Ensaio verde de malaquita para a descoberta de inibidores da proteína de choque térmico 90

Resumo

O protocolo de ensaio verde de malaquita é um método simples e econômico para descobrir supressores de proteína de choque térmico 90 (Hsp90), bem como outros compostos inibidores contra enzimas dependentes de ATP.

Resumo

A proteína de choque térmico 90 (Hsp90) é um alvo anticâncer promissor devido ao seu efeito de chaperoning sobre múltiplas proteínas oncogênicas. A atividade da Hsp90 é dependente de sua capacidade de hidrolisar adenosina trifosfato (ATP) em adenosina difosfato (ADP) e fosfato livre. A atividade ATPase da Hsp90 está ligada à sua função de chaperoning; ATP liga-se ao domínio N-terminal do Hsp90, e interromper sua ligação foi encontrado para ser a estratégia mais bem sucedida na supressão da função Hsp90. A atividade da ATPase pode ser medida por um ensaio colorimétrico verde de malaquita, que determina a quantidade de fosfato livre formado pela hidrólise de ATP. Aqui, um procedimento para determinar a atividade ATPase da levedura Hsp90 usando o kit de ensaio de fosfato verde de malaquita é descrito. Além disso, instruções detalhadas para a descoberta de inibidores de Hsp90 tomando geldanamicina como um inibidor autêntico é fornecida. Finalmente, a aplicação deste protocolo de ensaio através da triagem de alto rendimento (HTS) de moléculas inibidoras contra a levedura Hsp90 é discutida.

Introdução

A proteína de choque térmico 90 (Hsp90) é uma chaperona molecular que mantém a estabilidade de proteínas responsáveis pelo desenvolvimento e progressão do câncer. Além disso, proteínas responsáveis pelo desenvolvimento de resistência a agentes antineoplásicos também são clientes da Hsp90¹. A Hsp90 é superexpressa de forma ubíqua em todos os tipos de células cancerosas (>90% das proteínas celulares), em comparação com as células normais, onde pode constituir menos de 2% das proteínas totais. Além disso, a Hsp90 das células cancerosas reside em um complexo com cochaperonas, enquanto em uma célula normal está presente predominantemente em um estado livre e não^{complexado 2,3}. Nos últimos anos, vários inibidores de Hsp90 demonstraram possuir efeitos senolíticos em estudos in vitro e in vivo, onde melhoraram significativamente o tempo de vida de camundongos 4,5,6. Todos os achados acima corroboram o fato de que os inibidores de Hsp90 poderiam ser efetivos em múltiplos tipos de câncer, com menos efeitos adversos e menores chances de desenvolver resistência. A função de chaperoning da Hsp90 é realizada ligando-se ao ATP no domínio N-terminal da Hsp90 e hidrolisando-o em ADP e fosfato livre⁷. Pequenas moléculas que se ligam competitivamente à bolsa de ligação de ATP de Hsp90 foram encontradas para suprimir com sucesso o efeito de chaperoning da proteína. Até o momento, essa continua sendo a melhor estratégia para a inibição da Hsp90, o que é apoiado pelo fato de tais inibidores terem chegado a ensaios clínicos⁸. Um deles, o Pimitespib, foi aprovado no Japão para o tratamento do tumor estromal gastrointestinal (GIST) em junho de 2022⁹. Este é o primeiro inibidor de Hsp90 aprovado desde que a farmacogabilidade da chaperona foi estabelecida em 1994¹⁰.

O ensaio verde de malaquita é um procedimento simples, sensível, rápido e de baixo custo para a detecção de fosfato inorgânico, adequado para automação e triagem de alto rendimento (HTS) de compostos contra seu alvo desejado¹¹. O ensaio foi empregado com sucesso para a triagem de inibidores de Hsp90 em pequenos montamentos em escala laboratorial, bem como em uma HTS 12,13,14,15,16,17. O ensaio utiliza um método colorimétrico que determina o fosfato inorgânico livre formado devido à atividade ATPase da Hsp90. A base dessa quantificação é a formação de um complexo fosfomolibdato entre fosfato livre e molibdênio, que posteriormente reage com o verde malaquita para gerar uma cor verde (Figura 1). Essa rápida formação de cor é medida em espectrofotômetro, ou em leitor de placas, entre 600-660 nm^18,19.

