Malachit-Green-Assay zur Entdeckung von Hitzeschockprotein-90-Inhibitoren

Zusammenfassung

Das Malachit-Green-Assay-Protokoll ist eine einfache und kostengünstige Methode zur Entdeckung von Hitzeschockprotein-90-Suppressoren (Hsp90) sowie anderer Hemmstoffe gegen ATP-abhängige Enzyme.

Zusammenfassung

Das Hitzeschockprotein 90 (Hsp90) ist aufgrund seiner begleitenden Wirkung auf mehrere onkogene Proteine ein vielversprechendes Ziel gegen Krebs. Die Aktivität von Hsp90 hängt von seiner Fähigkeit ab, Adenosintriphosphat (ATP) zu Adenosindiphosphat (ADP) und freiem Phosphat zu hydrolysieren. Die ATPase-Aktivität von Hsp90 ist mit seiner Chaperoning-Funktion verbunden; ATP bindet an die N-terminale Domäne des Hsp90, und die Unterbrechung seiner Bindung erwies sich als die erfolgreichste Strategie zur Unterdrückung der Hsp90-Funktion. Die ATPase-Aktivität kann durch einen kolorimetrischen Malachit-Grün-Assay gemessen werden, der die Menge an freiem Phosphat bestimmt, das durch ATP-Hydrolyse gebildet wird. In dieser Arbeit wird ein Verfahren zur Bestimmung der ATPase-Aktivität der Hefe Hsp90 unter Verwendung des Malachit-Grünphosphat-Assay-Kits beschrieben. Darüber hinaus wird eine detaillierte Anleitung zur Entdeckung von Hsp90-Inhibitoren durch die Einnahme von Geldanamycin als authentischem Inhibitor bereitgestellt. Abschließend wird die Anwendung dieses Assay-Protokolls durch das Hochdurchsatz-Screening (HTS) von Inhibitormolekülen gegen Hefe Hsp90 diskutiert.

Einleitung

Das Hitzeschockprotein 90 (Hsp90) ist ein molekulares Chaperon, das die Stabilität von Proteinen aufrechterhält, die für die Entstehung und das Fortschreiten von Krebs verantwortlich sind. Darüber hinaus sind auch Proteine, die für die Entwicklung von Resistenzen gegen antineoplastische Wirkstoffe verantwortlich sind, Kunden von Hsp90¹. Hsp90 wird ubiquitär in allen Krebszelltypen (>90% der zellulären Proteine) überexprimiert, verglichen mit normalen Zellen, in denen es weniger als 2% der gesamten Proteine ausmachen kann. Darüber hinaus befindet sich das Hsp90 von Krebszellen in einem Komplex mit Co-Chaperonen, während es in einer normalen Zelle überwiegend in einem freien, nicht komplexierten Zustand vorliegt ^2,3. In den letzten Jahren wurde gezeigt, dass mehrere Hsp90-Inhibitoren in In-vitro- und In-vivo-Studien senolytische Wirkungen besitzen, wobei sie die Lebensdauer von Mäusen signifikant verbessert haben 4,5,6. Alle oben genannten Ergebnisse untermauern die Tatsache, dass Hsp90-Inhibitoren bei mehreren Krebsarten wirksam sein könnten, mit weniger Nebenwirkungen und geringerem Risiko, Resistenzen zu entwickeln. Die Chaperoning-Funktion von Hsp90 wird durch die Bindung von ATP an der N-terminalen Domäne von Hsp90 und die Hydrolyse in ADP und freies Phosphat⁷ erreicht. Es wurde festgestellt, dass kleine Moleküle, die kompetitiv an die ATP-Bindungstasche von Hsp90 binden, den Chaperoning-Effekt des Proteins erfolgreich unterdrücken. Bis heute ist dies die beste Strategie zur Hemmung von Hsp90, was durch die Tatsache gestützt wird, dass solche Inhibitoren in die klinische Erprobung gelangt sind⁸. Eines davon, Pimitespib, wurde im Juni 2022 in Japan für die Behandlung von gastrointestinalen Stromatumoren (GIST) zugelassen⁹. Dies ist der erste Hsp90-Inhibitor, der seit der Einführung der Behandelbarkeit des Chaperons im Jahr 1994 zugelassen wurde¹⁰.

