Préparation de suspension unicellulaire de l’intestin de tilapia du Nil pour séquençage unicellulaire

Résumé

Ici, nous démontrons la préparation d’une suspension unicellulaire de haute qualité de l’intestin du tilapia pour le séquençage unicellulaire.

Résumé

Le tilapia du Nil est l’une des espèces de poissons d’eau douce les plus couramment cultivées dans le monde et constitue un modèle de recherche largement utilisé pour les études sur les poissons d’aquaculture. La préparation de suspensions unicellulaires de haute qualité est essentielle pour les études au niveau unicellulaire telles que le séquençage de l’ARN unicellulaire ou du génome. Cependant, il n’existe pas de protocole prêt à l’emploi pour les espèces de poissons d’aquaculture, en particulier pour l’intestin du tilapia. Les enzymes de dissociation efficaces varient en fonction du type de tissu. Par conséquent, il est essentiel d’optimiser le protocole de dissociation tissulaire en sélectionnant l’enzyme ou la combinaison d’enzymes appropriée pour obtenir suffisamment de cellules viables avec un minimum de dommages. Cette étude illustre un protocole optimisé pour préparer une suspension unicellulaire de haute qualité de l’intestin du tilapia du Nil avec une combinaison enzymatique de collagénase/dispase. Cette combinaison est très efficace pour la dissociation avec l’utilisation de l’albumine sérique bovine et de la DNase pour réduire l’agrégation cellulaire après digestion. La sortie de cellule répond aux exigences de séquençage de cellules uniques, avec une viabilité cellulaire de 90% et une concentration élevée de cellules. Ce protocole peut également être modifié pour préparer une suspension unicellulaire provenant des intestins d’autres espèces de poissons. Cette recherche fournit un protocole de référence efficace et réduit le besoin d’essais supplémentaires dans la préparation de suspensions unicellulaires pour les espèces de poissons d’aquaculture.

Introduction

Les cellules sont les unités fondamentales des organismes. Par rapport aux études sur les tissus en vrac, les études au niveau d’une seule cellule peuvent refléter l’hétérogénéité cellulaire et fournir des informations à plus haute résolution¹. Au cours des dernières années, les chercheurs ont appliqué des technologies de séquençage unicellulaire pour des études sur le génome, le transcriptome, l’épigénome ou multi-omiques au niveau unicellulaire chez des mammifères, des poissons-zèbres et d’autres organismes modèles et ont signalé de grandes percées 2,3,4,5,6,7 . Bien que la plupart des études se soient concentrées sur des organismes modèles, il existe peu de protocoles de référence ou de trousses de dissociation commerciales pour le séquençage unicellulaire chez les espèces de poissons économiques, ce qui limite l’application du séquençage unicellulaire dans la recherche aquacole. Par conséquent, il est crucial de développer des protocoles de dissociation tissulaire qui produisent des suspensions unicellulaires de haute qualité avec une viabilité cellulaire élevée et une intégrité des acides nucléiques.

Il est essentiel d’optimiser le protocole de dissociation tissulaire avec l’enzyme ou la combinaison enzymatique appropriée pour obtenir suffisamment de cellules viables avec un minimum de dommages. L’enzyme la plus efficace pour la dissociation tissulaire varie en fonction du type de tissu. Chez les mammifères, plusieurs enzymes ont été utilisées pour préparer des suspensions unicellulaires pour les tissus solides des mammifères, notamment la collagénase, la dispase, la trypsine, la papaïne, l’élastase, la hyaluronidase, la liberase, l’accutase et la trypLE ^8,9. La digestion de la trypsine combinée à une perturbation mécanique a été couramment utilisée pour dissocier les tissus pour la culture cellulaire chez les poissons 10,11,12,13,14. La trypsine a également été utilisée ou ajoutée dans le cocktail de digestion pour la dissociation des tissus dans l’intestin du rat¹⁵ et le tissu branchial du poisson zèbre¹⁶. Cependant, pour plusieurs raisons, la trypsine n’est pas la meilleure option pour le séquençage unicellulaire. La trypsine seule est généralement inefficace pour la dissociation tissulaire. De plus, la trypsine induit des ruptures de brins^{d’ADN 17,18} et une dégradation de l’ARN ¹⁹.

