Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing

요약

여기에서 우리는 단일 세포 시퀀싱을 위한 틸라피아 장의 고품질 단일 세포 현탁액의 준비를 보여줍니다.

초록

나일 틸라피아는 전 세계적으로 가장 일반적으로 양식되는 민물고기 종 중 하나이며 양식 어류 연구에 널리 사용되는 연구 모델입니다. 고품질 단일 세포 현탁액의 준비는 단일 세포 RNA 또는 게놈 시퀀싱과 같은 단일 세포 수준 연구에 필수적입니다. 그러나 양식 어종, 특히 틸라피아의 장에 대해 즉시 사용할 수 있는 프로토콜은 없습니다. 효과적인 해리 효소는 조직 유형에 따라 다릅니다. 그러므로, 최소한의 손상으로 충분한 생존 세포를 얻기 위해 적절한 효소 또는 효소 조합을 선택함으로써 조직 해리 프로토콜을 최적화하는 것이 필수적이다. 이 연구는 콜라게나제/디스파스의 효소 조합을 사용하여 나일 틸라피아 장에서 고품질 단일 세포 현탁액을 준비하기 위한 최적화된 프로토콜을 보여줍니다. 이 조합은 소화 후 세포 응집을 감소시키기 위해 소 혈청 알부민 및 DNase를 활용하여 해리에 매우 효과적입니다. 세포 출력은 90%의 세포 생존율과 높은 세포 농도로 단일 세포 시퀀싱에 대한 요구 사항을 충족합니다. 이 프로토콜은 또한 다른 어종의 내장으로부터 단세포 현탁액을 제조하기 위해 수정될 수 있다. 이 연구는 효율적인 참조 프로토콜을 제공하고 양식 어종에 대한 단일 세포 현탁액 준비에 대한 추가 시험의 필요성을 줄입니다.

서문

세포는 유기체의 기본 단위입니다. 벌크 조직 연구와 비교했을 때, 단일 세포 수준 연구는 세포 이질성을 반영하고 더 높은 분해능 정보를 제공할 수 있습니다¹. 최근 몇 년 동안 연구자들은 포유류, 제브라피쉬 및 기타 모델 유기체의 단일 세포 수준에서 게놈, 전사체, 후성유전체 또는 다중 오믹 연구를 위한 단일 세포 시퀀싱 기술을 적용했으며 큰 돌파구를 보고했습니다 2,3,4,5,6,7 . 대부분의 연구가 모델 유기체에 초점을 맞추었지만, 경제적인 어종에서 단일 세포 시퀀싱을 위한 참조 프로토콜이나 상업적 해리 키트가 거의 없기 때문에 양식 연구에서 단일 세포 시퀀싱의 적용이 제한됩니다. 따라서 높은 세포 생존율과 핵산 무결성을 가진 고품질 단일 세포 현탁액을 생산하는 조직 해리 프로토콜을 개발하는 것이 중요합니다.

손상을 최소화하면서 충분한 생존 가능한 세포를 얻기 위해 적절한 효소 또는 효소 조합으로 조직 해리 프로토콜을 최적화하는 것이 필수적입니다. 조직 해리에 가장 효과적인 효소는 조직 유형에 따라 다릅니다. 포유류에서 콜라게나제, 디스파스, 트립신, 파파인, 엘라스타제, 히알루로니다제, 리베라제, 아쿠타제 및 트립LE ^8,9를 포함한 여러 효소가 포유류 고형 조직을 위한 단일 세포 현탁액을 제조하는 데 사용되었습니다. 기계적 파괴와 결합된 트립신 소화는 일반적으로 어류의 세포 배양을 위해 조직을 해리하는 데 사용되어 왔다^{10,11,12,13,14}. 트립신은 또한 쥐의 장⁽¹⁵)과 제브라피쉬 아가미 조직(¹⁶)에서 조직 해리를 위해 소화 칵테일에 사용되거나 첨가되었다. 그러나 여러 가지 이유로 트립신은 단일 세포 시퀀싱에 가장 적합한 옵션이 아닙니다. 트립신 단독은 일반적으로 조직 해리에 효과적이지 않습니다. 또한, 트립신은 DNA 가닥 파괴 ^17,18 및 RNA 분해¹⁹를 유도한다.

