열충격 단백질 90 억제제 발견을 위한 말라카이트 그린 분석

요약

말라카이트 그린 분석 프로토콜은 열충격 단백질 90(Hsp90) 억제 인자 및 ATP 의존성 효소에 대한 기타 억제제 화합물을 발견하는 간단하고 비용 효율적인 방법입니다.

초록

열충격 단백질 90(Hsp90)은 여러 발암성 단백질에 대한 샤페로닝 효과로 인해 유망한 항암 표적입니다. Hsp90의 활성은 아데노신 삼인산(ATP)을 아데노신 이인산(ADP) 및 유리 인산염으로 가수분해하는 능력에 따라 다릅니다. Hsp90의 ATPase 활성은 보호자 기능과 관련이 있습니다. ATP는 Hsp90의 N-말단 도메인에 결합하고, 그 결합을 방해하는 것이 Hsp90 기능을 억제하는 가장 성공적인 전략인 것으로 밝혀졌습니다. ATPase 활성은 ATP 가수 분해에 의해 형성된 유리 인산염의 양을 결정하는 비색 말라카이트 그린 분석에 의해 측정 될 수있다. 여기서, 말라카이트 그린 포스페이트 분석 키트를 사용하여 효모 Hsp90의 ATPase 활성을 결정하는 절차가 설명된다. 또한, 겔다나마이신을 진정한 억제제로 복용하여 Hsp90 억제제를 발견하기 위한 자세한 지침이 제공됩니다. 마지막으로, 효모 Hsp90에 대한 억제제 분자의 고처리량 스크리닝(HTS)을 통한 이 분석 프로토콜의 적용에 대해 논의합니다.

서문

열충격 단백질 90(Hsp90)은 암의 발병 및 진행을 담당하는 단백질의 안정성을 유지하는 분자 샤페론입니다. 또한, 항종양제에 대한 내성 발달을 담당하는 단백질도 Hsp90의 고객이다¹. Hsp90은 전체 단백질의 2% 미만을 구성할 수 있는 정상 세포와 비교하여 모든 암세포 유형(세포 단백질의 >90%)에서 유비쿼터스로 과발현됩니다. 더욱이, 암세포의 Hsp90은 공동 샤페론과 복합체에 존재하는 반면, 정상 세포에서는 주로 자유롭고 복합체가 없는 상태로 존재합니다 ^2,3. 최근 몇 년 동안, 몇몇 Hsp90 억제제는 시험관 내 및 생체 내 연구에서 세놀리틱 효과를 갖는 것으로 입증되었으며, 여기서 마우스의 수명을 크게 향상시켰습니다 ^4,5,6. 앞서 언급한 모든 발견은 Hsp90 억제제가 부작용이 적고 내성 발생 가능성이 감소하면서 여러 암 유형에 효과적일 수 있다는 사실을 입증합니다. Hsp90의 샤페로닝 기능은 Hsp90의 N-말단 도메인에서 ATP를 결합하고 이를 ADP와 유리 인산염⁷로 가수분해함으로써 달성됩니다. Hsp90의 ATP 결합 포켓에 경쟁적으로 결합하는 작은 분자는 단백질의 샤페로닝 효과를 성공적으로 억제하는 것으로 밝혀졌습니다. 현재까지, 이것은 Hsp90 억제를 위한 최선의 전략으로 남아 있으며, 이는 이러한 억제제가 임상 시험에 도달했다는 사실에 의해 뒷받침된다⁸. 그 중 하나인 Pimitespib은 2022년 6월 일본에서 위장관 기질 종양(GIST) 치료제로 승인되었습니다⁹. 이는 샤페론의 약물성이 1994년에 확립된 이후 승인된 최초의 Hsp90 억제제이다¹⁰.

말라카이트 그린 분석법은 무기 인산염의 검출을 위한 간단하고, 민감하며, 빠르고, 저렴한 절차로, 원하는 표적에 대한 화합물의 자동화 및 고처리량 스크리닝(HTS)에 적합하다¹¹. 이 분석은 HTS 12,13,14,15,16,17뿐만 아니라 소규모 실험실 규모 설정에서 Hsp90 억제제의 스크리닝에 성공적으로 사용되었습니다. 이 분석은 Hsp90의 ATPase 활성으로 인해 형성된 유리 무기 인산염을 결정하는 비색법을 사용합니다. 이 정량화의 기초는 유리 인산염과 몰리브덴 사이에 인산염 분해 화합물이 형성되는 것이며, 이는 이후 말라카이트 그린과 반응하여 녹색을 생성합니다(그림 1). 이 빠른 색 형성은 분광 광도계 또는 플레이트 리더에서 600-660 nm^18,19 사이에서 측정됩니다.

