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要約

マラカイトグリーンアッセイプロトコルは、ヒートショックタンパク質90(Hsp90)サプレッサー、およびATP依存性酵素に対する他の阻害剤化合物を発見するための簡単で費用効果の高い方法です。

要約

ヒートショックタンパク質90(Hsp90)は、複数の発癌性タンパク質に対するシャペロン効果があるため、有望な抗がん標的です。Hsp90の活性は、アデノシン三リン酸(ATP)をアデノシン二リン酸(ADP)および遊離リン酸に加水分解する能力に依存します。Hsp90のATPアーゼ活性は、そのシャペロン機能に関連しています。ATPはHsp90のN末端ドメインに結合し、その結合を破壊することがHsp90の機能を抑制する上で最も成功した戦略であることがわかった。ATPアーゼ活性は、ATP加水分解によって形成される遊離リン酸の量を決定する比色マラカイトグリーンアッセイによって測定することができる。ここでは、マラカイトグリーンリン酸測定キットを用いて酵母Hsp90のATPase活性を測定する手順について説明する。さらに、ゲルダナマイシンを真正な阻害剤として服用することによるHsp90阻害剤の発見のための詳細な指示書が提供される。最後に、酵母Hsp90に対する阻害剤分子のハイスループットスクリーニング(HTS)を介したこのアッセイプロトコルの適用について説明します。

概要

ヒートショックタンパク質90(Hsp90)は、癌の発症と進行に関与するタンパク質の安定性を維持する分子シャペロンです。さらに、抗悪性腫瘍剤に対する耐性の発達に関与するタンパク質もHsp901のクライアントである。Hsp90は、全タンパク質の2%未満を占める可能性のある正常細胞と比較して、すべての癌細胞タイプ(細胞タンパク質の>90%)に遍在的に過剰発現しています。さらに、がん細胞のHsp90はコシャペロンとの複合体に存在しますが、正常細胞では、主に遊離で複合体のない状態で存在します2,3。近年、いくつかのHsp90阻害剤が、インビトロおよびインビボ研究において老化細胞除去効果を有することが実証されており、マウスの寿命を有意に改善している4,5,6。前述のすべての発見は、Hsp90阻害剤が複数の種類の癌に有効であり、副作用が少なく、耐性を発症する可能性が低いという事実を実証しています。Hsp90のシャペロン機能は、Hsp90のN末端ドメインにATPを結合し、それをADPと遊離リン酸に加水分解することによって達成されます7。Hsp90のATP結合ポケットに競合的に結合する低分子は、タンパク質のシャペロン化効果を抑制することに成功した。今日まで、これはHsp90阻害のための最良の戦略であり、そのような阻害剤が臨床試験に達したという事実によって裏付けられています8。そのうちの1つであるピミテスピブは、2022年6月に消化管間質腫瘍(GIST)の治療薬として日本で承認されました9。これは、シャペロンの創薬性が1994年に確立されて以来、承認された最初のHsp90阻害剤です10。

マラカイトグリーンアッセイは、無機リン酸塩を検出するためのシンプルで高感度、高速かつ安価な手順であり、目的のターゲットに対する化合物の自動化およびハイスループットスクリーニング(HTS)に適しています11。このアッセイは、小規模なラボスケールのセットアップやHTS 12、13、14、15、16、17でのHsp90阻害剤のスクリーニングに成功しています。このアッセイは、Hsp90のATPアーゼ活性により形成される遊離無機リン酸を測定する比色法を使用します。この定量の基礎は、遊離リン酸とモリブデンの間にリンモリブデン酸錯体が形成され、その後マラカイトグリーンと反応して緑色を生成することです(図1)。この急速な発色は、分光光度計またはプレートリーダー上で、600〜660nmの間で測定される18,19。