No presente protocolo, descreve-se o procedimento para a realização do ensaio verde de malaquita com a levedura Hsp90 e posterior identificação de inibidores contra a chaperona. A molécula do produto natural, geldanamicina (GA), com a qual a farmacogabilidade da Hsp90 foi estabelecida pela primeira vez, foi tomada como um inibidor autêntico¹⁰. A HTS tornou-se parte integrante do atual programa de descoberta de fármacos, devido à disponibilidade de um grande número de moléculas para testes. Essa técnica ganhou mais importância nos últimos 2 anos devido à necessidade urgente de reaproveitamento de medicamentos para o tratamento da infecção por Covid-19^20,21. Portanto, um esboço detalhado para a HTS de moléculas contra a proteína Hsp90 da levedura adotando o método de ensaio verde de malaquita é apresentado.

Protocolo

1. Ensaio verde de malaquita em escala de laboratório

1. Preparação do tampão de ensaio
   1. Preparar o tampão de ensaio, de acordo com a composição e preparação apresentadas na Tabela 1.
2. Preparação de padrões de fosfato
   1. Utilizar o padrão de fosfato de 1 mM, fornecido no kit de ensaio de fosfato verde de malaquita (armazenado a 4 °C).
   2. Pipetar 40 μL de fosfato padrão 1 mM em 960 μL de água ultrapura para obter 40 μM de solução de fosfato (solução de pré-mistura). Adicionar a solução de pré-mistura com água ultrapura, de acordo com as instruções do fabricante, para formar uma diluição em série de fosfato de 0 a 40 μM.
3. Preparo da levedura Hsp90
   1. Use a levedura Hsp90 com uma concentração estoque de glicerol de 0,66 mg/mL. Descongelar no gelo pouco antes de usar.
   2. Use 8 μL (5,98 μg, 0,80 μM) de levedura Hsp90 para atividade ATPase mensurável. Verifique se a diferença de densidade óptica após a adição do reagente verde de malaquita entre o branco e o controle positivo é de pelo menos 0,5 e inferior a 1,0. Aqui, a diferença de absorbância entre o branco (sem Hsp90) e o controle positivo (com Hsp90) foi de 0,510.
4. Preparação de ATP
   1. Transferir 1 mg de ATP para um frasco para injetáveis contendo 453,39 μL de água ultrapura para obter 4 mM de solução-mãe. Realizar cálculos de peso com base no ATP anidro (peso molecular [m.p.] = 551,14). Prepare o ATP fresco, pois ele pode hidrolisar espontaneamente com o tempo.
   2. Adicionar 4 μL de solução-mãe de ATP a cada poço para obter uma concentração final do poço de 0,2 mM (volume total final do poço de ensaio de 80 μL). Adicione ATP como último componente à reação, usando uma pipeta multicanal para que todas as reações comecem simultaneamente.
5. Preparação de geldanamicina (GA)
   1. Preparar um estoque de 10 mM de GA dissolvendo 1 mg em 178,37 μL de DMSO (m.w. = 560,64). Usando a solução-mãe, preparar soluções de 4 mM, 0,8 mM, 0,16 mM, 0,032 mM, 0,0064 mM e 0,00128 mM em DMSO por diluição seriada.
   2. Adicionar 2 μL dessas soluções-estoque a cada poço para obter uma concentração final de 0,1 mM, 0,02 mM, 0,004 mM, 0,0008 mM, 0,00016 mM e 0,000032 mM, respectivamente.
   3. Preparar os poços conforme descrito na Tabela 2 e Tabela 3, sendo que os poços contêm o controle branco (tampão + água + DMSO) e negativo (Hsp90 em tampão + água + DMSO). Os poços contendo GA (Hsp90 em tampão + água + GA) servem como controle positivo.
6. Preparação de placas de poço e ordem de adição
   1. Prepare placas de 96 poços com o layout apresentado na Tabela 2. Para compostos que apresentam absorbância a 620 nm, prepare um poço separado para registrar a absorbância neste comprimento de onda. Não prepare um poço separado para GA, pois o GA não mostra absorbância a 620 nm para a concentração utilizada no ensaio.
   2. Preparar cada constituinte com o volume total de cada constituinte, conforme apresentado na Tabela 3.
   3. Configure poços de ensaio adicionando água ultrapura a cada poço. Em seguida, adicione a quantidade necessária de tampão de ensaio e uma solução composta (por exemplo, solução de GA).
   4. Em seguida, adicione Hsp90 aos poços apropriados e agite as placas por 2 min em um agitador de placas à temperatura ambiente.
   5. Adicionar 4 μL de solução de ATP utilizando uma pipeta multicanal. Embrulhe a placa em papel alumínio e agite por 2 min em um agitador de placas (200 rpm) à temperatura ambiente. Incubar a placa a 37 °C durante 3 h.
7. Preparação e adição de reagente verde de malaquita
   1. O reagente verde de malaquita é composto pelos reagentes A (molibdato de amônio em HCl 3M) e B (verde de malaquita e álcool polivinílico). Levar o reagente à temperatura ambiente antes de utilizar. Misturar os reagentes A e B na proporção de 100:1 (1.000 μL:10 μL). Prepare em até 3 h antes do uso, pois é instável e começa a se decompor após 3 h.
   2. Após 3 h do passo 1.6.5, parar a reação adicionando 20 μL de reagente verde de malaquita, adicionado na mesma ordem do ATP, usando uma pipeta multicanal.
   3. Após 15 min de incubação à temperatura ambiente, medir a absorbância da placa a 620 nm em um leitor de placas.