Der Malachitgrün-Assay ist ein einfaches, empfindliches, schnelles und kostengünstiges Verfahren zum Nachweis von anorganischem Phosphat, das für die Automatisierung und das Hochdurchsatz-Screening (HTS) von Verbindungen gegen das gewünschte Ziel^{geeignet ist 11}. Der Assay wurde erfolgreich für das Screening von Hsp90-Inhibitoren in kleinen Laboraufbauten sowie in einem HTS 12,13,14,15,16,17 eingesetzt. Der Assay verwendet eine kolorimetrische Methode, die das freie anorganische Phosphat bestimmt, das aufgrund der ATPase-Aktivität von Hsp90 gebildet wird. Grundlage dieser Quantifizierung ist die Bildung eines Phosphohomolybdat-Komplexes zwischen freiem Phosphat und Molybdän, der anschließend mit Malachitgrün zu einer grünen Farbe reagiert (Abbildung 1). Diese schnelle Farbbildung wird auf einem Spektralphotometer oder auf einem Plattenlesegerät zwischen 600-660 nm^18,19 gemessen.

Im vorliegenden Protokoll wird das Verfahren zur Durchführung eines Malachitgrün-Assays mit Hefe Hsp90 und anschließender Identifizierung von Inhibitoren gegen das Chaperon beschrieben. Das Naturstoffmolekül Geldanamycin (GA), mit dem die Arzneibarkeit von Hsp90 erstmals nachgewiesen wurde, wurde als authentischer Inhibitor eingenommen¹⁰. HTS ist aufgrund der Verfügbarkeit einer großen Anzahl von Molekülen für Tests zu einem integralen Bestandteil des aktuellen Wirkstoffforschungsprogramms geworden. Diese Technik hat in den letzten 2 Jahren an Bedeutung gewonnen, da dringend Medikamente zur Behandlung von Covid-19-Infektionen umgewidmet werden^{müssen 20,21}. Daher wird ein detaillierter Überblick über die HTS von Molekülen gegen Hefe-Hsp90-Protein unter Anwendung der Malachit-Green-Assay-Methode gegeben.