本プロトコールでは、酵母Hsp90を用いたマラカイトグリーンアッセイを実施する手順およびその後のシャペロンに対する阻害剤の同定が記載されている。Hsp90の創薬性が最初に確立された天然物分子であるゲルダナマイシン(GA)は、本物の阻害剤として摂取されました10。HTSは、テスト用の多数の分子が利用可能であるため、現在の創薬プログラムの不可欠な部分になっています。この技術は、Covid-19感染症を治療するための薬物の転用が緊急に必要であるため、過去2年間でより重要性を増しています20,21。そこで、マラカイトグリーンアッセイ法を採用した酵母Hsp90タンパク質に対するHTSの分子について詳細な概要が提示される。

プロトコル

1.ラボスケールのマラカイトグリーンアッセイ

  1. アッセイバッファーの調製
    1. アッセイバッファーを調製し、 表1に示す組成および調製物に従って調製する。
  2. リン酸塩標準物質の作成
    1. マラカイトグリーンアッセイリン酸塩アッセイキットで提供される1 mMリン酸標準を使用してください(4°Cで保存)。
    2. 960 μLの超純水に1 mMリン酸標準物質40 μLをピペットで入れ、40 μMリン酸溶液(プレミックス溶液)を得た。製造元の指示に従って、プレミックス溶液を超純水を加えて、0〜40μMのリン酸塩の段階希釈を形成します。
  3. 酵母Hsp90の調製
    1. グリセロールストック濃度が0.66 mg / mLの酵母Hsp90を使用してください。使用直前に氷上で解凍してください。
    2. 測定可能なATPアーゼ活性を得るには、8 μL(5.98 μg、0.80 μM)の酵母Hsp90を使用してください。ブランクとポジティブコントロールの間のマラカイトグリーン試薬添加後の光学濃度差が0.5以上1.0未満であることを確認してください。ここで、ブランク(Hsp90なし)とポジティブコントロール(Hsp90あり)の吸光度差は0.510であることがわかった。
  4. ATPの準備
    1. 453.39 μLの超純水を含むバイアルに1 mgのATPを移し、4 mMのストック溶液を得た。無水ATPに基づいて重量計算を実行します(分子量[m.w.] = 551.14)。ATPは時間の経過とともに自然に加水分解する可能性があるため、新鮮に準備します。
    2. 各ウェルに4 μLのATPストック溶液を加え、最終ウェル濃度0.2 mM(最終総アッセイウェル容量80 μL)を得た。マルチチャンネルピペットを使用して、反応の最後の成分としてATPを追加し、すべての反応が同時に開始されるようにします。
  5. ゲルダナマイシン(GA)の調製
    1. 1 mgを178.37 μLのDMSOに溶解して、10 mMのGAストックを調製します(m.w. = 560.64)。ストック溶液を使用して、連続希釈によりDMSO中の4 mM、0.8 mM、0.16 mM、0.032 mM、0.0064 mM、および0.00128 mM溶液を調製します。
    2. これらのストック溶液を各ウェルに2 μL添加し、それぞれ0.1 mM、0.02 mM、0.004 mM、0.0008 mM、0.00016 mM、および0.000032 mMの最終ウェル濃度を得ます。
    3. 表 2 および 表3に記載のようにウェルを準備し、ブランク(緩衝液+水+DMSO)および陰性対照(Hsp90緩衝液+水+DMSO)を含むウェルを調製する。GA(緩衝液+水+GA中のHsp90)を含むウェルは、ポジティブコントロールとして機能します。
  6. ウェルプレートの調製と添加順序
    1. 表2に示すレイアウトで96ウェルプレートを準備します。620nmで吸光度を示す化合物については、この波長の吸光度を記録するための別のウェルを調製する。GAはアッセイで使用された濃度に対して620 nmの吸光度を示さないため、GA用に別のウェルを調製しないでください。
    2. 表3に示すように、各成分の総体積で各成分を準備します。
    3. 各ウェルに超純水を添加してアッセイウェルを設置します。これに続いて、必要量のアッセイバッファーと化合物溶液(GA溶液など)を追加します。
    4. 次に、Hsp90を適切なウェルに加え、プレートシェーカーで室温で2分間プレートを振とうします。
    5. マルチチャンネルピペットを使用して4 μLのATP溶液を追加します。プレートをアルミホイルで包み、プレートシェーカー(200 rpm)で室温で2分間振とうします。プレートを37°Cで3時間インキュベートします。
  7. マラカイトグリーン試薬の調製と添加
    1. マラカイトグリーン試薬は、試薬A(3M HCl中のモリブデン酸アンモニウム)およびB(マラカイトグリーンおよびポリビニルアルコール)からなる。使用前に試薬を室温に戻してください。試薬AとBを100:1の比率(1,000 μL:10 μL)で混合します。不安定で3時間後に分解が始まるため、使用前3時間以内に準備してください。
    2. ステップ1.6.5の3時間後、マルチチャンネルピペットを使用して、ATPと同じ順序で添加した20 μLのマラカイトグリーン試薬を加えて反応を停止します。
    3. 室温で15分間インキュベートした後、プレートリーダーで620 nmにおけるプレートの吸光度を測定します。