파파인은 세포 사이의 긴밀한 접합부를 구성하는 단백질을 분해합니다. 포유류의 신경 및 평활근 세포에서 파파인은 다른 프로테아제보다 더 효율적이고 덜 파괴적이다^20,21. 그러나 트립신과 마찬가지로 파파인은 효소 소화 과정에서 발생하는 세포 용해로 인해 유리 DNA에 의한 세포 응집을 일으킨다⁹. 엘라스타제는 엘라스틴을 분해하는데, 엘라스틴은 피부, 폐, 인대, 힘줄, 혈관 조직에서 전형적으로 발견된다²². 폐 조직을 해리하기 위해 콜라게나제(collagenase), 디스파스(dispase) 또는 트립신(trypsin)과 함께 자주 사용된다⁸. 히알루로니다아제는 히알루로난의 글리코시드 결합을 절단하여 다양한 결합 조직과 피부에서 세포외 기질의 소화에 기여합니다 ^9,23.

일반적으로 콜라게나제와 디스파제는 세포외 기질 분해에 좋은 옵션입니다. 그들은 인간, 마우스 및 제브라 피쉬 내장^24,25,26,27의 해리에 사용되었습니다. 콜라게나제는 콜라겐에서 펩타이드 결합을 파괴하고, 세포외 기질의 소화를 촉진하며, 세포를 현탁액으로 방출하므로, 콜라게나제는 간 28,29, 비장^30, 췌장³¹ 및 장²⁵를 포함하여 인간 및 마우스 고형 조직 해리에 자주 사용된다 . Dispaase는 비극성 아미노산 잔기의 N-말단 펩타이드 결합을 가수분해하는 프로테아제이며 콜라게나제보다 온화합니다. 그것은 세포-세포 접합에 영향을 미치지 않고 피브로넥틴, 유형 IV 콜라겐 및 더 적은 정도로 유형 I 콜라겐과 같은 세포외 기질 성분을 절단합니다. Dispase는 장^25,32, 뇌³³, 간 ³⁴ 등과 같은 조직 해리를 위해 별도로 또는 다른 효소와 함께 사용됩니다. 또한, 리베라제(liberase), 아쿠타제(accutase), 트립레(trypLE)를 포함한 시판되는 소화 칵테일은 특히 피부, 간, 신장에 대한 고형 조직 해리를 위한 좋은 대안이다 ^8,9.

나일 틸라피아 (Oreochromis niloticus)는 Perciformes 주문의 Cichlidae 계통에 속한다. 열대 및 아열대 지역에서 가장 많이 양식된 민물고기 종 중 하나로 2022년 연간 생산량이 450만 톤입니다³⁵. 주석이 잘 달린 게놈을 가진 가장 잘 연구된 양식 어종 중 하나입니다. 나일 틸라피아는 짧은 생성 시간, 사육 용이성 및 광범위한 사육 환경에 대한 적응성으로 인해 양식 어종에 대한 이상적인 연구 모델입니다. 장은 영양 소화 및 흡수, 신진 대사 및 점막 면역의 기관이기 때문에 큰 연구 관심을 받고 있습니다. 장은 미생물 개체군의 서식지이며 필수 면역 조직입니다³⁶. 대식세포, B 세포, 과립구 및 T 세포를 포함한 수많은 면역 세포 유형의 존재로 인해 면역학적으로 활성입니다.

현재 연구에서 우리는 양식 어종에 대한 단일 세포 수준 연구를 용이하게 하기 위해 나일 틸라피아 장에서 고품질 단일 세포 현탁액을 준비하기 위한 프로토콜을 개발했습니다. 이러한 조직 특이적 효소의 특성과 예비 연구에 따르면 콜라게나제/디스파아제는 틸라피아 장 조직을 해리하는 데 적합합니다. 단세포 현탁액을 제조할 때 고려해야 할 마지막 효소 유형은 DNase-I이며, 이는 세포사멸 경로를 시작하지 않고 효소 소화 동안 죽은 세포 용해를 통해 방출된 유리 DNA를 분해하여 세포 응집을 방지하고⁹ 살아있는 세포 수율을 증가시킨다³⁶. 또한 소 혈청 알부민(BSA)을 세척 완충액에 첨가하여 세포 응집을 줄이고 세포 생존율을 향상시킵니다. 몇몇 시약 회사는 BSA를 효소 안정제로 설명합니다. PBS(phosphate-buffered saline)에 0.04%-1% BSA를 첨가하여 부작용 없이 단일 세포 시퀀싱 현탁액을 제조하기 위한 세척 용액을 개발하는 데 사용되었습니다³⁸. 낮은 비율의 BSA를 첨가하면 세포 생존율을 유지하고 세포 용해로 인한 세포의 유리 DNA 유도 응집을 방지하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 다른 양식 어종의 장에서 세포 해리 프로토콜을 개발하는 데 유용한 참고 자료를 제공할 수 있습니다.