Protokoll

1. Malachit-Grün-Assay im Labormaßstab

1. Herstellung des Assay-Puffers
   1. Bereiten Sie den Assay-Puffer gemäß der Zusammensetzung und Zubereitung in Tabelle 1 vor.
2. Erstellung von Phosphatstandards
   1. Verwenden Sie 1 mM Phosphatstandard, der im Malachitgrün-Assay-Phosphat-Assay-Kit enthalten ist (gelagert bei 4 °C).
   2. Pipettieren Sie 40 μl 1 mM Phosphatstandard in 960 μl Reinstwasser, um 40 μM Phosphatlösung (Vormischlösung) zu erhalten. Fügen Sie die Vormischungslösung gemäß den Anweisungen des Herstellers mit Reinstwasser hinzu, um eine serielle Verdünnung von Phosphat von 0 bis 40 μM zu bilden.
3. Zubereitung der Hefe Hsp90
   1. Verwenden Sie Hefe Hsp90 mit einer Glyceringehaltskonzentration von 0,66 mg/ml. Kurz vor Gebrauch auf Eis auftauen.
   2. Verwenden Sie 8 μl (5,98 μg, 0,80 μM) Hefe Hsp90 für eine messbare ATPase-Aktivität. Stellen Sie sicher, dass der optische Dichteunterschied nach Zugabe von Malachitgrün-Reagenz zwischen der Leer- und der Positivkontrolle mindestens 0,5 und weniger als 1,0 beträgt. Hier wurde festgestellt, dass die Absorptionsdifferenz zwischen dem Rohling (ohne Hsp90) und der Positivkontrolle (mit Hsp90) 0,510 beträgt.
4. Vorbereitung von ATP
   1. 1 mg ATP wird in eine Durchstechflasche mit 453,39 μl Reinstwasser übertragen, um 4 mM Stammlösung zu erhalten. Führen Sie Gewichtsberechnungen auf der Grundlage von wasserfreiem ATP (Molekulargewicht [m.w.] = 551,14) durch. Bereiten Sie ATP frisch zu, da es mit der Zeit spontan hydrolysieren kann.
   2. Fügen Sie jeder Vertiefung 4 μl ATP-Stammlösung hinzu, um eine endgültige Vertiefungskonzentration von 0,2 mM (endgültiges Gesamtvolumen der Assay-Vertiefung von 80 μl) zu erhalten. Fügen Sie ATP als letzte Komponente zur Reaktion hinzu, indem Sie eine Mehrkanalpipette verwenden, so dass alle Reaktionen gleichzeitig beginnen.
5. Zubereitung von Geldanamycin (GA)
   1. Bereiten Sie einen Vorrat von 10 mM GA vor, indem Sie 1 mg in 178,37 μl DMSO (m.w. = 560,64) auflösen. Unter Verwendung der Stammlösung werden 4 mM, 0,8 mM, 0,16 mM, 0,032 mM, 0,0064 mM und 0,00128 mM Lösung in DMSO durch serielle Verdünnung hergestellt.
   2. Fügen Sie 2 μl dieser Stammlösungen zu jeder Vertiefung hinzu, um eine endgültige Vertiefungskonzentration von 0,1 mM, 0,02 mM, 0,004 mM, 0,0008 mM, 0,00016 mM bzw. 0,000032 mM zu erhalten.
   3. Bereiten Sie die Bohrungen wie in Tabelle 2 und Tabelle 3 beschrieben vor, wobei die Bohrungen den Leerstein (Puffer + Wasser + DMSO) und die Negativkontrolle (Hsp90 im Puffer + Wasser + DMSO) enthalten. Als Positivkontrolle dienen die GA-haltigen Brunnen (Hsp90 im Puffer + Wasser + GA).
6. Vorbereitung der Wellplatten und Reihenfolge der Zugabe
   1. Bereiten Sie 96-Well-Platten mit dem in Tabelle 2 dargestellten Layout vor. Für Verbindungen, die eine Absorption bei 620 nm aufweisen, bereiten Sie eine separate Vertiefung vor, um die Absorption bei dieser Wellenlänge aufzuzeichnen. Bereiten Sie keine separate Vertiefung für GA vor, da GA bei 620 nm keine Absorption für die im Assay verwendete Konzentration zeigt.
   2. Bereiten Sie jeden Bestandteil mit dem Gesamtvolumen jedes Bestandteils vor, wie in Tabelle 3 dargestellt.
   3. Richten Sie Assay-Vertiefungen ein, indem Sie jeder Vertiefung hochreines Wasser hinzufügen. Fügen Sie anschließend die erforderliche Menge Assay-Puffer und eine zusammengesetzte Lösung (z. B. GA-Lösung) hinzu.
   4. Geben Sie dann Hsp90 in die entsprechenden Vertiefungen und schütteln Sie die Platten 2 Minuten lang auf einem Tellerschüttler bei Raumtemperatur.
   5. Fügen Sie 4 μl ATP-Lösung mit einer Mehrkanalpipette hinzu. Wickeln Sie den Teller in Alufolie ein und schütteln Sie ihn 2 Minuten lang auf einem Tellerschüttler (200 U/min) bei Raumtemperatur. Die Platte bei 37 °C 3 h inkubieren.
7. Herstellung und Zugabe von Malachitgrün-Reagenz
   1. Das Malachitgrün-Reagenz besteht aus den Reagenzien A (Ammoniummolybdat in 3M HCl) und B (Malachitgrün und Polyvinylalkohol). Bringen Sie das Reagenz vor Gebrauch auf Raumtemperatur. Mischen Sie die Reagenzien A und B in einem Verhältnis von 100:1 (1.000 μl:10 μl). Bereiten Sie diese innerhalb von 3 Stunden vor Gebrauch vor, da sie instabil ist und sich nach 3 Stunden zu zersetzen beginnt.
   2. Nach 3 h des Schritts 1.6.5 wird die Reaktion durch Zugabe von 20 μl malachitgrünem Reagenz, das in der gleichen Reihenfolge wie ATP zugegeben wird, mit einer Mehrkanalpipette gestoppt.
   3. Nach einer 15-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wird die Absorption der Platte bei 620 nm in einem Plattenlesegerät gemessen.