본 프로토콜에서, 효모 Hsp90을 이용한 말라카이트 그린 분석을 수행하는 절차 및 샤페론에 대한 억제제의 후속 확인이 기재되어 있다. Hsp90의 약물성이 처음으로 확립된 천연물 분자인 겔다나마이신(geldanamycin, GA)은 진정한 억제제로 간주되었다¹⁰. HTS는 테스트를 위해 많은 수의 분자를 사용할 수 있기 때문에 현재 약물 발견 프로그램의 필수적인 부분이 되었습니다. 이 기술은 Covid-19 감염 치료를 위한 약물의 용도 변경이 시급하기 때문에 지난 2년 동안 더 중요해졌습니다^20,21. 따라서, 말라카이트 그린 분석법을 채택하여 효모 Hsp90 단백질에 대한 분자의 HTS에 대한 상세한 개요가 제시된다.

프로토콜

1. 실험실 규모의 말라카이트 그린 분석

1. 분석 완충액의 제조
   1. 표 1에 제시된 조성 및 제제에 따라 분석 완충액을 준비한다.
2. 인산염 표준물질의 제조
   1. 말라카이트 그린 분석 포스페이트 분석 키트(4°C에서 보관)에 제공된 1 mM 포스페이트 표준물을 사용한다.
   2. 960 μL의 초순수에 40 μL의 1 mM 인산염 표준물질을 피펫으로 피펫하여 40 μM 인산염 용액(premix solution)을 얻었다. 제조업체의 지침에 따라 초순수로 프리믹스 용액을 첨가하여 0에서 40 μM까지 인산염의 연속 희석액을 형성합니다.
3. 효모 Hsp90의 제조
   1. 글리세롤 스톡 농도가 0.66mg/mL인 효모 Hsp90을 사용하십시오. 사용 직전에 얼음에 해동하십시오.
   2. 측정 가능한 ATPase 활성을 위해 8 μL (5.98 μg, 0.80 μM)의 효모 Hsp90을 사용하십시오. 블랭크와 양성 대조군 사이의 말라카이트 그린 시약 첨가 후 광학 밀도 차이가 0.5 이상 1.0 미만인지 확인하십시오. 여기서, 블랭크(Hsp90 없음)와 양성대조군(Hsp90 포함)의 흡광도 차이는 0.510으로 나타났다.
4. ATP의 제조
   1. ATP 1mg을 초순수 453.39μL가 들어 있는 바이알에 옮겨 4mM의 원액을 얻습니다. 무수 ATP(분자량[m.w.] = 551.14)를 기준으로 중량 계산을 수행합니다. ATP는 시간이 지남에 따라 자발적으로 가수분해될 수 있으므로 신선하게 준비하십시오.
   2. 4 μL의 ATP 저장 용액을 각 웰에 첨가하여 0.2 mM의 최종 웰 농도 (최종 총 분석 웰 부피 80 μL)를 수득하였다. 모든 반응이 동시에 시작되도록 멀티채널 피펫을 사용하여 ATP를 반응의 마지막 성분으로 추가합니다.
5. 겔다나마이신(GA)의 제조
   1. 1 mg을 178.37 μL의 DMSO (m.w. = 560.64)에 용해시켜 GA의 10 mM 스톡을 준비한다. 원액을 사용하여 연속 희석하여 DMSO 중 4mM, 0.8mM, 0.16mM, 0.032mM, 0.0064mM 및 0.00128mM 용액을 준비합니다.
   2. 이들 저장 용액 2μL를 각 웰에 첨가하여 각각 0.1mM, 0.02mM, 0.004mM, 0.0008mM, 0.00016mM 및 0.000032mM의 최종 웰 농도를 얻습니다.
   3. 표 2 및 표 3에 기재된 바와 같이 웰을 준비하고, 웰은 블랭크 (완충액 + 물 + DMSO) 및 음성 대조군 (완충액 + 물 + DMSO 중 Hsp90)을 함유한다. GA(완충액 중 Hsp90 + 물 + GA)를 함유한 웰은 양성 대조군 역할을 합니다.
6. 웰 플레이트 준비 및 첨가 순서
   1. 표 2에 제시된 레이아웃으로 96웰 플레이트를 준비합니다. 620nm에서 흡광도를 나타내는 화합물의 경우 이 파장에서 흡광도를 기록하기 위한 별도의 웰을 준비합니다. GA는 분석에 사용된 농도에 대해 620nm에서 흡광도를 나타내지 않으므로 GA에 대해 별도의 웰을 준비하지 마십시오.
   2. 표 3에 제시된 바와 같이 각 성분의 총 부피로 각 성분을 준비하십시오.
   3. 각 웰에 초순수를 추가하여 분석 웰을 설정합니다. 그런 다음 필요한 양의 분석 완충액과 복합 용액(예: GA 용액)을 추가합니다.
   4. 그런 다음 Hsp90을 적절한 웰에 넣고 실온에서 플레이트 셰이커에서 플레이트를 2분 동안 흔듭니다.
   5. 다중 채널 피펫을 사용하여 4 μL의 ATP 용액을 추가합니다. 플레이트를 알루미늄 호일로 감싸고 실온에서 플레이트 셰이커(200rpm)에서 2분 동안 흔듭니다. 플레이트를 37°C에서 3시간 동안 인큐베이션합니다.
7. 말라카이트 그린 시약의 준비 및 첨가
   1. 말라카이트 그린 시약은 시약 A(3M HCl 중 몰리브덴산암모늄)와 B(말라카이트 그린 및 폴리비닐 알코올)로 구성됩니다. 사용하기 전에 시약을 실온에 두십시오. 시약 A와 B를 100:1 비율(1,000 μL:10 μL)로 혼합합니다. 불안정하고 3시간 후에 분해되기 시작하므로 사용하기 전에 3시간 이내에 준비하십시오.
   2. 1.6.5 단계의 3 시간 후, 다중 채널 피펫을 사용하여 ATP와 동일한 순서로 첨가 된 말라카이트 그린 시약 20 μL를 첨가하여 반응을 중지합니다.
   3. 상온에서 15분간 배양한 후, 플레이트 리더에서 620 nm에서 플레이트의 흡광도를 측정하였다.