2. マラカイトグリーンアッセイによるHsp90阻害剤のハイスループットスクリーニング

注:ハイスループットスクリーニングのプロトコルは、ラボスケールの方法論に似ています。いずれの場合も最終的なウェル容量は80μLです。ただし、試薬の添加順序には若干の違いがあります。ラボスケールベースの方法では、溶液添加の5段階があります(34 μLの水、32 μLのバッファー、2 μLのDMSO溶液中の化合物、8 μLのHsp90、そして最後に4 μLのATP溶液)。対照的に、HTSでは、3段階の添加があります(酵母Hsp90を含む緩衝液40 μL、化合物を含む18 μLの水に2 μLのDMSO、最後に水に溶解した20 μLのATP)。HTSセットアップで正確にピペッティングできる溶液の最小量は20μLです。 したがって、ラボスケールとHTSスケールの間でピペッティングの違いが観察されます。

  1. アッセイバッファー(pH 7.4)の調製
    1. HTSでは、ラボスケールのマラカイトグリーンアッセイと同じバッファーを使用します(表1)。
  2. 酵母Hsp90の調製
    1. グリセロールストック濃度が0.66 mg / mLのタンパク質を使用してください。.使用直前に氷上で解凍してください。
    2. 測定可能なATPアーゼ活性を提供する酵母Hsp90を各ウェルに8 μL(5.98 μg、0.80 μM)使用します。
    3. 各ウェルのバッファー(32 μL)でタンパク質(8 μL)を希釈します。各ウェルの最終的な総作業量は、総アッセイ容量80 μLで40 μLです。
  3. 0.8 mM ATPの調製
    1. 1 mgのATPを2,267 μLの蒸留水に溶解し、0.8 mMの溶液を得る。各ウェルの総作業量は、80 μLの総アッセイ容量で20 μLです。
  4. ゲルダナマイシン(GA)/試験化合物の調製
    1. ステップ1.5のように、DMSOで0.8 mMのGAストックを準備します。GAストック10 μLを90 μLの水で希釈し、最終濃度80 μMにします。
    2. 20 μLの80 μM GA溶液を適切なアッセイウェル(最終総アッセイウェル容量=80 μL)で使用し、最終ウェル濃度を20 μMにします。これはポジティブコントロールとして機能します。
    3. 試験化合物については、評価に必要な濃度に従ってDMSO溶液を準備します。
    4. ブランク(バッファー+水+DMSO)およびネガティブコントロールウェル(Hsp90バッファー+水+DMSO)に添加するために、90 μLの水中に10 μLのDMSOを調製します。同様の方法で、100 μMの最終ウェル濃度で試験化合物を調製します。
  5. アッセイプレートの設計と添加順序
    1. 4つのメインプレート、1つのコンパウンドプレート、および試薬ストックを含む4つの添加プレートを使用してアッセイをセットアップします(図2 および 表4)。
    2. さらに、プレートAに、各ウェルに90 μLのアッセイバッファーを加える;プレートBを加えて、各ウェルにHsp90を含む90 μLのバッファーを追加します。プレートCおよびDを添加し、各ウェルにそれぞれ90μLのATPおよび90μLのマラカイトグリーン試薬を添加する(表5 および 表6)。
    3. 添加プレートAとプレートBから、自動マルチチャンネル分注システムを使用して、各ウェルからそれぞれメインプレート1と2、および3と4に40 μLの溶液を移します。ここでは、Biomek(R) FXP ラボラトリーオートメーションワークステーションを使用しました(図2 および 表6)。
    4. コンパウンドプレートの各ウェルから、20 μLの溶液をメインプレート1、2、3、および4に移します(図2)。プレートをシェーカー(200 rpm)で1分間振とうします。
    5. 添加プレートC(ATP)の各ウェルから、20 μLの溶液をメインプレート1、2、3、および4に移します(図2)。プレートをシェーカー(200 rpm)で1分間振とうします。
    6. プレートを37°Cで3時間インキュベートします。
    7. ステップ1.7に従ってマラカイトグリーン試薬を準備します。3時間後、20 μLのマラカイトグリーン試薬を追加プレートDからメインプレート1、2、3、4のウェルに移します(図2)。
    8. 室温で15分間インキュベートした後、プレートリーダーで620nmであるプレートの吸光度を測定する。

