Einzelzell-Suspensionspräparat aus Nil-Tilapia-Darm für die Einzelzell-Sequenzierung

Zusammenfassung

Hier demonstrieren wir die Herstellung einer hochwertigen Einzelzellsuspension aus Tilapia-Darm für die Einzelzell-Sequenzierung.

Zusammenfassung

Nil-Tilapia ist eine der am häufigsten kultivierten Süßwasserfischarten weltweit und ein weit verbreitetes Forschungsmodell für Aquakulturfischstudien. Die Herstellung von qualitativ hochwertigen Einzelzellsuspensionen ist für Einzelzellstudien wie Einzelzell-RNA oder Genomsequenzierung unerlässlich. Es gibt jedoch kein gebrauchsfertiges Protokoll für Aquakulturfischarten, insbesondere für den Darm von Tilapia. Die wirksamen Dissoziationsenzyme variieren je nach Gewebetyp. Daher ist es wichtig, das Gewebedissoziationsprotokoll durch die Auswahl des geeigneten Enzyms oder der Enzymkombination zu optimieren, um genügend lebensfähige Zellen mit minimaler Schädigung zu erhalten. Diese Studie veranschaulicht ein optimiertes Protokoll zur Herstellung einer hochwertigen Einzelzellsuspension aus Nil-Tilapia-Darm mit einer Enzymkombination aus Kollagenase/Dispase. Diese Kombination ist hochwirksam für die Dissoziation mit der Verwendung von Rinderserumalbumin und DNase, um die Zellaggregation nach der Verdauung zu reduzieren. Der Zellausstoß erfüllt die Anforderungen für die Einzelzellsequenzierung mit einer Zellviabilität von 90 % und einer hohen Zellkonzentration. Dieses Protokoll kann auch modifiziert werden, um eine einzellige Suspension aus dem Darm anderer Fischarten herzustellen. Diese Forschung stellt ein effizientes Referenzprotokoll dar und reduziert den Bedarf an zusätzlichen Versuchen bei der Herstellung von Einzelzellsuspensionen für Aquakulturfischarten.

Einleitung

Zellen sind die Grundbausteine von Organismen. Im Vergleich zu Bulk-Gewebestudien können Studien auf Einzelzellebene die Zellheterogenität widerspiegeln und Informationen mit höherer Auflösung liefern¹. In den letzten Jahren haben Forscher Einzelzellsequenzierungstechnologien für Genom-, Transkriptom-, Epigenom- oder Multi-Omik-Studien auf Einzelzellebene bei Säugetieren, Zebrafischen und anderen^{Modellorganismen angewendet} und von großen Durchbrüchen berichtet 2,3,4,5,6,7 . Während sich die meisten Studien auf Modellorganismen konzentriert haben, gibt es nur wenige Referenzprotokolle oder kommerzielle Dissoziationskits für die Einzelzellsequenzierung bei wirtschaftlichen Fischarten, was die Anwendung der Einzelzellsequenzierung in der Aquakulturforschung einschränkt. Daher ist die Entwicklung von Gewebedissoziationsprotokollen, die qualitativ hochwertige Einzelzellsuspensionen mit hoher Zellviabilität und Nukleinsäureintegrität herstellen, von entscheidender Bedeutung.

Die Optimierung des Gewebedissoziationsprotokolls mit dem geeigneten Enzym oder der Enzymkombination ist von entscheidender Bedeutung, um genügend lebensfähige Zellen mit minimaler Schädigung zu erhalten. Welches Enzym für die Gewebedissoziation am effektivsten ist, hängt vom Gewebetyp ab. Bei Säugetieren wurden mehrere Enzyme zur Herstellung von Einzelzellsuspensionen für festes Gewebe von Säugetieren verwendet, darunter Kollagenase, Dispase, Trypsin, Papain, Elastase, Hyaluronidase, Liberase, Accutase und TrypLE ^8,9. Die Trypsinverdauung in Kombination mit mechanischer Störung wurde häufig verwendet, um Gewebe für die Zellkultur bei Fischen zu dissoziieren 10,11,12,13,14. Trypsin wurde auch für die Gewebedissoziation im Rattendarm¹⁵ und im Zebrafisch-Kiemengewebe¹⁶ verwendet oder dem Verdauungscocktail zugesetzt. Aus mehreren Gründen ist Trypsin jedoch nicht die beste Option für die Einzelzellsequenzierung. Trypsin allein ist bei der Gewebedissoziation in der Regel unwirksam. Zusätzlich induziert Trypsin DNA-Strangbrüche ^17,18 und RNA-Abbau¹⁹.

