骨細胞の解析とイメージング

要約

本研究では、計算流体力学(CFD)解析のために、飛翔小管網(LCN)内の骨細胞の3次元(3D)モデルを可視化・開発する方法について概説します。この方法を使用して生成されたモデルは、健康な骨または病気の骨の骨細胞メカニズムを理解するのに役立ちます。

要約

骨細胞は、機械伝達として知られるプロセスでさまざまな生物学的経路を活性化することにより、機械的ひずみと流体流せん断応力(FFSS)に応答すると考えられている骨細胞です。骨細胞ネットワークの共焦点画像から得られるモデルは、直接測定では決定できない骨細胞膜のせん断応力を評価するための計算流体力学(CFD)解析を行うための貴重なツールです。骨の微細構造構造のこれらの高解像度画像を使用した計算モデリングを使用して、骨にかかる機械的負荷を数値的にシミュレートし、骨細胞の負荷誘発刺激を理解しました。

本研究では、Lacunar-Canalicular Network(LCN)の共焦点顕微鏡画像を用いて3次元単一骨細胞モデルを開発し、各種計算モデリングソフトウェアを用いたCFD解析を行う方法について詳しく説明します。共焦点顕微鏡検査の前に、マウスの骨を切片化し、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)色素で染色してLCNを標識します。100倍の解像度で、Zスタック画像を共焦点顕微鏡で収集し、MIMICSソフトウェア(3D画像処理ソフトウェア)にインポートして、LCNおよび骨細胞樹状突起プロセスの表面モデルを構築します。

次に、これらの表面を3-Maticソフトウェア(3Dデータ最適化ソフトウェア)のブール演算を使用して減算し、骨細胞体周辺のラクナ流路空間とラクノカナル液を含む樹状突起の周りの小管空間をモデル化します。3D体積流体形状は、CFD解析のためにANSYSソフトウェア(シミュレーションソフトウェア)にインポートされます。ANSYS CFX(CFDソフトウェア)を使用して、流体圧力として骨に生理学的負荷を加え、骨細胞と樹状突起にかかる壁せん断応力を決定します。LCNの形態は、骨細胞膜と細胞プロセスによって感知されるせん断応力値に影響を与えます。したがって、共焦点画像ベースのモデルがどのように開発されるかの詳細は、骨細胞のメカニズムを理解する上で価値があり、この分野での将来の研究の基礎を築くことができます。

概要

骨細胞は、身体運動に応答して骨量を調節すると仮定^{されています1}。骨細胞の膜変形とその樹状突起は、機械的負荷によって骨細胞にFFSSをさらし、これは骨細胞によって検出され、細胞内シグナル伝達を誘発します^2,3,4。骨の微細構造は、加齢や骨粗鬆症や糖尿病などの骨疾患、および骨細胞の機械応答性障害を引き起こすペルルカン欠乏症などの状態により、そのラクナ-小管形態の劣化または変化を経て受けます^5,6。骨構造のこれらの変化により、骨細胞はさまざまなレベルのFFSSとひずみを経験する^7,8。重要なことに、機械的負荷に応答して骨細胞が経験するFFSSは、石灰化した骨基質に埋め込まれているため、in vivoで定量化するのが困難です。

共焦点画像ベースのモデリングは、LCN ^9,10のコンピューターモデルを複製することにより、自然環境でアクセスできない骨細胞を研究するという制限を克服する強力な手法です。LCNの相互接続されたネットワークを3Dで処理し、モデル化することは困難でした。透過型電子顕微鏡法(TEM)、走査型電子顕微鏡法(SEM)、シリアルブロック面切片法、およびシリアル集束イオンビーム走査型電子顕微鏡法(FIB / SEM)^2,11,12など、いくつかのイメージング技術があります。骨13,14,15を視覚化し、共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)を介して3D骨細胞モデルを生成するための貴重な技術が開発されました。CLSMは、すべてのラクナボリュームとほとんどの小管を3Dでイメージングできるため、他のイメージング技術ではなく、計算モデリングのためにここで選択されました^16,17。LCN形状は、骨細胞有限要素解析(FEA)のCLSMを使用して生成し、骨のひずみを予測できます。ただし、骨細胞が経験するFFSSを予測するための流体解析は、骨細胞の細胞膜とLCN内の樹状突起のモデリングが必要であり、間質液が¹⁸の周りを移動する狭いラクナ-小管腔のモデリングを可能にする必要があるため、より複雑です。