프로토콜

이 연구 동안 모든 동물 프로토콜은 하이난 대학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회(프로토콜 번호: HNUAUCC-2022-00063; 승인일: 2022-03-03). 이 실험에 사용된 장비 및 소모품 목록은 재료 표에서 찾을 수 있습니다. 현재 프로토콜에 대한 요약은 그림 1에 나와 있습니다.

1. 생선 준비

1. 신뢰할 수 있는 출처에서 평균 체중 100g의 6개월 된 나일 틸라피아를 구하십시오. 질병의 징후가없는 물고기를 선택하십시오.
2. 다음 단계로 진행하기 전에 24 시간 동안 물고기에게 먹이를주지 마십시오.
   참고: 물고기 단식은 장 내용물의 양을 줄이고 장 분절의 준비를 용이하게 합니다.
3. 몸 표면의 느슨하게 결합 된 박테리아를 씻어 내기 위해 잘 통기된 멸균 된 물로 15 분 동안 생선을 헹굽니다.
4. 모든 움직임이 멈출 때까지 약 10분 동안 300mg/L 트리카인 메탄설포네이트(MS-222)로 물고기를 안락사시킵니다.

2. 시약 준비

1. 0.08% BSA-둘베코 인산염 완충 식염수(BSA-DPBS, 세포 헹굼 및 재현탁용)를 준비합니다. 0.08g의 BSA(0.8% w/v)를 1x DPBS 100mL에 녹입니다. 4 °C에서 보관하고 사용 시 얼음 위에서 미리 식히십시오.
   참고: BSA를 첨가하면 세포 응집을 최소화하는 데 도움이 됩니다. BSA 비율은 세포 응집 조건에 따라 0.04%에서 1%로 증가할 수 있습니다.
2. 효소 세포 해리 시약을 준비합니다.
   1. 콜라게나제/디스파아제를 1x PBS로 1mg/mL(0.1U/mL 콜라게나제 및 0.8U/mL 디스파제)의 최종 농도로 희석합니다. DPBS가 아닌 PBS가 사용되는지 확인합니다.
      참고: PBS는 효소가 제대로 기능하는 데 필요한 칼슘 이온을 제공합니다. DPBS는 Ca 2+/Mg²⁺가 없으므로 이 단계에서 사용해서는 안 됩니다. 또한 콜라게나제 유형 I은 현재 프로토콜에서 사용됩니다.
   2. 멸균된 0.22μm 멤브레인 필터를 통해 희석액을 여과합니다.
   3. 95% 부피의 콜라게나제/디스파아제 용액과 5% 부피의 소 태아 혈청(FBS)으로 구성된 세포 해리 시약을 준비합니다.
      알림: 해리 시약은 사용할 때마다 신선하게 만들어야 합니다. 5% FBS를 사용하면 소화 중에 세포 생존력을 유지하는 데 도움이 됩니다.
3. 트리판 블루 용액을 준비합니다.
   1. 4 °C 냉장고에서 트리판 블루 용액을 꺼내 침전을 방지하기 위해 사용하기 전에 몇 분 동안 15-20 °C에 보관하십시오.
   2. 멸균된 0.22μm 멤브레인을 통해 용액을 여과합니다.