Papain baut die Proteine ab, aus denen die Tight Junctions zwischen den Zellen bestehen. In Nervenzellen und glatten Muskelzellen von Säugetieren ist Papain effizienter und weniger zerstörerisch als andere Proteasen^20,21. Wie Trypsin führt Papain jedoch zu einer freien DNA-induzierten Aggregation von Zellen aufgrund der Zelllyse, die während der enzymatischen Verdauung stattfindet⁹. Elastase baut Elastin ab, das typischerweise in Haut, Lunge, Bändern, Sehnen und Gefäßgewebe vorkommt²². Es wird häufig in Kombination mit Kollagenase, Dispase oder Trypsin zur Dissoziation von Lungengewebe verwendet⁸. Hyaluronidase spaltet die glykosidischen Bindungen der Hyaluronsäure und trägt zur Verdauung der extrazellulären Matrix in verschiedenen Bindegeweben und der Haut bei ^9,23.

Im Allgemeinen sind Kollagenase und Dispase gute Optionen für den Abbau der extrazellulären Matrix. Sie wurden bei der Dissoziation von Menschen-, Maus- und Zebrafischdärmen^{verwendet 24,25,26,27}. Kollagenase zerstört die Peptidbindung im Kollagen, fördert die Verdauung der extrazellulären Matrix und setzt die Zellen in Suspension frei, so dass Kollagenase häufig für die Dissoziation von festem Gewebe von Mensch und Maus verwendet wird, einschließlich für die Leber 28,29, Milz^30, Bauchspeicheldrüse³¹ und Darm ²⁵. Dispase ist eine Protease, die die N-terminalen Peptidbindungen unpolarer Aminosäurereste hydrolysiert und milder als Kollagenase ist. Es spaltet die Bestandteile der extrazellulären Matrix, wie Fibronektin, Typ-IV-Kollagen und in geringerem Maße Typ-I-Kollagen, ohne die Zell-Zell-Verbindungen zu beeinträchtigen. Dispase wird separat oder zusammen mit anderen Enzymen zur Gewebedissoziation verwendet, z. B. für Darm²⁵,^{32, Gehirn 33,} Leber ³⁴ usw. Darüber hinaus sind kommerziell erhältliche Verdauungscocktails, einschließlich Liberase, Accutase und TrypLE, auch gute Alternativen für die Dissoziation fester Gewebe, insbesondere für Haut, Leber und Niere ^8,9.

Nil-Tilapia (Oreochromis niloticus) gehört zur Familie der Cichlidae aus der Ordnung der Perciformes. Er ist eine der am häufigsten gezüchteten Süßwasserfischarten in tropischen und subtropischen Gebieten mit einer Jahresproduktion von 4,5 Millionen Tonnen im Jahr 2022³⁵. Er ist eine der am besten untersuchten Aquakulturfischarten mit einem gut annotierten Genom. Nil-Tilapia ist aufgrund seiner kurzen Generationszeit, seiner einfachen Aufzucht und seiner Anpassungsfähigkeit an eine Vielzahl von Aufzuchtumgebungen ein ideales Forschungsmodell für Aquakulturfischarten. Der Darm ist von großem Forschungsinteresse, da er das Organ der Ernährung, der Verdauung und Resorption, des Stoffwechsels und der Immunität der Schleimhäute ist. Der Darm ist Lebensraum mikrobieller Populationen und ein essentielles Immungewebe³⁶. Es ist immunologisch aktiv, da zahlreiche Immunzelltypen vorhanden sind, darunter Makrophagen, B-Zellen, Granulozyten und T-Zellen.

In der aktuellen Studie haben wir ein Protokoll zur Herstellung einer hochwertigen Einzelzellsuspension aus dem Nil-Tilapia-Darm entwickelt, um Einzelzellstudien in Aquakulturfischarten zu ermöglichen. Entsprechend den Eigenschaften dieser gewebespezifischen Enzyme und der Vorarbeiten ist Kollagenase/Dispase geeignet, um Tilapia-Darmgewebe zu dissoziieren. Der letzte Enzymtyp, der bei der Herstellung von Einzelzellsuspensionen zu berücksichtigen ist, ist DNase-I, der die Zellaggregation verhindert, indem er freie DNA abbaut, die durch die Lyse toter Zellen während der enzymatischen Verdauung freigesetzt wird, ohne apoptotische Wege zu initiieren⁹ , und die Ausbeute an lebenden Zellen erhöht³⁶. Zusätzlich wird dem Waschpuffer Rinderserumalbumin (BSA) zugesetzt, um die Zellverklumpung zu reduzieren und die Lebensfähigkeit der Zellen zu verbessern. Mehrere Reagenzienhersteller beschreiben BSA als Enzymstabilisator. Die Zugabe von 0,04 %-1 % BSA zu PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) wurde verwendet, um eine Waschlösung zur Herstellung von Einzelzell-Sequenzierungssuspensionen ohne nachteilige Auswirkungen zu entwickeln³⁸. Die Zugabe eines niedrigen BSA-Verhältnisses könnte dazu beitragen, die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten und die durch freie DNA induzierte Aggregation von Zellen aufgrund der Zelllyse zu vermeiden. Dieses Protokoll kann auch eine wertvolle Referenz für die Entwicklung von Zelldissoziationsprotokollen aus dem Darm anderer Aquakulturfischarten darstellen.