La papaïne dégrade les protéines qui composent les jonctions serrées entre les cellules. Dans les cellules nerveuses et musculaires lisses des mammifères, la papaïne est plus efficace et moins destructrice que les autres protéases^20,21. Cependant, comme la trypsine, la papaïne entraîne l’agrégation libre des cellules induite par l’ADN en raison de la lyse cellulaire qui se produit pendant la digestion enzymatique⁹. L’élastase décompose l’élastine, qui se trouve généralement dans la peau, les poumons, les ligaments, les tendons et les tissus vasculaires²². Il est souvent utilisé en association avec la collagénase, la dispase, ou la trypsine pour dissocier le tissu pulmonaire⁸. La hyaluronidase clive les liaisons glycosidiques de l’hyaluronane, contribuant à la digestion de la matrice extracellulaire dans divers tissus conjonctifs et la peau ^9,23.

En général, la collagénase et la dispase sont de bonnes options pour la dégradation de la matrice extracellulaire. Ils ont été utilisés dans la dissociation des intestins humains, de souris et de poisson zèbre^24,25,26,27. La collagénase détruit la liaison peptidique dans le collagène, favorise la digestion de la matrice extracellulaire et libère les cellules en suspension, et, par conséquent, la collagénase est souvent utilisée pour la dissociation des tissus solides humains et murins, y compris pour le foie 28,29, la rate^30, le pancréas³¹ et l’intestin ²⁵. La dispase est une protéase qui hydrolyse les liaisons peptidiques N-terminales des résidus d’acides aminés non polaires et est plus douce que la collagénase. Il clive les composants de la matrice extracellulaire, tels que la fibronectine, le collagène de type IV et, dans une moindre mesure, le collagène de type I, sans affecter les jonctions cellule-cellule. Dispase est utilisé séparément ou avec d’autres enzymes pour la dissociation tissulaire, comme pour l’intestin^25,32, le cerveau³³, le foie^34, etc. En outre, les cocktails de digestion disponibles dans le commerce, y compris la liberase, l’accutase et le trypLE, sont également de bonnes alternatives pour la dissociation des tissus solides, en particulier pour la peau, le foie et les reins ^8,9.

Le tilapia du Nil (Oreochromis niloticus) appartient à la famille des Cichlidae de l’ordre des Perciformes. C’est l’une des espèces de poissons d’eau douce les plus cultivées dans les zones tropicales et subtropicales, avec une production annuelle de 4,5 millions de tonnes en 2022³⁵. C’est l’une des espèces de poissons d’aquaculture les mieux étudiées avec un génome bien annoté. Le tilapia du Nil est un modèle de recherche idéal pour les espèces de poissons d’aquaculture en raison de son temps de génération court, de sa facilité d’élevage et de son adaptabilité à un large éventail d’environnements d’élevage. L’intestin est d’un grand intérêt pour la recherche car c’est l’organe de la digestion et de l’absorption de la nutrition, du métabolisme et de l’immunité muqueuse. L’intestin est l’habitat des populations microbiennes et constitue un tissu immunitaire essentiel³⁶. Il est immunologiquement actif en raison de la présence de nombreux types de cellules immunitaires, y compris les macrophages, les cellules B, les granulocytes et les cellules T.