3. 장비 준비

1. 사용하기 전에 냉장 원심분리기를 4°C로 미리 냉각하십시오.
2. 멸균 RNase가 없는 1.5mL 원심분리기 튜브, 50mL 원뿔형 튜브, 광구경 유리 피펫 및 팁, 멤브레인 필터, 세포 스트레이너, 모든 저머무름 튜브 및 팁을 구합니다.
3. 집게, 가위, 메스를 포함한 유리 피펫 및 해부 도구를 오토클레이브하고 RNase 제거 용액으로 전처리하여 단일 세포 RNA-seq에 대한 RNase의 부작용을 방지합니다.

4. 조직 해부 및 세포 해리

1. 안락사 된 물고기를 얼음 위에 올려 놓아 해부하십시오. 무균 적으로, 장의 중간 부분의 3-4cm를 모으고 가능한 한 많은 지방과 장간막을 소비하십시오. 장 표면에 부착 된 지방과 집게로 탄력 있고 가단성 있는 맑은 점막 층을 조심스럽게 제거하십시오.
   참고: 지방과 장간막은 장의 외부 표면에 부착되어 있습니다.
2. 해리 프로토콜에 대한 부작용을 방지하기 위해 가능한 한 많은 지방을 제거하십시오. 주사기를 사용하여 멸균 된 얼음처럼 차가운 PBS로 조각을 여러 번 부드럽게 헹구어 장 내용물과 점액을 씻어냅니다. 거친 취급을 피하십시오.
3. 장의 일부를 작은 조각으로 해부하고 얼음처럼 차가운 PBS 1mL로 채워진 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
4. 4°C에서 5분 동안 300× g 으로 원심분리합니다. 상층액을 부드럽게 제거하고 얼음처럼 차가운 0.08% BSA-DPBS 1mL로 교체합니다. 유리 피펫을 사용하여 부드러운 흡인으로 조직 조각을 재현탁하십시오. 이 단계를 두 번 반복합니다.
5. 상층액을 제거하고 효소 해리 시약 1mL(콜라게나제/디스파제 용액 950μL 및 FBS 50μL)를 37°C 수조에서 30-60분 동안 사용하여 조직 조각을 분해합니다.
   1. 또한 샘플이 단일 세포 RNA 시퀀싱을 위해 준비된 경우 해리 시약에 5μL의 RNase 억제제(원액의 경우 40U/μL)를 추가합니다.
      참고: 콜라게나제/디스파아제 혼합물의 최종 농도는 1U/mL의 콜라게나제와 0.1U/mL의 디스파아제를 포함하여 0.8mg/mL입니다.
6. 5-30분 수조 동안 60분 간격으로 튜브를 수동으로 뒤집습니다.
   참고: 정확한 배양 시간은 사용하는 조직에 따라 다릅니다. 벌크 조직이 보이지 않을 때까지 현미경으로 해리 진행 상황을 확인하십시오. 세포 현탁액 10μL를 피펫으로 유리 슬라이드에 놓고 현미경으로 검사합니다. 세포가 완전히 해리되지 않으면 소화 시간을 늘리십시오.
7. 튜브를 300 × g 에서 4 °C에서 5 분 동안 회전시키고 넓은 구멍 팁을 사용하여 효소 세포 해리 시약을 부드럽게 제거합니다. 얼음처럼 차가운 0.08% BSA-DPBS 1mL를 넣고 1분 동안 광구경 유리 피펫을 사용하여 세포를 위아래로 부드럽게 피펫팅합니다.
   1. 이 단계를 두 번 반복합니다.
      알림: 피펫팅은 세포 파괴를 방지하기 위해 광시야 및 저보유 팁을 사용하여 주의해서 수행해야 합니다.
8. 0.08% BSA-DPBS로 40μm 셀 스트레이너를 미리 적시고 50mL 원뿔형 튜브에 넣습니다. 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 통과시킵니다. 추가 200μL DPBS로 두드리고 헹구고 튜브 바닥에 현탁액을 수집합니다.
9. 현탁액을 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 5 μL의 DNase I (1 U/μL)를 첨가하고, 15-20 °C에서 15 분 동안 배양한다. 4°C에서 5분 동안 300× g 에서 원심분리합니다.
10. 상청액을 제거하고 400μL의 얼음처럼 차가운 DPBS(Ca 2+/Mg²⁺ 유리)에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 세포를 혼합하기 위해 넓은 구멍 팁으로 위아래로 부드럽게 피펫팅합니다. 이 단계를 두 번 반복합니다.