2. Hochdurchsatz-Screening von Hsp90-Inhibitoren mittels Malachit-Grün-Assay

HINWEIS: Das Protokoll für das Hochdurchsatz-Screening ähnelt der Methodik im Labormaßstab. Das finale Wellvolumen beträgt jeweils 80 μL. Es gibt jedoch einen geringfügigen Unterschied in der Reihenfolge der Zugabe von Reagenzien. Bei der Methode im Labormaßstab gibt es fünf Stufen der Lösungszugabe (34 μl Wasser, 32 μl Puffer, 2 μl Verbindung in DMSO, 8 μl Hsp90 und schließlich 4 μl ATP-Lösung). Im Gegensatz dazu gibt es bei HTS drei Stufen der Zugabe (40 μl Pufferlösung, die Hefe Hsp90 enthält, 2 μl DMSO in 18 μl Wasser, das die Verbindungen enthält, und schließlich 20 μl in Wasser gelöstes ATP). Die minimale Menge an Lösung, die im HTS-Setup genau pipettiert werden kann, beträgt 20 μl. Daher wird ein Unterschied beim Pipettieren zwischen Labor- und HTS-Waage beobachtet.

1. Herstellung von Assay-Puffer (pH 7,4)
   1. Verwenden Sie für HTS den gleichen Puffer wie für den Malachit-Grün-Assay im Labormaßstab (Tabelle 1).
2. Zubereitung der Hefe Hsp90
   1. Verwenden Sie Protein mit einer Glyceringehaltskonzentration von 0,66 mg/ml. Kurz vor Gebrauch auf Eis auftauen.
   2. Verwenden Sie 8 μl (5,98 μg, 0,80 μM) Hefe Hsp90 in jeder Vertiefung, was eine messbare ATPase-Aktivität liefert.
   3. Verdünnen Sie das Protein (8 μl) in Puffer (32 μl) für jede Vertiefung. Das endgültige Gesamtarbeitsvolumen für jede Vertiefung beträgt 40 μl bei einem Gesamtassay-Volumen von 80 μl.
3. Herstellung von 0,8 mM ATP
   1. Lösen Sie 1 mg ATP in 2.267 μl destilliertem Wasser auf, um eine 0,8 mM Lösung zu erhalten. Das Gesamtarbeitsvolumen für jede Vertiefung beträgt 20 μl bei einem Gesamtassay-Volumen von 80 μl.
4. Herstellung von Geldanamycin (GA)/Testpräparaten
   1. Bereiten Sie einen GA-Bestand von 0,8 mM in DMSO vor, wie in Schritt 1.5 beschrieben. Verdünnen Sie 10 μl des GA-Stammes mit 90 μl Wasser, um eine Endkonzentration von 80 μM zu erhalten.
   2. Verwenden Sie 20 μl der 80 μM GA-Lösung in geeigneten Assay-Wells (endgültiges Gesamt-Assay-Well-Volumen = 80 μl), was eine endgültige Well-Konzentration von 20 μM ergibt. Dies dient als Positivkontrolle.
   3. Für Testverbindungen sind Lösungen in DMSO entsprechend der gewünschten Konzentration für die Bewertung vorzubereiten.
   4. Bereiten Sie 10 μl DMSO in 90 μl Wasser für die Zugabe zu Leer- (Puffer + Wasser + DMSO) und Negativkontrollbrunnen (Hsp90 in Puffer + Wasser + DMSO) vor. Die Testverbindungen werden in ähnlicher Weise bei einer Endvertiefungskonzentration von 100 μM hergestellt.
5. Design der Assay-Platten und Reihenfolge der Zugabe
   1. Verwenden Sie vier Hauptplatten, eine Verbundplatte und vier Additionsplatten mit Reagenzienvorräten, um den Assay einzurichten (Abbildung 2 und Tabelle 4).
   2. Fügen Sie zusätzlich Platte A 90 μl Assay-Puffer in jede Vertiefung hinzu; zusätzlich Platte B 90 μl Puffer mit Hsp90 in jede Vertiefung geben; zusätzlich zu den Platten C und D 90 μl ATP bzw. 90 μl Malachitgrün-Reagenz in jede Vertiefung geben (Tabelle 5 und Tabelle 6).
   3. Von der Additionsplatte A und der Platte B werden 40 μl Lösung aus jeder Vertiefung mit einem automatisierten Mehrkanal-Dosiersystem auf die Hauptplatte 1 und 2 bzw. 3 und 4 übertragen. Hier kam die Laborautomations-Workstation Biomek(^R) FX^P zum Einsatz (Abbildung 2 und Tabelle 6).
   4. Aus jeder Vertiefung der Verbundplatte werden 20 μl der Lösung auf die Hauptplatten 1, 2, 3 und 4 übertragen (Abbildung 2). Schütteln Sie die Teller 1 Minute lang in einem Shaker (200 U/min).
   5. Aus jeder Vertiefung der Zugabeplatte C (ATP) werden 20 μl Lösung auf die Hauptplatten 1, 2, 3 und 4 übertragen (Abbildung 2). Schütteln Sie die Teller 1 Minute lang in einem Shaker (200 U/min).
   6. Die Platten 3 h bei 37 °C inkubieren.
   7. Bereiten Sie das grüne Malachit-Reagenz wie in Schritt 1.7 beschrieben vor. Nach 3 h werden 20 μl Malachitgrün-Reagenz von der Zugabeplatte D in die Vertiefungen der Hauptplatten 1, 2, 3 und 4 überführt (Abbildung 2).
   8. Nach einer 15-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wird die Absorption der Platte bei 620 nm in einem Plattenlesegerät gemessen.

