наиболее эффективный фермент для диссоциации тканей варьируется в зависимости от типа ткани. У млекопитающих для приготовления одноклеточных суспензий твердых тканей млекопитающих использовалось несколько ферментов, включая коллагеназу, диспазу, трипсин, папаин, эластазу, гиалуронидазу, либеразу, аккутазу и трипЛЕ ^8,9. Переваривание трипсина в сочетании с механическим нарушением обычно используется для диссоциации тканей для культивирования клеток у рыб 10,11,12,13,14. Трипсин также использовался или добавлялся в коктейль пищеварения для диссоциации тканей в кишечнике¹⁵ крыс и жаберной ткани¹⁶ рыбок данио. Однако по ряду причин трипсин не является лучшим вариантом для секвенирования отдельных клеток. Трипсин сам по себе обычно неэффективен для диссоциации тканей. Кроме того, трипсин индуцирует разрывы цепи ДНК ^17,18 и деградацию РНК¹⁹.

Папаин разлагает белки, из которых состоят плотные соединения между клетками. В нервных и гладких мышечных клетках млекопитающих папаин более эффективен и менее разрушителен, чем другие протеазы^20,21. Однако, как и трипсин, папаин приводит к свободной ДНК-индуцированной агрегации клеток из-за лизиса клеток, который происходит во время ферментативного пищеварения⁹. Эластаза расщепляет эластин, который обычно содержится в коже, легких, связках, сухожилиях и сосудистых тканях²². Он часто используется в сочетании с коллагеназой, диспазой или трипсином для диссоциации легочной ткани⁸. Гиалуронидаза расщепляет гликозидные связи гиалуронана, способствуя перевариванию внеклеточного матрикса в различных соединительных тканях и коже ^9,23.

В целом, коллагеназа и диспаза являются хорошими вариантами для разрушения внеклеточного матрикса. Они использовались при диссоциации кишечника человека, мышей и рыбок данио-рерио^24,25,26,27. Коллагеназа разрушает пептидную связь в коллагене, способствует перевариванию внеклеточного матрикса и высвобождает клетки в суспензию, и, таким образом, коллагеназа часто используется для диссоциации твердых тканей человека и мыши, в том числе для печени 28,29, селезенки^30, поджелудочной железы³¹ и кишечника ²⁵. Диспаза представляет собой протеазу, которая гидролизует N-концевые пептидные связи неполярных аминокислотных остатков и мягче, чем коллагеназа. Он расщепляет компоненты внеклеточного матрикса, такие как фибронектин, коллаген IV типа и, в меньшей степени, коллаген I типа, не влияя на межклеточные соединения. Диспаза используется отдельно или с другими ферментами для диссоциации тканей, таких как кишечник^25,32, мозг^33, печень ³⁴ и т. Д. Кроме того, коммерчески доступные коктейли для пищеварения, включая либеразу, аккутазу и trypLE, также являются хорошей альтернативой диссоциации твердых тканей, особенно для кожи, печени и почек ^8,9.

Нильская тилапия (Oreochromis niloticus) относится к семейству цихловых отряда окунеобразных. Это один из самых культивируемых видов пресноводных рыб в тропических и субтропических районах с годовым производством 4,5 миллиона тонн в 2022 году³⁵. Это один из наиболее изученных видов рыб аквакультуры с хорошо аннотированным геномом. Нильская тилапия является идеальной исследовательской моделью для видов рыб аквакультуры из-за ее короткого времени генерации, простоты выращивания и приспособляемости к широкому спектру условий выращивания. Кишечник представляет большой исследовательский интерес, так как является органом питания, пищеварения и всасывания, обмена веществ и иммунитета слизистой оболочки. Кишечник является средой обитания микробных популяций и является важной иммунной тканью³⁶. Он иммунологически активен благодаря наличию многочисленных типов иммунных клеток, включая макрофаги, В-клетки, гранулоциты и Т-клетки.

