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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Il protocollo di analisi del verde malachite è un metodo semplice ed economico per scoprire i soppressori della proteina da shock termico 90 (Hsp90) e altri composti inibitori contro gli enzimi ATP-dipendenti.

Abstract

La proteina da shock termico 90 (Hsp90) è un promettente bersaglio antitumorale a causa del suo effetto chaperoning su più proteine oncogeniche. L'attività di Hsp90 dipende dalla sua capacità di idrolizzare l'adenosina trifosfato (ATP) in adenosina difosfato (ADP) e fosfato libero. L'attività ATPasi di Hsp90 è legata alla sua funzione chaperoning; L'ATP si lega al dominio N-terminale dell'Hsp90 e interrompere il suo legame si è rivelata la strategia di maggior successo nel sopprimere la funzione Hsp90. L'attività dell'ATPasi può essere misurata mediante un saggio colorimetrico di verde malachite, che determina la quantità di fosfato libero formato dall'idrolisi dell'ATP. Qui viene descritta una procedura per determinare l'attività dell'ATPasi del lievito Hsp90 utilizzando il kit di analisi del fosfato verde malachite. Inoltre, vengono fornite istruzioni dettagliate per la scoperta degli inibitori Hsp90 assumendo geldanamicina come inibitore autentico. Infine, viene discussa l'applicazione di questo protocollo di analisi attraverso lo screening ad alta produttività (HTS) di molecole inibitrici contro il lievito Hsp90.

Introduzione

La proteina da shock termico 90 (Hsp90) è un chaperone molecolare che mantiene la stabilità delle proteine responsabili dello sviluppo e della progressione del cancro. Inoltre, le proteine responsabili dello sviluppo della resistenza agli agenti antineoplastici sono anche clienti di Hsp901. Hsp90 è sovraespresso ubiquitariamente in tutti i tipi di cellule tumorali (>90% delle proteine cellulari), rispetto alle cellule normali dove può costituire meno del 2% delle proteine totali. Inoltre, l'Hsp90 delle cellule tumorali risiede in un complesso con co-chaperoni, mentre in una cellula normale è presente prevalentemente in uno stato libero e non complessato 2,3. Negli ultimi anni, diversi inibitori di Hsp90 hanno dimostrato di possedere effetti senolitici in studi in vitro e in vivo, dove hanno migliorato significativamente la durata della vita dei topi 4,5,6. Tutti i risultati di cui sopra confermano il fatto che gli inibitori Hsp90 potrebbero essere efficaci in più tipi di cancro, con meno effetti avversi e minori possibilità di sviluppare resistenza. La funzione chaperoning di Hsp90 si ottiene legando l'ATP al dominio N-terminale di Hsp90 e idrolizzandolo in ADP e fosfato libero7. Piccole molecole che si legano in modo competitivo alla tasca di legame ATP di Hsp90 sono state trovate per sopprimere con successo l'effetto chaperoning della proteina. Ad oggi, questa rimane la migliore strategia per l'inibizione di Hsp90, che è supportata dal fatto che tali inibitori hanno raggiunto studi clinici8. Uno di questi, Pimitespib, è stato approvato in Giappone per il trattamento del tumore stromale gastrointestinale (GIST) nel giugno 20229. Questo è il primo inibitore Hsp90 approvato da quando la farmacogabilità dello chaperone è stata stabilita nel 199410.

Il test del verde malachite è una procedura semplice, sensibile, veloce ed economica per la rilevazione del fosfato inorganico, adatta per l'automazione e lo screening ad alta produttività (HTS) dei composti rispetto al target desiderato11. Il test è stato impiegato con successo per lo screening degli inibitori Hsp90 in piccole configurazioni su scala di laboratorio, nonché in un HTS 12,13,14,15,16,17. Il test utilizza un metodo colorimetrico che determina il fosfato inorganico libero formato a causa dell'attività ATPasi di Hsp90. La base di questa quantificazione è la formazione di un complesso fosfomolibdato tra fosfato libero e molibdeno, che successivamente reagisce con il verde malachite per generare un colore verde (Figura 1). Questa rapida formazione di colore viene misurata su uno spettrofotometro, o su un lettore di piastre, tra 600-660 nm18,19.