Protokoll

Alle Tierprotokolle während dieser Studie wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Universität Hainan genehmigt (Protokollnummer: HNUAUCC-2022-00063; Datum der Genehmigung: 03.03.2022). Eine Liste der in diesem Experiment verwendeten Geräte und Verbrauchsmaterialien finden Sie in der Materialtabelle. Eine Zusammenfassung des aktuellen Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Fischzubereitung

1. Besorge dir 6 Monate alten Nil-Tilapia mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 100 g aus einer zuverlässigen Quelle. Wählen Sie Fische aus, die frei von Krankheitszeichen sind.
2. Stoppen Sie die Fütterung der Fische 24 Stunden, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
   HINWEIS: Fischfasten reduziert das Volumen des Darminhalts und erleichtert die Vorbereitung von Darmsegmenten.
3. Spülen Sie den Fisch 15 Minuten lang in gut belüftetem, sterilem Wasser ab, um lose gebundene Bakterien auf der Körperoberfläche abzuwaschen.
4. Euthanasieren Sie den Fisch mit 300 mg/l Tricain-Methansulfonat (MS-222) für etwa 10 Minuten, bis alle Bewegungen aufhören.

2. Vorbereitung der Reagenzien

1. Bereiten Sie 0,08 % BSA-Dulbecco-phosphatgepufferte Kochsalzlösung (BSA-DPBS, für Zellspülung und Resuspension) vor. 0,08 g BSA (0,8 % w/v) in 100 ml 1x DPBS auflösen. Bei 4 °C lagern und bei Gebrauch auf Eis vorkühlen.
   HINWEIS: Die Zugabe von BSA ist vorteilhaft für die Minimierung der Zellverklumpung. Das BSA-Verhältnis kann je nach Zellverklumpungsbedingungen von 0,04 % auf 1 % erhöht werden.
2. Bereiten Sie das enzymatische Zelldissoziationsreagenz vor.
   1. Verdünnen Sie die Kollagenase/Dispase mit 1x PBS auf eine Endkonzentration von 1 mg/ml (0,1 U/ml Kollagenase und 0,8 U/ml Dispase). Stellen Sie sicher, dass PBS und nicht DPBS verwendet wird.
      HINWEIS: PBS liefert die Kalziumionen, die für die ordnungsgemäße Funktion des Enzyms benötigt werden. DPBS sollte in diesem Schritt nicht verwendet werden, da es frei von Ca2+/^Mg2+ ist. Zusätzlich wird im aktuellen Protokoll Kollagenase Typ I verwendet.
   2. Filtrieren Sie die Verdünnung durch einen sterilen 0,22 μm Membranfilter.
   3. Bereiten Sie ein Zelldissoziationsreagenz vor, das zu 95 Vol.-% aus Kollagenase/Dispase-Lösung und zu 5 Vol.-% aus fötalem Kälberserum (FBS) besteht.
      Anmerkungen: Das Dissoziationsreagenz sollte bei jeder Verwendung frisch zubereitet werden. Die Verwendung von 5% FBS trägt dazu bei, die Lebensfähigkeit der Zellen während der Verdauung aufrechtzuerhalten.
3. Bereiten Sie die Trypanblau-Lösung vor.
   1. Nehmen Sie die Trypanblau-Lösung aus dem 4 °C-Kühlschrank und bewahren Sie sie vor der Verwendung einige Minuten bei 15-20 °C auf, um Niederschläge zu vermeiden.
   2. Filtrieren Sie die Lösung durch eine sterile 0,22 μm Membran.