В текущем исследовании мы разработали протокол приготовления высококачественной одноклеточной суспензии из кишечника нильской тилапии для облегчения исследований на уровне отдельных клеток у видов рыб аквакультуры. В соответствии с характеристиками этих тканеспецифических ферментов и предварительной работой, коллагеназа / диспаза подходит для диссоциации ткани кишечника тилапии. Последним типом фермента, который следует учитывать при приготовлении одноклеточных суспензий, является ДНКаза-I, которая предотвращает агрегацию клеток путем разложения свободной ДНК, высвобождаемой в результате лизиса мертвых клеток во время ферментативного переваривания, без инициирования апоптотических путей⁹ и увеличивает выход живых клеток³⁶. Кроме того, бычий сывороточный альбумин (BSA) добавляется в буфер для промывки, чтобы уменьшить слипание клеток и улучшить жизнеспособность клеток. Несколько компаний-производителей реагентов описывают BSA как стабилизатор ферментов. Добавление 0,04%-1% BSA к PBS (фосфатно-буферный физиологический раствор) было использовано для разработки промывочного раствора для приготовления суспензий одноклеточного секвенирования без побочных эффектов³⁸. Добавление низкого соотношения BSA может помочь сохранить жизнеспособность клеток и избежать свободной ДНК-индуцированной агрегации клеток из-за лизиса клеток. Этот протокол также может служить ценным справочным материалом для разработки протоколов диссоциации клеток из кишечника других видов рыб аквакультуры.

протокол

Все протоколы на животных во время этого исследования были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Хайнаньского университета (номер протокола: HNUAUCC-2022-00063; Дата утверждения: 2022-03-03). Список оборудования и расходных материалов, использованных в этом эксперименте, можно найти в Таблице материалов. Краткое изложение текущего протокола проиллюстрировано на рисунке 1.

1. Подготовка рыбы

1. Получите 6-месячную нильскую тилапию со средней массой тела 100 г из надежного источника. Выбирайте рыбу, на которой нет никаких признаков болезней.
2. Прекратите кормление рыбы за 24 часа, прежде чем переходить к следующему шагу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рыбное голодание уменьшает объем кишечного содержимого и облегчает подготовку кишечных сегментов.
3. Промойте рыбу в хорошо аэрированной стерильной воде в течение 15 минут, чтобы смыть неплотно связанные бактерии с поверхности тела.
4. Усыпьте рыбу 300 мг / л трикаина метансульфоната (MS-222) в течение примерно 10 минут, пока все движения не прекратятся.

2. Приготовление реагентов

1. Приготовьте 0,08% фосфатно-буферный физиологический раствор BSA-Dulbecco (BSA-DPBS, для промывки клеток и ресуспендирования). Растворите 0,08 г BSA (0,8% мас./об.) в 100 мл 1x DPBS. Хранить при температуре 4 °C и предварительно охладить на льду при использовании.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление BSA полезно для минимизации слипания клеток. Коэффициент BSA может быть увеличен с 0,04% до 1% в зависимости от условий слипания клеток.
2. Приготовьте ферментативный реагент для диссоциации клеток.
   1. Разбавьте коллагеназу / диспазу 1x PBS до конечной концентрации 1 мг / мл (0,1 Ед / мл коллагеназы и 0,8 Ед / мл диспазы). Убедитесь, что используется PBS, а не DPBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: PBS обеспечивает ионы кальция, необходимые для правильного функционирования фермента. DPBS не следует использовать на этом этапе, потому что он не содержит Ca 2+/Mg²⁺. Кроме того, в текущем протоколе используется коллагеназа I типа.
   2. Отфильтруйте разбавление через стерильный мембранный фильтр 0,22 мкм.
   3. Приготовьте реагент для диссоциации клеток, состоящий из 95% объема раствора коллагеназы/диспазы и 5% объема эмбриональной бычьей сыворотки (FBS).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диссоциационный реагент следует делать свежим каждый раз, когда он используется. Использование 5% FBS помогает поддерживать жизнеспособность клеток во время пищеварения.
3. Приготовьте раствор трипанового синего.
   1. Возьмите раствор трипанового синего из холодильника с температурой 4 ° C и держите его при температуре 15-20 ° C в течение нескольких минут перед использованием, чтобы предотвратить осаждение.
   2. Раствор фильтруют через стерильную мембрану 0,22 мкм.