Dans la présente étude, nous avons développé un protocole pour préparer une suspension unicellulaire de haute qualité de l’intestin du tilapia du Nil afin de faciliter les études au niveau unicellulaire chez les espèces de poissons d’aquaculture. Selon les caractéristiques de ces enzymes spécifiques aux tissus et les travaux préliminaires, la collagénase / dispase est appropriée pour dissocier le tissu intestinal du tilapia. Le dernier type d’enzyme à considérer dans la préparation de suspensions unicellulaires est la DNase-I, qui empêche l’agrégation cellulaire en dégradant l’ADN libre libéré par lyse des cellules mortes pendant la digestion enzymatique sans initier de voies apoptotiques⁹ et augmente le rendement en cellules vivantes³⁶. De plus, de l’albumine sérique bovine (BSA) est ajoutée au tampon de lavage pour réduire l’agglutination cellulaire et améliorer la viabilité cellulaire. Plusieurs sociétés de réactifs décrivent BSA comme un stabilisateur enzymatique. L’ajout de BSA à 0,04%-1% au PBS (solution saline tamponnée au phosphate) a été utilisé pour développer une solution de lavage permettant de préparer des suspensions de séquençage unicellulaire sans effets indésirables³⁸. L’ajout d’un faible ratio de BSA pourrait aider à maintenir la viabilité cellulaire et à éviter l’agrégation libre induite par l’ADN des cellules due à la lyse cellulaire. Ce protocole peut également fournir une référence précieuse pour le développement de protocoles de dissociation cellulaire des intestins d’autres espèces de poissons d’aquaculture.

Protocole

Tous les protocoles sur les animaux au cours de cette étude ont été approuvés par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Hainan (numéro de protocole : HNUAUCC-2022-00063; Date d’approbation : 2022-03-03). Une liste de l’équipement et des fournitures utilisés dans cette expérience se trouve dans le tableau des matériaux. Un résumé du protocole actuel est illustré à la figure 1.

1. Préparation du poisson

1. Obtenez un tilapia du Nil âgé de 6 mois avec un poids corporel moyen de 100 g à partir d’une source fiable. Choisissez des poissons exempts de tout signe de maladie.
2. Arrêtez de nourrir les poissons 24 h avant de passer à l’étape suivante.
   NOTE: Le jeûne du poisson réduit le volume du contenu intestinal et facilite la préparation des segments intestinaux.
3. Rincez le poisson dans de l’eau stérile bien aérée pendant 15 minutes pour éliminer les bactéries lâches à la surface du corps.
4. Euthanasier le poisson avec 300 mg/L de méthanesulfonate de tricaïne (MS-222) pendant environ 10 minutes jusqu’à ce que tout mouvement cesse.

2. Préparation du réactif

1. Préparer la solution saline tamponnée au phosphate de BSA-Dulbecco à 0,08 % (BSA-DPBS, pour le rinçage cellulaire et la remise en suspension). Dissoudre 0,08 g de BSA (0,8 % p/v) dans 100 mL de 1x DPBS. Conserver à 4 °C et prérefroidir sur de la glace lorsqu’il est utilisé.
   REMARQUE: L’ajout de BSA est bénéfique pour minimiser l’agglutination cellulaire. Le rapport BSA peut être augmenté de 0,04% à 1% selon les conditions d’agglutination cellulaire.
2. Préparer le réactif de dissociation cellulaire enzymatique.
   1. Diluer la collagénase/dispase avec 1x PBS jusqu’à une concentration finale de 1 mg/mL (0,1 U/mL de collagénase et 0,8 U/mL de dispase). Assurez-vous que PBS et non DPBS est utilisé.
      REMARQUE: PBS fournit les ions calcium nécessaires au bon fonctionnement de l’enzyme. DPBS ne doit pas être utilisé dans cette étape car il est Ca 2+/Mg²⁺ libre. De plus, la collagénase de type I est utilisée dans le protocole actuel.
   2. Filtrer la dilution à travers un filtre à membrane stérile de 0,22 μm.
   3. Préparer un réactif de dissociation cellulaire composé d’un volume de 95 % de solution de collagénase/dispase et d’un volume de 5 % de sérum fœtal bovin (FBS).
      REMARQUE: Le réactif de dissociation doit être rendu frais chaque fois qu’il est utilisé. L’utilisation de 5% FBS aide à maintenir la viabilité cellulaire pendant la digestion.
3. Préparer la solution de bleu trypan.
   1. Prenez la solution de bleu trypan du réfrigérateur à 4 °C et conservez-la à 15-20 °C pendant quelques minutes avant de l’utiliser pour éviter les précipitations.
   2. Filtrer la solution à travers une membrane stérile de 0,22 μm.