2. Triagem de alto rendimento de inibidores de Hsp90 pelo ensaio verde de malaquita

NOTA: O protocolo para triagem de alto rendimento é semelhante à metodologia em escala de laboratório. O volume final do poço em cada caso é de 80 μL. No entanto, há uma pequena diferença na ordem de adição dos reagentes. No método baseado em escala de laboratório, há cinco estágios de adição da solução (34 μL de água, 32 μL de tampão, 2 μL de composto em DMSO, 8 μL de Hsp90 e, finalmente, 4 μL de solução de ATP). Em contraste, com HTS há três estágios de adição (40 μL de solução tampão contendo levedura Hsp90, 2 μL de DMSO em 18 μL de água contendo os compostos e, finalmente, 20 μL de ATP dissolvido em água). A quantidade mínima de solução que pode ser pipetada com precisão na configuração HTS é de 20 μL. Assim, observa-se uma diferença na pipetagem entre as escalas de laboratório e HTS.

1. Preparação do tampão de ensaio (pH 7,4)
   1. Use o mesmo tampão no HTS que para o ensaio verde de malaquita em escala laboratorial (Tabela 1).
2. Preparo da levedura Hsp90
   1. Use proteína com uma concentração estoque de glicerol de 0,66 mg/mL. Descongelar no gelo pouco antes de usar.
   2. Use 8 μL (5,98 μg, 0,80 μM) de levedura Hsp90 em cada poço, o que fornece atividade ATPase mensurável.
   3. Diluir a proteína (8 μL) em tampão (32 μL) para cada poço. O volume total de trabalho final para cada poço é de 40 μL em um volume total de ensaio de 80 μL.
3. Preparação de 0,8 mM ATP
   1. Dissolver 1 mg de ATP em 2.267 μL de água destilada para obter uma solução de 0,8 mM. O volume total de trabalho para cada poço é de 20 μL em um volume total de ensaio de 80 μL.
4. Preparação de geldanamicina (GA)/compostos de ensaio
   1. Prepare um estoque de 0,8 mM de GA no DMSO, como na etapa 1.5. Diluir 10 μL do estoque de GA com 90 μL de água para obter uma concentração final de 80 μM.
   2. Utilizar 20 μL da solução de 80 μM de GA em poços de ensaio apropriados (volume total final do poço de ensaio = 80 μL), obtendo-se uma concentração final do poço de 20 μM. Isso serve como um controle positivo.
   3. Para compostos de teste, preparar soluções em DMSO de acordo com sua concentração desejada para avaliação.
   4. Preparar 10 μL de DMSO em 90 μL de água para adição em poços de controle branco (tampão + água + DMSO) e negativo (Hsp90 em tampão + água + DMSO). Preparar os compostos de ensaio de forma semelhante a uma concentração final de poço de 100 μM.
5. Projeto de placas de ensaio e ordem de adição
   1. Utilizar quatro placas principais, uma placa composta e quatro placas de adição contendo estoques de reagentes para montar o ensaio (Figura 2 e Tabela 4).
   2. Além disso, placa A, adicionar 90 μL de tampão de ensaio em cada poço; além da placa B, adicionar 90 μL de tampão com Hsp90 em cada poço; além das placas C e D, adicionar 90 μL de ATP e 90 μL de reagente verde de malaquita, respectivamente, em cada poço (Tabela 5 e Tabela 6).
   3. Da placa de adição A e da placa B, transferir 40 μL de solução de cada poço para as placas principais 1 e 2, e 3 e 4, respectivamente, usando um sistema de dosagem multicanal automatizado. Utilizou-se a estação de trabalho de automação laboratorial Biomek(^R) FX^P (Figura 2 e Tabela 6).