5. 염색 및 현미경 검사

1. 염색을 위해 세포 현탁액을 0.4% 트리판 블루 용액과 1:1 비율로 혼합합니다. 실온에서 3분 동안 배양합니다.
2. 혼합물 5-10 μL를 혈구계에 넣고 현미경으로 검사합니다.
   참고: 생존 세포는 염색되지 않은 세포질을 갖는 반면, 죽은 세포는 파란색 세포질을 갖습니다(그림 2).
3. 현미경으로 세 가지 다른 분야에서 생존 가능한 세포와 죽은 세포를 계산합니다. 세포 생존율 백분율을 계산하려면 생존 가능한 세포의 수를 필드의 총 세포 수로 나눕니다.
   참고: 세포 생존율은 85% 이상이어야 하며 세포 농도는 1 x 10^5-1 x 10⁷/mL 이상이어야 합니다. 세포 현탁액 배경은 덩어리, 파편 또는 불순물 없이 깨끗해야 합니다.

결과

이 프로토콜은 단일 세포 시퀀싱을 위한 나일 틸라피아 장의 고품질 단일 세포 현탁액의 준비를 설명합니다(그림 1). 이 연구는 콜라게나제/디스파아제 혼합물이 좋은 해리 효과를 가지며 장 조직에 경미하다는 것을 보여줍니다. 최적의 소화 효소의 선택은 고품질 단일 세포 현탁액을 준비하는 데 필수적입니다. 예비 연구에서는 일반적으로 사용되는 여러 효소의 해리 효율?...

토론

이 프로토콜은 나일 틸라피아 장의 고품질 단일 세포 현탁액의 제조를 설명합니다. 해리하기 전에 장에서 지방과 장간막을 제거하는 것이 필요하며, 특히 지방이 많은 육식성 생선 내장의 경우 더욱 그렇습니다. 장 내용물을 씻어 내기 위해 딱딱하게 긁는 대신 주사기를 사용하면 세포의 기계적 손상을 줄일 수 있습니다. 세포 생존율을 보장하기 위해서는 조직 해부 및 헹굼 단계를 위해 온도를 20...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22-μm Sterile Filter	Solarbio Life Sciences	SLGV033RB	It is used to filter and sterilize the enzyme solution.
40-μm Cell Strainer	Solarbio Life Sciences	F8200	Cell Strainer is applied to eliminate undigested tissue pieces.
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	SRE0098	Powder; dilute 0.04 g BSA with 100 mL 1× DPBS to prepare 0.04% BSA-DPBS washing bffer. Store at 2 - 8 °C.
Collagenase II	Sangon Biotech	A004202	Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
Collagenase/dispase	Roche	10269638-001	Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
Dispase	Sigma-Aldrich	D4818	Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
DNase I	Sigma-Aldrich	AMPD1	DNase I helps reduce cell clumping.
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+/Mg2+-free	Solarbio Life Sciences	E607009-0500	Store at room temperature.
Elastase	Sangon Biotech	A600438	Dilute with PBS to a final concentration of 0.5 mg/mL.
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	16000-044	Serum, used at volume of 5% in digetstion solution.
Inverted Microscope	Leica	qTOWER3G	It is used to examine cell viability.
Liberase	Roche	5401119001	Dilute with PBS to a final concentration of 0.25 mg/mL.
Nile tilpia (Oreochromis niloticus)	ProGift Aquaculture Technology Co. Ltd.	NA	Healthy fish with no disease signs (Mean body weight: 100 g).
Phosphate-buffered saline (PBS)	Solarbio Life Sciences	P1020	Store at room temperature.
Refrigerated Centrifuge	Eppendorf	5424	It is used to spin down the tissue and cell petet.
RNase inhibitor	NEB	M0314L	Inhibit RNase activity
Solid-phase RNase-Be-Gone Reagent	Sangon Biotech	B644201-0050	It is used to remove the RNase from tools such as dissecting scissors and glass pipettes. Store at room temperature.
Tricaine methanesulfonate (MS-222)	Sigma-Aldrich	E10521	For fish euthanasia.
Trypan Blue	Invitrogen	C0040	It is used for staining dead cells.
Trypsin	Sangon Biotech	E607001	Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.