3. Préparation de l’équipement

1. Prérefroidir la centrifugeuse réfrigérée à 4 °C avant utilisation.
2. Procurez-vous des tubes centrifugés stériles de 1,5 mL sans RNase, des tubes coniques de 50 mL, des pipettes et des embouts en verre de grand calibre, des filtres à membrane, des crépines cellulaires et tous les tubes et embouts à faible rétention.
3. Autoclave pipettes en verre et outils de dissection, y compris les pinces, les ciseaux et les scalpels, et les prétraiter avec la solution d’élimination de la RNase pour prévenir les effets indésirables de la RNase pour le séquençage de l’ARN unicellulaire.

4. Dissection tissulaire et dissociation cellulaire

1. Mettez le poisson euthanasié sur la glace pour la dissection. De manière aseptique, recueillir 3-4 cm de la section médiane de l’intestin et exciser autant de graisse et de mésentère que possible. Retirez soigneusement la graisse attachée à la surface intestinale et la couche de muqueuse claire élastique et malléable avec une pince.
   REMARQUE: La graisse et le mésentère sont attachés à la surface externe de l’intestin.
2. Enlevez autant de graisse que possible pour éviter ses effets indésirables sur le protocole de dissociation. À l’aide d’une seringue, rincer doucement les fragments avec du PBS glacé stérile plusieurs fois pour laver le contenu intestinal et le mucus. Évitez les manipulations brutales.
3. Disséquez le segment de l’intestin en petits morceaux et transférez-les dans un tube de 1,5 mL rempli de 1 mL de PBS glacé.
4. Centrifuger à 300 × g pendant 5 min à 4 °C. Retirer délicatement le surnageant et le remplacer par 1 mL de BSA-DPBS glacé à 0,08 %. Remettez les fragments de tissu en suspension par aspiration douce à l’aide d’une pipette en verre. Répétez cette étape deux fois.
5. Retirer le surnageant et digérer les fragments de tissu en utilisant 1 mL du réactif de dissociation enzymatique (950 μL de solution de collagénase/dispase et 50 μL de FBS) dans un bain-marie à 37 °C pendant 30 à 60 min.
   1. De plus, ajouter 5 μL d’inhibiteur de la RNase (40 U/μL dans la solution mère) au réactif de dissociation si les échantillons sont préparés pour le séquençage de l’ARN unicellulaire.
      REMARQUE : La concentration finale du mélange collagénase/dispase est de 1 mg/mL, y compris la collagénase à 0,1 U/mL et la dispase à 0,8 U/mL.
6. Retourner manuellement le tube à intervalles de 5 minutes pendant le bain-marie de 30 à 60 minutes.
   NOTE: Le temps d’incubation exact varie en fonction des tissus utilisés. Vérifiez la progression de la dissociation au microscope jusqu’à ce qu’aucun tissu volumineux ne soit observé. Placez 10 μL de la suspension cellulaire sur une lame de verre à l’aide d’une pipette et examinez-la au microscope. Augmentez le temps de digestion si les cellules ne sont pas complètement dissociées.
7. Faire tourner les tubes à 300 × g pendant 5 min à 4 °C et retirer délicatement le réactif de dissociation cellulaire enzymatique à l’aide d’embouts de large alésage. Ajouter 1 mL de BSA-DPBS glacé à 0,08 % et pipeter doucement les cellules de haut en bas à l’aide d’une pipette en verre de gros calibre pendant 1 min.
   1. Répétez cette étape deux fois.
      REMARQUE: Le pipetage de haut en bas doit être effectué avec soin en utilisant des embouts de faible alésage et de faible rétention pour éviter la perturbation cellulaire.
8. Pré-mouiller une crépine cellulaire de 40 μm avec 0,08% de BSA-DPBS et placez-la dans un tube conique de 50 mL. Passez la suspension cellulaire à travers la passoire. Tapoter et rincer avec 200 μL de DPBS supplémentaires et recueillir la suspension au fond du tube.
9. Transférer la suspension dans un tube de 1,5 mL. Ajouter 5 μL de DNase I (1 U/μL) et incuber pendant 15 min à 15-20 °C. Centrifuger à 300 × g pendant 5 min à 4 °C.
10. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille de la cellule dans 400 μL de DPBS glacé (Ca 2+/Mg²⁺ libre). Pipeter doucement de haut en bas avec des embouts de large alésage pour mélanger les cellules. Répétez cette étape deux fois.