   4. De cada poço da placa composta, transferir 20 μL da solução para as placas principais 1, 2, 3 e 4 (Figura 2). Agite as placas por 1 min em um agitador (200 rpm).
   5. De cada poço da placa de adição C (ATP), transferir 20 μL de solução para as placas principais 1, 2, 3 e 4 (Figura 2). Agite as placas por 1 min em um agitador (200 rpm).
   6. Incubar as placas durante 3 h a 37 °C.
   7. Preparar o reagente verde de malaquita de acordo com o passo 1.7. Após 3 h, transferir 20 μL do reagente verde de malaquita da placa de adição D para os poços das placas principais 1, 2, 3 e 4 (Figura 2).
   8. Após 15 min de incubação à temperatura ambiente, meça a absorvância da placa a 620 nm em um leitor de placas.

Resultados

Os resultados do ensaio são interpretados em termos de absorbância devido à concentração livre do íon fosfato. A absorbância por fosfato livre devido à hidrólise de ATP pela levedura Hsp90 a 620 nm é considerada como 100% de atividade da ATPase, ou zero porcentagem de inibição proteica. A inibição da proteína leva à cessação da hidrólise de ATP (menos fosfato livre). o que se reflete em termos de diminuição da absorbância a 620 nm.

Resultados do ensaio verde de ma...

Discussão

Hsp90 é um alvo significativo para a descoberta de novas moléculas de drogas anticancerígenas. Desde que sua farmacogabilidade foi estabelecida em 1994^{10, 18} moléculas chegaram a ser experimentadas clinicamente. Atualmente, sete moléculas estão em várias fases de ensaios clínicos, isoladamente ou em combinação²². Todas essas pequenas moléculas são inibidores de ligação do ATP N-terminal. Os outros meios de inibir a chaperona (inibidores C-terminais, inibidores...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1M Magnesium chloride solution in water	Sigma-Aldrich	63069-100ml
1M Potassium chloride solution in water	Sigma-Aldrich	60142-100ml
96-well plate	SPL Life Sciences	Not applicable
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A7699-5G
Biomek FX laboratory automation workstation	Beckman Coulter	Not applicable
Compounds 3-96	Not applicable	Not applicable	Histidine tagged yeast Hsp90 was obtained from Dr. Chrisostomos Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom, and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Details cannot be disclosed due to patent infringement issues.
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418
Geldanamycin, 99% (HPLC), powder	AK Scientific, Inc.	V2064
Invitroge UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	ThermoFisher Scientific	10977015
Malachite Green Phosphate Assay  Assay kit	Sigma-Aldrich	MAK307-1KT
Multi-Detection Microplate Reader Synergy HT	Biotek Instruments, Inc.	Not applicable
Synergy HT multi-plate reader	Biotek Instruments, Inc.	Not applicable
Trizma hydrochloride buffer solution, pH7.4	Sigma-Aldrich	93313-1L
Yeast Hsp90	Not applicable	Not applicable	School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Primary Accession number: P02829