Nel presente protocollo, viene descritta la procedura per eseguire un test verde malachite con lievito Hsp90 e successiva identificazione degli inibitori contro lo chaperone. La molecola del prodotto naturale, la geldanamicina (GA), con la quale è stata stabilita per la prima volta la farmacogabilità di Hsp90, è stata assunta come un autentico inibitore10. L'HTS è diventato parte integrante dell'attuale programma di scoperta di farmaci, grazie alla disponibilità di un gran numero di molecole per i test. Questa tecnica ha acquisito maggiore importanza negli ultimi 2 anni a causa dell'urgente necessità di riutilizzare i farmaci per il trattamento dell'infezione da Covid-1920,21. Pertanto, viene presentato uno schema dettagliato per l'HTS delle molecole contro la proteina Hsp90 del lievito adottando il metodo del saggio verde malachite.

Protocollo

1. Saggio verde malachite su scala di laboratorio

  1. Preparazione del tampone di analisi
    1. Preparare il tampone di analisi, secondo la composizione e la preparazione presentate nella Tabella 1.
  2. Preparazione di norme sui fosfati
    1. Utilizzare 1 mM di fosfato standard, fornito nel kit di dosaggio del fosfato verde malachite (conservato a 4 °C).
    2. Pipettare 40 μL di 1 mM fosfato standard in 960 μL di acqua ultrapura per ottenere una soluzione di fosfato 40 μM (soluzione premiscelata). Aggiungere la soluzione premiscelata con acqua ultrapura, secondo le istruzioni del produttore, per formare una diluizione seriale di fosfato da 0 a 40 μM.
  3. Preparazione del lievito Hsp90
    1. Utilizzare lievito Hsp90 con una concentrazione di glicerolo di 0,66 mg / ml. Scongelare sul ghiaccio poco prima dell'uso.
    2. Utilizzare 8 μL (5,98 μg, 0,80 μM) di lievito Hsp90 per misurare l'attività dell'ATPasi. Verificare che la differenza di densità ottica dopo l'aggiunta di reagente verde malachite tra il controllo bianco e il controllo positivo sia almeno 0,5 e inferiore a 1,0. Qui, la differenza di assorbanza tra il bianco (senza Hsp90) e il controllo positivo (con Hsp90) è risultata essere 0,510.
  4. Preparazione di ATP
    1. Trasferire 1 mg di ATP in un flaconcino contenente 453,39 μL di acqua ultrapura per ottenere 4 mM di soluzione madre. Eseguire calcoli di peso basati su ATP anidro (peso molecolare [m.w.] = 551,14). Preparare l'ATP fresco, in quanto può idrolizzarsi spontaneamente nel tempo.
    2. Aggiungere 4 μL di soluzione madre di ATP a ciascun pozzetto per ottenere una concentrazione finale del pozzo di 0,2 mM (volume totale finale del pozzo di analisi di 80 μL). Aggiungere ATP come ultimo componente alla reazione, utilizzando una pipetta multicanale in modo che tutte le reazioni inizino contemporaneamente.
  5. Preparazione di geldanamicina (GA)
    1. Preparare una scorta di 10 mM di GA sciogliendo 1 mg in 178,37 μL di DMSO (m.p. = 560,64). Utilizzando la soluzione madre, preparare 4 mM, 0,8 mM, 0,16 mM, 0,032 mM, 0,0064 mM e 0,00128 mM in soluzione DMSO mediante diluizione seriale.
    2. Aggiungere 2 μL di queste soluzioni madre a ciascun pozzetto per ottenere una concentrazione finale del pozzetto di 0,1 mM, 0,02 mM, 0,004 mM, 0,0008 mM, 0,00016 mM e 0,000032 mM, rispettivamente.
    3. Preparare i pozzetti come descritto nella Tabella 2 e nella Tabella 3, con i pozzetti contenenti il bianco (buffer + acqua + DMSO) e il controllo negativo (Hsp90 in buffer + acqua + DMSO). I pozzi contenenti GA (Hsp90 in buffer + acqua + GA) fungono da controllo positivo.
  6. Preparazione delle piastre del pozzo e ordine di aggiunta
    1. Preparare piastre da 96 pozzetti con il layout presentato nella Tabella 2. Per i composti che mostrano assorbanza a 620 nm, preparare un pozzetto separato per registrare l'assorbanza a questa lunghezza d'onda. Non preparare un pozzetto separato per GA, poiché GA non mostra assorbanza a 620 nm per la concentrazione utilizzata nel test.
    2. Preparare ciascun componente con il volume totale di ciascun componente, come illustrato nella tabella 3.
    3. Impostare pozzi di analisi aggiungendo acqua ultrapura a ciascun pozzo. Successivamente, aggiungere la quantità richiesta di tampone di analisi e una soluzione composta (ad esempio, soluzione GA).
    4. Quindi, aggiungere Hsp90 ai pozzetti appropriati e agitare le piastre per 2 minuti su uno shaker a temperatura ambiente.
    5. Aggiungere 4 μL di soluzione ATP utilizzando una pipetta multicanale. Avvolgere la piastra in un foglio di alluminio e agitare per 2 minuti su uno shaker (200 rpm) a temperatura ambiente. Incubare la piastra a 37 °C per 3 ore.
  7. Preparazione e aggiunta di reagente verde malachite
    1. Il reagente verde malachite è costituito da reagenti A (molibdato di ammonio in 3M HCl) e B (verde malachite e alcool polivinilico). Portare il reagente a temperatura ambiente prima dell'uso. Miscelare i reagenti A e B con un rapporto 100:1 (1.000 μL:10 μL). Preparalo entro 3 ore prima dell'uso, poiché è instabile e inizia a decomporsi dopo 3 ore.
    2. Dopo 3 ore del punto 1.6.5, interrompere la reazione aggiungendo 20 μL di reagente verde malachite, aggiunto nello stesso ordine dell'ATP, utilizzando una pipetta multicanale.
    3. Dopo un'incubazione di 15 minuti a temperatura ambiente, misurare l'assorbanza della piastra a 620 nm in un lettore di piastre.