このプロトコルでは、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)色素を脱灰していない厚い骨切片に適用してから、共焦点顕微鏡で骨内のLCNを標識し、骨細胞樹状突起膜をLCNからのイメージングデータに基づいてモデル化します。ラクナ-小管腔は計算モデリングを使用してシミュレートされ、身体活動による生理学的負荷はCFDアプローチを使用してモデル化されます。骨細胞は、CFDソフトウェアで流体圧力勾配を受け、LCN内の流体プロファイルを分析し、骨細胞および樹状膜上のFFSSを測定します。さらに、FEAアプローチでは、圧縮力学的負荷を加えることにより、骨細胞のひずみや応力を測定することができます。

また、若くて健康な骨の画像から得られた微細構造を修正し、老齢動物や骨疾患のある動物における裂孔小管の形態の変化をシミュレートするための形状修正技術も開発されました。骨の微細構造の変更には、老化に伴う小管の数の減少、ペルルカン欠損症で何が起こるかをモデル化するためのラクナ-小管腔面積の減少、および老化効果をモデル化するためにそれを増やすこと、および糖尿病骨をモデル化するための小管および樹状突起壁面積の減少が含まれ^{ていました5,6}。形状修正技術により、若年動物と老人動物、健康な動物と病気の動物の骨など、さまざまな微細構造を持つ骨の骨細胞が経験するFFSSを比較できます。

全体として、共焦点画像ベースのモデリングは、健康な骨の骨細胞の形態だけでなく、骨細胞の形態の老化/疾患関連の変化をシミュレートするための貴重なツールです。さらに、ラクナ-小管腔の表面積や体積などの骨細胞の形態学的パラメータをさまざまな骨で測定および比較して、機械的ひずみに対する細胞応答を予測できます。

プロトコル

動物実験は、ミズーリ大学カンザスシティ校(UMKC)の動物管理・使用委員会の承認を得て実施され、関連する連邦ガイドラインに準拠していました。

1. 骨の準備プロセス

1. 生後4ヶ月および22ヶ月齢の雌C57BL6マウスから大腿骨を採取し、PBS中の4%パラホルムアルデヒドに冷たく4°Cで24時間固定し、穏やかに揺さぶった後、PBSですすぎ、70%エタノールで保存してから埋め込みます。
   注:固定液量は組織量の約20倍にする必要があります
2. メーカーの指示に従って、速重合アクリル(材料表)に骨をすばやく埋め込みます。
   注:このステップでは、高速重合樹脂を使用することが重要です(~10分)。目的は、ダイヤモンドソーを使用して切片化中に骨組織をサポートすることですが、樹脂がLCNに浸透しないようにすることで、FITCの汚れが浸透するのを防ぐことができます。
3. ダイヤモンドソーを使用して、第3転子の上の標準化された部位から厚さ300 μmの厚い横スライスを切断し、FITC染色前に70%エタノールで4°Cで保存します。
4. 600、800、1200グリットのサンドペーパーを使用して切片を研磨し、最終的な厚さが90~100μmになるようにします。
   注:適切な厚さを得ることは、デジタルキャリパーを使用して確認されました。
5. 切片を70%、95%、100%エタノールでそれぞれ5分間すすぎます。
6. 100%エタノール中の1% FITCで、暗所(RT)で4時間、適度に振とうしながら染色します。
7. 切片を100%エタノールで30分間、暗闇で穏やかに振とうしながら洗浄します。その後、暗闇の中で一晩風乾します。
8. マウントするには、切片を顕微鏡ガラススライド上の封入剤の滴に入れます。鉗子を使用して、切片をスライドに対してできるだけ平らに配置し、気泡の発生を避け、周囲の樹脂を使用してサンプルを操作します。試料にカバースリップを取り付けます。