3. Подготовка оборудования

1. Перед использованием предварительно охладите охлажденную центрифугу до 4 °C.
2. Приобретите стерильные центрифужные пробирки объемом 1,5 мл без РНКазы, конические пробирки объемом 50 мл, стеклянные пипетки и наконечники с широким отверстием, мембранные фильтры, клеточные сетчатые фильтры и все пробирки и наконечники с низким удержанием.
3. Автоклавные стеклянные пипетки и инструменты для рассечения, включая щипцы, ножницы и скальпели, и предварительно обработайте их раствором для удаления РНКазы, чтобы предотвратить неблагоприятное воздействие РНКазы на секвенирование одноклеточной РНК.

4. Рассечение тканей и диссоциация клеток

1. Положите усыпленную рыбу на лед для вскрытия. Асептически соберите 3-4 см среднего отдела кишечника и иссеките как можно больше жира и брыжейки. Аккуратно удалите жир, прикрепленный к поверхности кишечника, и слой эластичной и податливой прозрачной слизистой оболочки с помощью щипцов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Жир и брыжейка прикрепляются к внешней поверхности кишечника.
2. Удалите как можно больше жира, чтобы предотвратить его неблагоприятное воздействие на протокол диссоциации. С помощью шприца аккуратно промойте фрагменты стерильным ледяным PBS несколько раз, чтобы смыть содержимое кишечника и слизь. Избегайте грубого обращения.
3. Рассеките сегмент кишечника на мелкие кусочки и перенесите их в пробирку объемом 1,5 мл, заполненную 1 мл ледяного PBS.
4. Центрифуга при 300 × г в течение 5 мин при 4 °C. Осторожно удалите надосадочную жидкость и замените ее 1 мл ледяного 0,08% BSA-DPBS. Ресуспендируйте фрагменты ткани путем легкой аспирации с помощью стеклянной пипетки. Повторите этот шаг дважды.
5. Удалите надосадочную жидкость и переварите фрагменты ткани, используя 1 мл реагента ферментативной диссоциации (950 мкл раствора коллагеназы/диспазы и 50 мкл FBS) на водяной бане при 37 °C в течение 30-60 мин.
   1. Дополнительно добавляют 5 мкл ингибитора РНКазы (40 ЕД/мкл в исходном растворе) к диссоциативному реагенту, если образцы подготовлены для секвенирования одноклеточной РНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация смеси коллагеназы и диспазы составляет 1 мг/мл, включая коллагеназу в дозе 0,1 ЕД/мл и диспазу в дозе 0,8 ЕД/мл.
6. Вручную переворачивайте трубку с интервалом в 5 минут во время 30-60-минутной водяной бани.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Точное время инкубации варьируется в зависимости от используемых тканей. Проверяйте ход диссоциации под микроскопом до тех пор, пока не будет видна объемная ткань. Поместите 10 мкл клеточной суспензии на предметное стекло с помощью пипетки и исследуйте ее под микроскопом. Увеличьте время пищеварения, если клетки не полностью диссоциированы.
7. Открутите пробирки при 300 × г в течение 5 мин при 4 °C и осторожно удалите ферментативный реагент для диссоциации клеток с помощью широкопроходных наконечников. Добавьте 1 мл ледяного 0,08% BSA-DPBS и аккуратно пипетируйте клетки вверх и вниз с помощью стеклянной пипетки с широким отверстием в течение 1 минуты.
   1. Повторите этот шаг дважды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пипетирование вверх и вниз следует выполнять с осторожностью с использованием наконечников с широким отверстием и низким удержанием, чтобы предотвратить разрушение клеток.
8. Предварительно смочите клеточный сетчатый фильтр размером 40 мкм 0,08% BSA-DPBS и поместите его в коническую пробирку объемом 50 мл. Пропустите клеточную суспензию через ситечко. Постучите и промойте дополнительными 200 мкл DPBS и соберите суспензию на дне пробирки.
9. Перенесите суспензию в пробирку объемом 1,5 мл. Добавьте 5 мкл ДНКазы I (1 ЕД/мкл) и инкубируйте в течение 15 мин при 15-20 °C. Центрифуга при 300 × г в течение 5 мин при 4 °C.
10. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 400 мкл ледяного DPBS (Ca 2+/Mg²⁺ свободно). Аккуратно проведите пипеткой вверх и вниз с широкими наконечниками, чтобы перемешать клетки. Повторите этот шаг дважды.