5. Coloration et examen microscopique

1. Pour la coloration, mélanger la suspension cellulaire avec une solution de bleu de trypan à 0,4% dans un rapport de 1:1. Incuber pendant 3 min à température ambiante.
2. Ajouter 5-10 μL du mélange sur un hémocytomètre, et examiner au microscope.
   REMARQUE : Les cellules viables auront un cytoplasme non coloré, tandis que les cellules mortes auront un cytoplasme bleu (Figure 2).
3. Comptez les cellules viables et mortes dans trois champs différents au microscope. Calculez le pourcentage de viabilité cellulaire en divisant le nombre de cellules viables par le nombre total de cellules dans un champ.
   REMARQUE : La viabilité cellulaire doit être supérieure à 85 % et la concentration cellulaire ne doit pas être inférieure à 1 x 10^5-1 x 10⁷/mL. Le fond de suspension cellulaire doit être propre, sans touffes, fragments ou impuretés.

Résultats

Ce protocole décrit la préparation d’une suspension unicellulaire de haute qualité de l’intestin du tilapia du Nil pour le séquençage unicellulaire (Figure 1). Cette recherche montre que le mélange collagénase/dispase a un bon effet de dissociation et est doux pour les tissus intestinaux. La sélection de l’enzyme de digestion optimale est essentielle pour préparer une suspension unicellulaire de haute qualité. Dans les travaux préliminaires, les efficacités de dissociation ...

Discussion

Ce protocole décrit la préparation d’une suspension unicellulaire de haute qualité de l’intestin du tilapia du Nil. Avant la dissociation, l’élimination de la graisse et du mésentère de l’intestin est nécessaire, en particulier pour les intestins de poisson carnivores avec beaucoup de graisse. L’utilisation d’une seringue au lieu d’un grattage dur pour laver le contenu intestinal réduit les dommages mécaniques aux cellules. Pour assurer la viabilité cellulaire, il est également essentiel de maint...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22-μm Sterile Filter	Solarbio Life Sciences	SLGV033RB	It is used to filter and sterilize the enzyme solution.
40-μm Cell Strainer	Solarbio Life Sciences	F8200	Cell Strainer is applied to eliminate undigested tissue pieces.
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	SRE0098	Powder; dilute 0.04 g BSA with 100 mL 1× DPBS to prepare 0.04% BSA-DPBS washing bffer. Store at 2 - 8 °C.
Collagenase II	Sangon Biotech	A004202	Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
Collagenase/dispase	Roche	10269638-001	Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
Dispase	Sigma-Aldrich	D4818	Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
DNase I	Sigma-Aldrich	AMPD1	DNase I helps reduce cell clumping.
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+/Mg2+-free	Solarbio Life Sciences	E607009-0500	Store at room temperature.
Elastase	Sangon Biotech	A600438	Dilute with PBS to a final concentration of 0.5 mg/mL.
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	16000-044	Serum, used at volume of 5% in digetstion solution.
Inverted Microscope	Leica	qTOWER3G	It is used to examine cell viability.
Liberase	Roche	5401119001	Dilute with PBS to a final concentration of 0.25 mg/mL.
Nile tilpia (Oreochromis niloticus)	ProGift Aquaculture Technology Co. Ltd.	NA	Healthy fish with no disease signs (Mean body weight: 100 g).
Phosphate-buffered saline (PBS)	Solarbio Life Sciences	P1020	Store at room temperature.
Refrigerated Centrifuge	Eppendorf	5424	It is used to spin down the tissue and cell petet.
RNase inhibitor	NEB	M0314L	Inhibit RNase activity
Solid-phase RNase-Be-Gone Reagent	Sangon Biotech	B644201-0050	It is used to remove the RNase from tools such as dissecting scissors and glass pipettes. Store at room temperature.
Tricaine methanesulfonate (MS-222)	Sigma-Aldrich	E10521	For fish euthanasia.
Trypan Blue	Invitrogen	C0040	It is used for staining dead cells.
Trypsin	Sangon Biotech	E607001	Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.