2. 共焦点顕微鏡

1. FITCで染色された骨切片のイメージングには、共焦点顕微鏡を使用します。
2. 1.7のデジタルズームと0.126μmのステップサイズを備えた100x 1.44NAの石油対物レンズを使用して、1024 x 1024ピクセル、0.089μmピクセルの解像度で400のZ面の詳細なZスタックを収集します。
3. 励起には488nmのレーザーを使用し、発光収集ウィンドウは496〜596nmです。補正設定を使用して画像スタックを収集し、イメージング深度の増加に伴う信号損失を補正します。
4. オーバーサンプリングやライン平均化の増加などの画像収集手法を使用して、画像の精度と解像度を向上させます。また、 図1に示すように、大腿骨断面の横断面を5倍、20倍、100倍の解像度で画像を収集します。
   注: 図1 の低解像度(5倍)画像は、大腿骨の完全な断面積を示しており、100倍のイメージングフィールドに3つの領域が選択されています。
5. 100x Zスタックは、骨細胞のコンピュータモデリングに使用します。

3. コンピュータモデリング

1. 収集した 100x 画像を TIFF 形式で ImageJ ソフトウェアにインポートして、Z 方向の LCN の一連の画像を作成します。
2. Zスタックを3D画像ベースの処理ソフトウェアにインポートして、画像の向きを定義した後、LCNのマスクを作成します。
3. 若いマウスと老齢マウスの元の画像を、それぞれ 30,012 から 45,677 の Hounsfield ユニットと 15,000 から 46,701 の Hounsfield ユニットの間で、LCN によく似せるようにしきい値を設定します。セクションメニューの 「しきい値 」を調整して、マスクに含めるピクセル強度の制限を変更します。
4. Crop Mask(Crop Mask)操作を使用して、スタックから関心領域(ROI)として、その小管を持つ1つのラクナをクロップします。ROI が立方体の中央のラクナを囲み、接続されているすべての小管が立方体の側面に伸びるように ROI を定義します。ラクナを、辺の長さが 21 μm、14 μm、19 μm の架空の大きな立方体に包みます。
5. モデルは複数のパーツから作成されるため、領域拡大操作を実行して接続されたピクセル領域を選択し、ノイズとノイズ除去を行って均一なLCNを生成します。
6. 3D画像ベースの処理ソフトウェアの Calculated Part 操作を使用して、ラクナ-小管マスクをオブジェクトに変換します。
7. スムージング操作を使用してLCNボリュームを減らすことにより、骨細胞と樹状突起膜を構築します。この操作を数回実行して、ラクナと小管の腔の厚さをそれぞれ0.75μmと0.08μm(^9,18)にします。
8. 3D画像ベースの処理ソフトウェアの最後のステップとしてオブジェクト(STL形式)をエクスポートします。
9. LCNと骨細胞樹状膜の2つの層を3Dデータ最適化ソフトウェアにインポートして、ボリュームメッシュを生成します。
10. ソフトウェアの Fix Wizard ツールを使用して、各パーツのメッシュの問題を特定します。各操作後に 、Fix Wizard の診断セクションでメッシュ品質を確認します。
11. 反転した法線パーツ、交差する三角形、および不正な輪郭は、修正ウィザードの自動修正操作を使用して削除します。
12. 重なり合う三角形は、新しい三角形を定義して手動で置き換えるか、 穴を埋める法線 操作によって自動的に置き換えます。
13. 鋭い三角形、小さなエッジ、小さなシェルのフィルタリングなどの操作を使用して、メッシュ品質を向上させます。
14. メッシュ品質を改善した後、LCNと骨細胞-樹状膜の2つの表面を、非多様体アセンブリを使用して両方の部品に属する1つの表面(ラクナ-小管流体空間)に結合します。
15. Remesh操作を使用してラクナ-小管空間のボリュームモデルを作成し、STLファイルとしてエクスポートします。エクスポートセクションでオブジェクトのスケールをマイクロメートル単位で調整します。