2. 말라카이트 그린 분석법에 의한 Hsp90 억제제의 고처리량 스크리닝

참고: 고처리량 스크리닝을 위한 프로토콜은 실험실 규모의 방법론과 유사합니다. 각 경우의 최종 웰 부피는 80μL입니다. 그러나, 시약의 첨가 순서에는 약간의 차이가 있다. 실험실 규모 기반 방법에는 5 단계의 용액 첨가 (물 34 μL, 완충액 32 μL, DMSO 중 화합물 2 μL, Hsp90 8 μL, 마지막으로 ATP 용액 4 μL)가 있습니다. 대조적으로, HTS의 경우 3 단계의 첨가가 있습니다 (효모 Hsp90을 함유 한 완충 용액 40 μL, 화합물을 함유 한 물 18 μL에 DMSO 2 μL, 마지막으로 물에 용해 된 ATP 20 μL). HTS 설정에서 정확하게 피펫팅할 수 있는 용액의 최소량은 20 μL입니다. 따라서 실험실 스케일과 HTS 스케일 간의 피펫팅 차이가 관찰됩니다.

1. 분석 완충액(pH 7.4)의 제조
   1. HTS에서 실험실 규모의 말라카이트 그린 분석과 동일한 완충액을 사용합니다(표 1).
2. 효모 Hsp90의 제조
   1. 글리세롤 스톡 농도가 0.66mg/mL인 단백질을 사용하십시오. 사용 직전에 얼음에 해동하십시오.
   2. 각 웰에 8 μL (5.98 μg, 0.80 μM)의 효모 Hsp90을 사용하면 측정 가능한 ATPase 활성을 얻을 수 있습니다.
   3. 단백질(8 μL)을 각 웰의 완충액(32 μL)에 희석한다. 각 웰의 최종 총 작업 부피는 80 μL의 총 분석 부피에서 40 μL입니다.
3. 0.8 mM ATP의 제조
   1. ATP 1mg을 증류수 2,267μL에 용해시켜 0.8mM 용액을 얻습니다. 각 웰의 총 작업 부피는 80 μL의 총 분석 부피에서 20 μL입니다.
4. 겔다나마이신(GA)/시험 화합물의 제조
   1. 단계 1.5에서와 같이 DMSO에서 0.8 mM GA 스톡을 준비한다. GA 스톡 10μL를 물 90μL로 희석하여 최종 농도 80μM을 제공합니다.
   2. 적절한 분석 웰(최종 총 분석 웰 부피 = 80μL)에 80μM의 GA 용액 20μL를 사용하여 최종 웰 농도 20μM을 제공합니다. 이것은 양성 대조군 역할을 합니다.
   3. 테스트 화합물의 경우 평가를 위해 원하는 농도에 따라 DMSO에서 용액을 준비합니다.
   4. 블랭크(완충액 + 물 + DMSO) 및 음성 대조군 웰(완충액 + 물 + DMSO의 Hsp90)에 추가하기 위해 물 90μL에 10μL의 DMSO를 준비합니다. 100 μM 최종 웰 농도에서 유사한 방식으로 시험 화합물을 준비한다.
5. 분석 플레이트 설계 및 첨가 순서
   1. 4개의 메인 플레이트, 1개의 복합 플레이트 및 시약 스톡이 포함된 4개의 첨가 플레이트를 사용하여 분석을 설정합니다(그림 2 및 표 4).
   2. 또한, 플레이트 A, 90 μL의 분석 완충액을 각 웰에 첨가하고; 플레이트 B에 추가하여, 각 웰에 Hsp90을 갖는 90 μL의 완충액을 첨가하고; 플레이트 C 및 D에 추가하여, 각각 90 μL의 ATP 및 90 μL의 말라카이트 그린 시약을 각 웰에 첨가한다 (표 5 및 표 6).
   3. 첨가 플레이트 A와 플레이트 B에서 자동 멀티채널 분주 시스템을 사용하여 각 웰에서 각각 메인 플레이트 1과 2, 3과 4로 40μL의 용액을 옮깁니다. 여기서는 Biomek(^R) FX^P 실험실 자동화 워크스테이션을 사용했습니다(그림 2 및 표 6).
   4. 복합 플레이트의 각 웰에서 20μL의 용액을 메인 플레이트 1, 2, 3 및 4로 옮깁니다(그림 2). 플레이트를 셰이커(200rpm)에서 1분 동안 흔듭니다.
   5. 첨가 플레이트 C(ATP)의 각 웰에서 20μL의 용액을 메인 플레이트 1, 2, 3 및 4로 옮깁니다(그림 2). 플레이트를 셰이커(200rpm)에서 1분 동안 흔듭니다.
   6. 플레이트를 37°C에서 3시간 동안 인큐베이션한다.