3. Vorbereitung der Ausrüstung

1. Kühlen Sie die Kühlzentrifuge vor Gebrauch auf 4 °C vor.
2. Besorgen Sie sich sterile RNase-freie 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen, konische 50-ml-Röhrchen, Glaspipetten und -spitzen mit breitem Durchgang, Membranfilter, Zellsiebe und alle Röhrchen und Spitzen mit geringer Retention.
3. Autoklavieren Sie Glaspipetten und Dissektionswerkzeuge, einschließlich Pinzetten, Scheren und Skalpelle, und behandeln Sie sie mit der RNase-Entfernungslösung vor, um die nachteiligen Auswirkungen der RNase auf die Einzelzell-RNA-Seq zu verhindern.

4. Gewebedissektion und Zelldissoziation

1. Legen Sie den eingeschläferten Fisch zum Sezieren auf Eis. Sammeln Sie aseptisch 3-4 cm des mittleren Darmabschnitts und entfernen Sie so viel Fett und Mesenterium wie möglich. Entfernen Sie vorsichtig das an der Darmoberfläche anhaftende Fett und die Schicht aus elastischer und formbarer klarer Schleimhaut mit einer Pinzette.
   HINWEIS: Das Fett und das Mesenterium sind an der äußeren Oberfläche des Darms befestigt.
2. Entfernen Sie so viel Fett wie möglich, um nachteilige Auswirkungen auf das Dissoziationsprotokoll zu vermeiden. Spülen Sie die Fragmente mit einer Spritze mehrmals vorsichtig mit sterilem, eiskaltem PBS aus, um den Darminhalt und den Schleim abzuwaschen. Vermeiden Sie grobe Handhabung.
3. Präparieren Sie das Darmsegment in kleine Stücke und geben Sie sie in ein 1,5-ml-Röhrchen, das mit 1 ml eiskaltem PBS gefüllt ist.
4. Bei 300 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und ersetzen Sie ihn durch 1 ml eiskaltes 0,08%iges BSA-DPBS. Resuspendieren Sie die Gewebefragmente durch sanftes Absaugen mit einer Glaspipette. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
5. Entfernen Sie den Überstand und verdauen Sie die Gewebefragmente mit 1 ml des enzymatischen Dissoziationsreagenzes (950 μl Kollagenase/Dispase-Lösung und 50 μl FBS) in einem 37 °C warmen Wasserbad für 30-60 Minuten.
   1. Zusätzlich werden 5 μl RNase-Inhibitor (40 U/μl in der Stammlösung) zum Dissoziationsreagenz gegeben, wenn die Proben für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung vorbereitet werden.
      HINWEIS: Die Endkonzentration der Kollagenase/Dispersionsmischung beträgt 1 mg/ml, einschließlich Kollagenase bei 0,1 U/ml und Dispase bei 0,8 U/ml.
6. Drehen Sie den Schlauch während des 30-60-minütigen Wasserbades in 5-Minuten-Intervallen manuell um.
   HINWEIS: Die genaue Inkubationszeit variiert je nach verwendetem Gewebe. Kontrollieren Sie den Fortschritt der Dissoziation unter dem Mikroskop, bis kein Massengewebe mehr zu sehen ist. Geben Sie 10 μl der Zellsuspension mit einer Pipette auf einen Objektträger und untersuchen Sie ihn unter dem Mikroskop. Erhöhen Sie die Verdauungszeit, wenn die Zellen nicht vollständig dissoziiert sind.
7. Drehen Sie die Röhrchen bei 300 × g für 5 min bei 4 °C herunter und entfernen Sie vorsichtig das enzymatische Zelldissoziationsreagenz mit weit geöffneten Spitzen. Fügen Sie 1 ml eiskaltes 0,08 % BSA-DPBS hinzu und pipettieren Sie die Zellen vorsichtig 1 Minute lang mit einer Glaspipette mit breitem Durchmesser auf und ab.
   1. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
      Anmerkungen: Das Auf- und Abpipettieren sollte mit Vorsicht unter Verwendung von Spitzen mit breiter Bohrung und geringer Retention durchgeführt werden, um einen Zellaufschluss zu vermeiden.
8. Befeuchten Sie ein 40-μm-Zellsieb mit 0,08 % BSA-DPBS und legen Sie es in ein konisches 50-ml-Röhrchen. Führen Sie die Zellsuspension durch das Sieb. Klopfen und spülen Sie mit zusätzlichen 200 μl DPBS und sammeln Sie die Suspension am Boden des Röhrchens.
9. Übertragen Sie die Suspension in ein 1,5-ml-Röhrchen. 5 μl DNase I (1 U/μl) zugeben und 15 min bei 15-20 °C inkubieren. Bei 300 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
10. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 400 μl eiskaltem DPBS (Ca 2+/Mg²⁺ frei). Pipettieren Sie vorsichtig mit weit geöffneten Spitzen auf und ab, um die Zellen zu vermischen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.