5. Окрашивание и микроскопическое исследование

1. Для окрашивания смешайте клеточную суспензию с 0,4% раствором трипанового синего в соотношении 1:1. Выдерживать 3 минуты при комнатной температуре.
2. Добавьте 5-10 мкл смеси на гемоцитометр и исследуйте под микроскопом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособные клетки будут иметь неокрашенную цитоплазму, в то время как мертвые клетки будут иметь синюю цитоплазму (рис. 2).
3. Подсчитайте жизнеспособные и мертвые клетки в трех разных полях под микроскопом. Рассчитайте процент жизнеспособности клеток, разделив количество жизнеспособных клеток на общее количество клеток в поле.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность клеток должна быть более 85%, а концентрация клеток должна быть не менее 1 x 10^5-1 x 10⁷ / мл. Фон клеточной суспензии должен быть чистым, без комков, фрагментов и примесей.

Результаты

В этом протоколе описывается приготовление высококачественной одноклеточной суспензии кишечника нильской тилапии для одноклеточного секвенирования (рис. 1). Это исследование показывает, что смесь коллагеназы и диспазы обладает хорошим диссоциативным эффектом и мягк?...

Обсуждение

В этом протоколе описывается приготовление высококачественной одноклеточной суспензии кишечника нильской тилапии. Перед диссоциацией необходимо удаление жира и брыжейки из кишечника, особенно для толстоядных рыб с большим количеством жира. Использование шприца вместо жесткого сос?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22-μm Sterile Filter	Solarbio Life Sciences	SLGV033RB	It is used to filter and sterilize the enzyme solution.
40-μm Cell Strainer	Solarbio Life Sciences	F8200	Cell Strainer is applied to eliminate undigested tissue pieces.
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	SRE0098	Powder; dilute 0.04 g BSA with 100 mL 1× DPBS to prepare 0.04% BSA-DPBS washing bffer. Store at 2 - 8 °C.
Collagenase II	Sangon Biotech	A004202	Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
Collagenase/dispase	Roche	10269638-001	Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
Dispase	Sigma-Aldrich	D4818	Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
DNase I	Sigma-Aldrich	AMPD1	DNase I helps reduce cell clumping.
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+/Mg2+-free	Solarbio Life Sciences	E607009-0500	Store at room temperature.
Elastase	Sangon Biotech	A600438	Dilute with PBS to a final concentration of 0.5 mg/mL.
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	16000-044	Serum, used at volume of 5% in digetstion solution.
Inverted Microscope	Leica	qTOWER3G	It is used to examine cell viability.
Liberase	Roche	5401119001	Dilute with PBS to a final concentration of 0.25 mg/mL.
Nile tilpia (Oreochromis niloticus)	ProGift Aquaculture Technology Co. Ltd.	NA	Healthy fish with no disease signs (Mean body weight: 100 g).
Phosphate-buffered saline (PBS)	Solarbio Life Sciences	P1020	Store at room temperature.
Refrigerated Centrifuge	Eppendorf	5424	It is used to spin down the tissue and cell petet.
RNase inhibitor	NEB	M0314L	Inhibit RNase activity
Solid-phase RNase-Be-Gone Reagent	Sangon Biotech	B644201-0050	It is used to remove the RNase from tools such as dissecting scissors and glass pipettes. Store at room temperature.
Tricaine methanesulfonate (MS-222)	Sigma-Aldrich	E10521	For fish euthanasia.
Trypan Blue	Invitrogen	C0040	It is used for staining dead cells.
Trypsin	Sangon Biotech	E607001	Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.