2. Screening ad alto rendimento degli inibitori di Hsp90 mediante saggio verde malachite

NOTA: il protocollo per lo screening ad alta produttività è simile alla metodologia su scala di laboratorio. Il volume finale del pozzo in ciascun caso è di 80 μL. Tuttavia, c'è una leggera differenza nell'ordine di aggiunta dei reagenti. Nel metodo basato su scala di laboratorio, ci sono cinque fasi di aggiunta della soluzione (34 μL di acqua, 32 μL di tampone, 2 μL di composto in DMSO, 8 μL di Hsp90 e infine 4 μL di soluzione di ATP). Al contrario, con HTS ci sono tre fasi di aggiunta (40 μL di soluzione tampone contenente lievito Hsp90, 2 μL di DMSO in 18 μL di acqua contenente i composti e infine 20 μL di ATP disciolto in acqua). La quantità minima di soluzione che può essere pipettata con precisione nella configurazione HTS è di 20 μL. Pertanto, si osserva una differenza nel pipettaggio tra le bilance di laboratorio e HTS.

  1. Preparazione del tampone dosato (pH 7,4)
    1. Utilizzare lo stesso tampone in HTS come per il test di verde malachite su scala di laboratorio (Tabella 1).
  2. Preparazione del lievito Hsp90
    1. Utilizzare proteine con una concentrazione di glicerolo di 0,66 mg / ml. Scongelare sul ghiaccio poco prima dell'uso.
    2. Utilizzare 8 μL (5,98 μg, 0,80 μM) di lievito Hsp90 in ciascun pozzetto, che fornisce attività misurabile dell'ATPasi.
    3. Diluire la proteina (8 μL) in tampone (32 μL) per ciascun pozzetto. Il volume di lavoro totale finale per ciascun pozzetto è di 40 μL in un volume totale di analisi di 80 μL.
  3. Preparazione di 0,8 mM ATP
    1. Sciogliere 1 mg di ATP in 2.267 μL di acqua distillata per ottenere una soluzione da 0,8 mM. Il volume di lavoro totale per ciascun pozzetto è di 20 μL su un volume totale di analisi di 80 μL.
  4. Preparazione di geldanamicina (GA)/composti in esame
    1. Preparare una scorta di 0,8 mM di GA in DMSO, come nel passaggio 1.5. Diluire 10 μL del materiale madre GA con 90 μL di acqua per ottenere una concentrazione finale di 80 μM.
    2. Utilizzare 20 μL della soluzione di 80 μM GA in pozzetti di analisi appropriati (volume totale finale del pozzo di analisi = 80 μL), ottenendo una concentrazione finale del pozzetto di 20 μM. Questo serve come controllo positivo.
    3. Per i composti di prova, preparare le soluzioni in DMSO secondo la concentrazione desiderata per la valutazione.
    4. Preparare 10 μL di DMSO in 90 μL di acqua per l'aggiunta a pozzi di controllo bianco (tampone + acqua + DMSO) e negativi (Hsp90 in tampone + acqua + DMSO). Preparare i composti in esame in modo simile a una concentrazione finale di 100 μM.
  5. Progettazione delle piastre di analisi e ordine di aggiunta
    1. Utilizzare quattro piastre principali, una piastra composta e quattro piastre di aggiunta contenenti scorte di reagenti per impostare il saggio (Figura 2 e Tabella 4).
    2. Inoltre, piastra A, aggiungere 90 μL di tampone di saggio in ciascun pozzetto; in aggiunta piastra B, aggiungere 90 μL di tampone con Hsp90 in ciascun pozzetto; in aggiunta alle piastre C e D, aggiungere 90 μL di ATP e 90 μL di reagente verde malachite, rispettivamente, in ciascun pozzetto (Tabella 5 e Tabella 6).
    3. Dalla piastra di addizione A e dalla piastra B, trasferire 40 μL di soluzione da ciascun pozzetto alla piastra principale 1 e 2 e 3 e 4, rispettivamente, utilizzando un sistema di erogazione multicanale automatizzato. Qui è stata utilizzata la stazione di lavoro di automazione di laboratorio Biomek(R) FXP (Figura 2 e Tabella 6).
    4. Da ciascun pozzetto della piastra composta, trasferire 20 μL della soluzione alle piastre principali 1, 2, 3 e 4 (Figura 2). Agitare le piastre per 1 minuto in uno shaker (200 rpm).
    5. Da ciascun pozzetto della piastra di addizione C (ATP), trasferire 20 μL di soluzione alle piastre principali 1, 2, 3 e 4 (Figura 2). Agitare le piastre per 1 minuto in uno shaker (200 rpm).
    6. Incubare le piastre per 3 h a 37 °C.
    7. Preparare il reagente verde malachite come da punto 1.7. Dopo 3 ore, trasferire 20 μL di reagente verde malachite dalla piastra di addizione D nei pozzetti delle piastre principali 1,2, 3 e 4 (Figura 2).
    8. Dopo un'incubazione di 15 minuti a temperatura ambiente, misurare l'assorbanza della piastra a 620 nm in un lettore di piastre.