5. Färbung und mikroskopische Untersuchung

1. Zum Färben wird die Zellsuspension im Verhältnis 1:1 mit 0,4%iger Trypanblaulösung gemischt. 3 min bei Raumtemperatur inkubieren.
2. Geben Sie 5-10 μl der Mischung auf ein Hämozytometer und untersuchen Sie sie unter dem Mikroskop.
   HINWEIS: Lebensfähige Zellen haben ungefärbtes Zytoplasma, während tote Zellen ein blaues Zytoplasma haben (Abbildung 2).
3. Zählen Sie die lebensfähigen und toten Zellen in drei verschiedenen Feldern unter dem Mikroskop. Berechnen Sie den Prozentsatz der Zellviabilität, indem Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen durch die Gesamtzahl der Zellen in einem Feld dividieren.
   HINWEIS: Die Zellviabilität sollte mehr als 85% betragen und die Zellkonzentration sollte nicht weniger als 1 x 10^5-1 x 10⁷/ml betragen. Der Hintergrund der Zellsuspension sollte sauber sein, ohne Klumpen, Fragmente oder Verunreinigungen.

Ergebnisse

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung einer hochwertigen Einzelzellsuspension aus Nil-Tilapia-Darm für die Einzelzellsequenzierung (Abbildung 1). Diese Forschung zeigt, dass die Kollagenase/Dispase-Mischung eine gute Dissoziationswirkung hat und mild für das Darmgewebe ist. Die Auswahl des optimalen Verdauungsenzyms ist entscheidend für die Herstellung einer hochwertigen einzelligen Suspension. In den Vorarbeiten wurden die Dissoziationseffizienzen mehrerer häufig verwendeter Enzym...

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung einer hochwertigen einzelligen Suspension aus Nil-Tilapia-Darm. Vor der Dissoziation ist die Entfernung von Fett und Mesenterium aus dem Darm notwendig, insbesondere bei fleischfressenden Fischdärmen mit viel Fett. Die Verwendung einer Spritze anstelle von hartem Schaben zum Abwaschen des Darminhalts reduziert die mechanische Schädigung der Zellen. Um die Lebensfähigkeit der Zellen zu gewährleisten, ist es auch wichtig, die Temperatur für die Gewebedissektion und das Spül...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22-μm Sterile Filter	Solarbio Life Sciences	SLGV033RB	It is used to filter and sterilize the enzyme solution.
40-μm Cell Strainer	Solarbio Life Sciences	F8200	Cell Strainer is applied to eliminate undigested tissue pieces.
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	SRE0098	Powder; dilute 0.04 g BSA with 100 mL 1× DPBS to prepare 0.04% BSA-DPBS washing bffer. Store at 2 - 8 °C.
Collagenase II	Sangon Biotech	A004202	Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
Collagenase/dispase	Roche	10269638-001	Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
Dispase	Sigma-Aldrich	D4818	Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
DNase I	Sigma-Aldrich	AMPD1	DNase I helps reduce cell clumping.
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+/Mg2+-free	Solarbio Life Sciences	E607009-0500	Store at room temperature.
Elastase	Sangon Biotech	A600438	Dilute with PBS to a final concentration of 0.5 mg/mL.
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	16000-044	Serum, used at volume of 5% in digetstion solution.
Inverted Microscope	Leica	qTOWER3G	It is used to examine cell viability.
Liberase	Roche	5401119001	Dilute with PBS to a final concentration of 0.25 mg/mL.
Nile tilpia (Oreochromis niloticus)	ProGift Aquaculture Technology Co. Ltd.	NA	Healthy fish with no disease signs (Mean body weight: 100 g).
Phosphate-buffered saline (PBS)	Solarbio Life Sciences	P1020	Store at room temperature.
Refrigerated Centrifuge	Eppendorf	5424	It is used to spin down the tissue and cell petet.
RNase inhibitor	NEB	M0314L	Inhibit RNase activity
Solid-phase RNase-Be-Gone Reagent	Sangon Biotech	B644201-0050	It is used to remove the RNase from tools such as dissecting scissors and glass pipettes. Store at room temperature.
Tricaine methanesulfonate (MS-222)	Sigma-Aldrich	E10521	For fish euthanasia.
Trypan Blue	Invitrogen	C0040	It is used for staining dead cells.
Trypsin	Sangon Biotech	E607001	Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.