Ergebnisse

Die Ergebnisse des Assays werden in Bezug auf die Absorption aufgrund der Konzentration der freien Phosphationen interpretiert. Die Absorption durch freies Phosphat aufgrund der ATP-Hydrolyse durch die Hefe Hsp90 bei 620 nm wird als 100%ige ATPase-Aktivität oder nullprozentige Proteinhemmung angesehen. Die Hemmung des Proteins führt zum Aufhören der ATP-Hydrolyse (weniger freies Phosphat). Dies spiegelt sich in einer verringerten Absorption bei 620 nm wider.

Ergebnisse des Malachit-...

Diskussion

Hsp90 ist ein wichtiges Ziel für die Entdeckung neuartiger Moleküle gegen Krebsmedikamente. Seit der Etablierung der Arzneibarkeit im Jahr 1994 haben^10.18 Moleküle klinische Studien erreicht. Derzeit befinden sich sieben Moleküle in verschiedenen Phasen der klinischen Erprobung, entweder allein oder in Kombination²². Alle diese kleinen Moleküle sind N-terminale ATP-bindende Inhibitoren. Die anderen Mittel zur Hemmung des Chaperons (C-terminale Inhibitoren, Middle-Domai...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1M Magnesium chloride solution in water	Sigma-Aldrich	63069-100ml
1M Potassium chloride solution in water	Sigma-Aldrich	60142-100ml
96-well plate	SPL Life Sciences	Not applicable
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A7699-5G
Biomek FX laboratory automation workstation	Beckman Coulter	Not applicable
Compounds 3-96	Not applicable	Not applicable	Histidine tagged yeast Hsp90 was obtained from Dr. Chrisostomos Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom, and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Details cannot be disclosed due to patent infringement issues.
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418
Geldanamycin, 99% (HPLC), powder	AK Scientific, Inc.	V2064
Invitroge UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	ThermoFisher Scientific	10977015
Malachite Green Phosphate Assay  Assay kit	Sigma-Aldrich	MAK307-1KT
Multi-Detection Microplate Reader Synergy HT	Biotek Instruments, Inc.	Not applicable
Synergy HT multi-plate reader	Biotek Instruments, Inc.	Not applicable
Trizma hydrochloride buffer solution, pH7.4	Sigma-Aldrich	93313-1L
Yeast Hsp90	Not applicable	Not applicable	School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Primary Accession number: P02829