4. 3次元画像処理ソフトウェアと3次元データ最適化ソフトウェアによる形状修正技術

注:ジオメトリ修正技術は、加齢や骨疾患による小管密度や直径、ラクナ小管の厚さなど、骨細胞の形態の変化をモデル化するために使用されます。

1. 若い骨細胞を基本モデルとして選択し、形態学的変更を適用することにより、他の異なる骨細胞モデルを構築するように修正します。
2. 3D画像ベースの処理ソフトウェアで画像のしきい値を変更することにより、基本モデルとは異なる小管密度の骨細胞モデルを生成します。
   1. しきい値を低くすると、画像の光強度が減少し、小管の少ないラクナが得られます。閾値化技術の利点は、ラクナの形状とサイズが同じままで、小管密度の影響のみが研究されることです。 図2 は、形状修正技術を使用して若い骨細胞から生成されたシミュレートされた老化モデルを示しています。
3. 3D画像処理ソフトウェアと3Dデータ最適化ソフトウェアで、異なるラクナ-小管腔の厚さまたは樹状突起/小管径の骨細胞モデルを開発します。より大きな骨細胞モデルまたはより小さな骨細胞モデルを、それぞれ ラッピング または スムージング 操作で構築します。 図3 は、若い骨細胞から開発された形状を変更した6つの骨細胞モデルを示しています。

5. CFD解析

注: 体積骨細胞モデルを生成した後、シミュレーション ソフトウェアの CFX モジュールで、ジオメトリ、メッシュ、セットアップなどのいくつかの手順が実行されます。

1. シミュレーションソフトウェアで流体の流れを作成し、CFD解析用のモデルを準備します。
2. 開発した共焦点画像ベースの形状を、ANSYS SpaceClaim(3Dモデリングツール)と呼ばれるCFXのジオメトリセクションにインポートします。設定では、単位寸法をナノメートルに設定します。
3. 幾何学は、LCNと骨細胞樹状突起プロセスの2つの側面として現れます。トップメニューの ファセット をクリックして、交差、鋭角または過剰に接続されたエッジ、各ファセットの頂点、開口部、穴などの幾何学的エラーを削除します。
4. ファセットメニューの「減算」をクリックして、大きなファセットであるLCNから小さなファセットと骨細胞樹状突起のプロセスを縮小し、ラクナ-小管腔の単一のボディを実現します。次に、生成されたファセットを右クリックし、面をマージせずにファセットからソリッドドメインに変換します。図4は、ラクナ-小管腔を表す若い骨細胞モデルの断面積を示しています。
5. meshをクリックし、0.06 μmの要素サイズを使用して線形四面体要素を選択します。メッシュ収束スタディでメッシュを細分化し、結果がメッシュサイズに依存しないように、小さな樹枝系に十分な要素を配置します。
6. サーフェスを選択し、仮想立方体の上側にある小管を流体入口として選択します。 Box select を使用して、他の 5 つの面の小管を流体出口として選択します。
7. メッシュ (fluent ファイル形式) をエクスポートし、次の手順でセットアップでの読み込みが速くなります。
8. シミュレーションソフトウェアで別の流体フローを作成し、流暢なメッシュをCFXのセットアップセクションにインポートします。「 境界の挿入」(Insert Boundary ) オプションを使用して、入口/出口として事前に選択された面の入口と出口の 2 つの境界条件を定義します。
9. 生理学的条件を模倣するには、入口と出口にそれぞれ300Paと0Paの流体入口圧力をそれぞれ^19,20で加えます。残りのサーフェスを、壁の界面で速度がゼロの流体で滑り止め状態の壁として扱います。液体は、樹状突起と骨細胞体周辺の入口から流れ、出口として割り当てられた他の小管から出ます。
10. 間質層流動を、材料ライブラリから選択した水⁹として扱います。 熱伝達、燃焼、 および熱輻射 セクションを なしに設定します (問題では熱伝達が定義されていないため)。LCN の流体特性として 乱流 モード(層流^{流体 9})を選択します。
11. 提出タイプとして Double Precision と Direct Start を使用してソフトウェアを実行します。残差が減少して一定になるまで、質量と運動量を監視します。解析の収束後、CFDソフトウェアのCFD-postセクションを使用してFFSSデータを測定します。