Risultati

I risultati del saggio sono interpretati in termini di assorbanza dovuta alla concentrazione di ioni fosfato libero. L'assorbanza da parte del fosfato libero dovuta all'idrolisi dell'ATP da parte del lievito Hsp90 a 620 nm è considerata come attività dell'ATPasi al 100%, o inibizione proteica a percentuale zero. L'inibizione delle proteine porta alla cessazione dell'idrolisi dell'ATP (meno fosfato libero). che si riflette in termini di diminuzione dell'assorbanza a 620 nm.

Risultati ...

Discussione

Hsp90 è un obiettivo significativo per la scoperta di nuove molecole di farmaci antitumorali. Da quando la sua farmacogabilità è stata stabilita nel 199410, 18 molecole hanno raggiunto studi clinici. Attualmente, sette molecole sono in varie fasi di studi clinici, da sole o in combinazione22. Tutte queste piccole molecole sono inibitori leganti l'ATP N-terminali. Gli altri mezzi per inibire il chaperone (inibitori C-terminali, inibitori del dominio medio) non hanno proce...

Divulgazioni

Non vi sono interessi finanziari concorrenti.

Riconoscimenti

Questo studio è stato sostenuto dal programma Korea Research Fellowship (KRF), borsista post-dottorato della National Research Foundation of Korea (NRF), finanziato dal ministero della scienza e delle TIC (NRF-2019H1D3A1A01102952). Gli autori sono grati alla sovvenzione intramurale KIST e alla sovvenzione numero 2MRB130 del Ministero degli Oceani e della Pesca per aver fornito assistenza finanziaria a questo progetto.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1M Magnesium chloride solution in waterSigma-Aldrich63069-100ml
1M Potassium chloride solution in waterSigma-Aldrich60142-100ml
96-well plateSPL Life SciencesNot applicable
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrateSigma-AldrichA7699-5G
Biomek FX laboratory automation workstationBeckman CoulterNot applicable
Compounds 3-96Not applicableNot applicableHistidine tagged yeast Hsp90 was obtained from Dr. Chrisostomos Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom, and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Details cannot be disclosed due to patent infringement issues.
Dimethyl sulfoxideSigma-AldrichD8418
Geldanamycin, 99% (HPLC), powderAK Scientific, Inc.V2064
Invitroge UltraPure DNase/RNase-Free Distilled WaterThermoFisher Scientific10977015
Malachite Green Phosphate Assay  Assay kitSigma-AldrichMAK307-1KT
Multi-Detection Microplate Reader Synergy HTBiotek Instruments, Inc.Not applicable
Synergy HT multi-plate readerBiotek Instruments, Inc.Not applicable
Trizma hydrochloride buffer solution, pH7.4Sigma-Aldrich93313-1L
Yeast Hsp90Not applicableNot applicableSchool of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Primary Accession number: P02829

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