Препарат одноклеточной суспензии из кишечника нильской тилапии для секвенирования одноклеточных клеток

Резюме

Здесь мы демонстрируем приготовление высококачественной одноклеточной суспензии кишечника тилапии для одноклеточного секвенирования.

Аннотация

Нильская тилапия является одним из наиболее часто культивируемых видов пресноводных рыб во всем мире и является широко используемой исследовательской моделью для изучения аквакультуры рыб. Приготовление высококачественных одноклеточных суспензий имеет важное значение для исследований на уровне одной клетки, таких как одноклеточная РНК или секвенирование генома. Тем не менее, не существует готового к использованию протокола для видов рыб аквакультуры, особенно для кишечника тилапии. Эффективные ферменты диссоциации варьируются в зависимости от типа ткани. Поэтому оптимизация протокола диссоциации тканей путем выбора соответствующего фермента или комбинации ферментов для получения достаточного количества жизнеспособных клеток с минимальным повреждением имеет важное значение. Это исследование иллюстрирует оптимизированный протокол приготовления высококачественной одноклеточной суспензии из кишечника нильской тилапии с комбинацией ферментов коллагеназы / диспазы. Эта комбинация очень эффективна для диссоциации с использованием бычьего сывороточного альбумина и ДНКазы для уменьшения агрегации клеток после пищеварения. Клеточный выход удовлетворяет требованиям к секвенированию отдельных клеток, с 90% жизнеспособностью клеток и высокой концентрацией клеток. Этот протокол также может быть модифицирован для приготовления одноклеточной суспензии из кишечника других видов рыб. Это исследование обеспечивает эффективный эталонный протокол и снижает потребность в дополнительных испытаниях при приготовлении одноклеточных суспензий для видов рыб аквакультуры.

Введение

Клетки являются фундаментальными единицами организмов. По сравнению с исследованиями объемных тканей, исследования на уровне отдельных клеток могут отражать гетерогенность клеток и предоставлять информацию с более высоким разрешением¹. В последние годы исследователи применили технологии секвенирования отдельных клеток для геномных, транскриптомных, эпигеномных или мультиомных исследований на уровне отдельных клеток у млекопитающих, рыбок данио-рерио и других модельных организмов и сообщили о больших прорывах 2,3,4,5,6,7

протокол

Все протоколы на животных во время этого исследования были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Хайнаньского университета (номер протокола: HNUAUCC-2022-00063; Дата утверждения: 2022-03-03). Список оборудования и расходных материалов, использованных в этом эксперименте, можно найти в Таблице материалов. Краткое изложение текущего протокола проиллюстрировано на рисунке 1.

1. Подготовка рыбы

1. Получите 6-месячную нильскую тилапию со средней массой тела 100 г из надежного источника. Выбирайте рыбу, на которой нет никаких признаков болезней.

Результаты

В этом протоколе описывается приготовление высококачественной одноклеточной суспензии кишечника нильской тилапии для одноклеточного секвенирования (рис. 1). Это исследование показывает, что смесь коллагеназы и диспазы обладает хорошим диссоциативным эффектом и мягк?.......

Обсуждение

В этом протоколе описывается приготовление высококачественной одноклеточной суспензии кишечника нильской тилапии. Перед диссоциацией необходимо удаление жира и брыжейки из кишечника, особенно для толстоядных рыб с большим количеством жира. Использование шприца вместо жесткого сос?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22-μm Sterile Filter	Solarbio Life Sciences	SLGV033RB	It is used to filter and sterilize the enzyme solution.
40-μm Cell Strainer	Solarbio Life Sciences	F8200	Cell Strainer is applied to eliminate undigested tissue pieces.
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	SRE0098	Powder; dilute 0.04 g BSA with 100 mL 1× DPBS to prepare 0.04% BSA-DPBS washing bffer. Store at 2 - 8 °C.
Collagenase II	Sangon Biotech	A004202	Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
Collagenase/dispase	Roche	10269638-001	Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
Dispase	Sigma-Aldrich	D4818	Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
DNase I	Sigma-Aldrich	AMPD1	DNase I helps reduce cell clumping.
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+/Mg2+-free	Solarbio Life Sciences	E607009-0500	Store at room temperature.
Elastase	Sangon Biotech	A600438	Dilute with PBS to a final concentration of 0.5 mg/mL.
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	16000-044	Serum, used at volume of 5% in digetstion solution.
Inverted Microscope	Leica	qTOWER3G	It is used to examine cell viability.
Liberase	Roche	5401119001	Dilute with PBS to a final concentration of 0.25 mg/mL.
Nile tilpia (Oreochromis niloticus)	ProGift Aquaculture Technology Co. Ltd.	NA	Healthy fish with no disease signs (Mean body weight: 100 g).
Phosphate-buffered saline (PBS)	Solarbio Life Sciences	P1020	Store at room temperature.
Refrigerated Centrifuge	Eppendorf	5424	It is used to spin down the tissue and cell petet.
RNase inhibitor	NEB	M0314L	Inhibit RNase activity
Solid-phase RNase-Be-Gone Reagent	Sangon Biotech	B644201-0050	It is used to remove the RNase from tools such as dissecting scissors and glass pipettes. Store at room temperature.
Tricaine methanesulfonate (MS-222)	Sigma-Aldrich	E10521	For fish euthanasia.
Trypan Blue	Invitrogen	C0040	It is used for staining dead cells.
Trypsin	Sangon Biotech	E607001	Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.