   7. 1.7단계에 따라 말라카이트 그린 시약을 준비합니다. 3시간 후, 말라카이트 그린 시약 20μL을 첨가 플레이트 D에서 메인 플레이트 1, 2, 3 및 4의 웰로 옮깁니다(그림 2).
   8. 상온에서 15분간 배양한 후, 플레이트 리더로 620 nm에서 플레이트의 흡광도를 측정하였다.

결과

분석의 결과는 유리 인산 이온 농도에 의한 흡광도 측면에서 해석됩니다. 620 nm에서 효모 Hsp90에 의한 ATP 가수 분해로 인한 유리 인산염에 의한 흡광도는 100 % ATPase 활성 또는 0 % 단백질 억제로 간주됩니다. 단백질의 억제는 ATP 가수 분해 (유리 인산염 감소)의 중단으로 이어진다. 이는 620nm에서 감소된 흡광도 측면에서 반영됩니다.

실험실 규모의 말라카이트 그린 분석 결?...

토론

Hsp90은 새로운 항암제 분자 발견의 중요한 표적입니다. 1994 년에 약물 성이 확립 된 이래¹⁰, 18 개의 분자가 임상 시험에 도달했습니다. 현재 7 개의 분자가 단독으로 또는²² 개의 조합으로 다양한 임상 시험 단계에 있습니다. 이러한 모든 소분자는 N-말단 ATP 결합 억제제입니다. 샤페론을 억제하는 다른 수단(C-말단 억제제, 중간 도메인 억제제)은 N-말단 억제제만큼...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1M Magnesium chloride solution in water	Sigma-Aldrich	63069-100ml
1M Potassium chloride solution in water	Sigma-Aldrich	60142-100ml
96-well plate	SPL Life Sciences	Not applicable
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A7699-5G
Biomek FX laboratory automation workstation	Beckman Coulter	Not applicable
Compounds 3-96	Not applicable	Not applicable	Histidine tagged yeast Hsp90 was obtained from Dr. Chrisostomos Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom, and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Details cannot be disclosed due to patent infringement issues.
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418
Geldanamycin, 99% (HPLC), powder	AK Scientific, Inc.	V2064
Invitroge UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	ThermoFisher Scientific	10977015
Malachite Green Phosphate Assay  Assay kit	Sigma-Aldrich	MAK307-1KT
Multi-Detection Microplate Reader Synergy HT	Biotek Instruments, Inc.	Not applicable
Synergy HT multi-plate reader	Biotek Instruments, Inc.	Not applicable
Trizma hydrochloride buffer solution, pH7.4	Sigma-Aldrich	93313-1L
Yeast Hsp90	Not applicable	Not applicable	School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Primary Accession number: P02829