結果

アッセイの結果は、遊離リン酸イオン濃度による吸光度の観点から解釈される。620 nmでの酵母Hsp90によるATP加水分解による遊離リン酸による吸光度は、100%ATPase活性、またはゼロパーセントタンパク質阻害と見なされます。タンパク質の阻害はATP加水分解の停止をもたらす(遊離リン酸が少ない)。これは、620nmでの吸光度の低下という点で反映されます。

ラボスケー?...

ディスカッション

Hsp90は、新規抗がん剤分子の発見のための重要な標的である。1994年に創薬性が確立されて以来、10、18分子が臨床試験に達しています。現在、7つの分子が単独で、または組み合わせて、臨床試験のさまざまな段階にあります22。このような小分子はすべてN末端ATP結合阻害剤である。シャペロンを阻害する他の手段(C末端阻害剤、ミドルドメイン阻害剤)は、N?...

開示事項

競合する金銭的利益はありません。

謝辞

この研究は、科学情報通信部(NRF-2019H1D3A1A01102952)の資金提供を受けた韓国国立研究財団(NRF)のポスドクフェローである韓国研究フェローシップ(KRF)プログラムの支援を受けました。著者らは、KISTの壁内助成金と海洋水産省の助成金番号2MRB130に、このプロジェクトに財政支援を提供してくれたことに感謝しています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1M Magnesium chloride solution in waterSigma-Aldrich63069-100ml
1M Potassium chloride solution in waterSigma-Aldrich60142-100ml
96-well plateSPL Life SciencesNot applicable
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrateSigma-AldrichA7699-5G
Biomek FX laboratory automation workstationBeckman CoulterNot applicable
Compounds 3-96Not applicableNot applicableHistidine tagged yeast Hsp90 was obtained from Dr. Chrisostomos Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom, and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Details cannot be disclosed due to patent infringement issues.
Dimethyl sulfoxideSigma-AldrichD8418
Geldanamycin, 99% (HPLC), powderAK Scientific, Inc.V2064
Invitroge UltraPure DNase/RNase-Free Distilled WaterThermoFisher Scientific10977015
Malachite Green Phosphate Assay  Assay kitSigma-AldrichMAK307-1KT
Multi-Detection Microplate Reader Synergy HTBiotek Instruments, Inc.Not applicable
Synergy HT multi-plate readerBiotek Instruments, Inc.Not applicable
Trizma hydrochloride buffer solution, pH7.4Sigma-Aldrich93313-1L
Yeast Hsp90Not applicableNot applicableSchool of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Primary Accession number: P02829

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