6. CFD後処理

1. 骨細胞とその樹状突起が経験するFFSSを描写するには、CFDソフトウェアの結果セクションに新しい輪郭を挿入します。ドメインでの変数として骨細胞-樹状膜上の壁せん断を選択することにより、FFSSコンターを作成します。
   注:樹状膜で高いFFSSをより適切に表示するために、FFSSの範囲を ユーザー指定 に設定して、FFSSの最小/最大値を変更します。
2. 流速流線の等高線を流入口からラクナ-小管領域内に挿入します。サンプリングを等間隔に設定し、ポイントの数を 2500 として選択します。CFDソフトウェアのアニメーションセクションは、速度流線グラフを使用して、流体粒子がラクナ-小管空間内をどのように流れるかを3Dで正確に表示します。
3. CFDソフトウェアの 関数計算 ツールを使用して、特にさまざまな骨細胞モデル(若年者と高齢者)がある場合に、幾何学的パラメータに基づいてFFSSの大きさまたは速度を分析します。ラクナ-小管空間の体積と表面積を、最大、最小、または平均のFFSS値とともに幾何学的パラメータとして測定します。

結果

このプロトコルでは、機械的負荷により骨細胞とその樹状突起が受ける流体の流れせん断応力の量を調査するために、共焦点由来の骨細胞モデルを開発する方法について説明します。老化したC57BL6マウスと若いC57BL6マウスを選択し、若くて老化した共焦点画像ベースの骨細胞モデルを作製しました。他の6つのシミュレートされた骨細胞モデルは、同じ若い骨細胞モ?...

ディスカッション

このプロトコルは、骨細胞の視覚化と計算モデリングのための共焦点イメージング技術の概要を示しています。共焦点イメージングの前に、骨サンプルを切片化および染色するための骨調製プロセスが行われます。100倍の倍率の共焦点画像は、骨細胞とラクナ-小管腔のコンピューターモデルを開発するために、さまざまなソフトウェアにインポートされます。最後?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,200 Grit sandpaper	Buehler	30-5170-012-100
3-Matic software	Materialise	https://www.materialise.com/en/industrial/software/3-matic	3D data optimization software
600 grit sandpaper	Buehler	30-5118-600-100
800 Grit sandpaper	Buehler	30-5170-800-100
ANSYS software	ANSYS	https://www.ansys.com/	simulation software
Fluorescein Isothiocyanate (FITC)	Sigma-Aldrich	F7250
ImageJ software		https://imagej.net/ij/
Immersion Oil for Microscopes	Leica Microsystems	195371-10-9
Leica TCS Sp5 II confocal microscope	Leica Microsystems	TCS Sp5 II
Leitz 1600 inner hole diamond saw	Leica
MIMICS Innovation Suite software	Materialise	https://www.materialise.com/en/healthcare/mimics-innovation-suite	3D image-based processing software
Permount mount medium	Fisher scientific	SP15-500
Sampl-Kwick Fast Cure Acrylic Kit	Buehler	20-3560
Single Platform Laboratory Shaker	Reliable scientific INC	Model 55S