Analisi e imaging degli osteociti

Riepilogo

Questo studio delinea il metodo per visualizzare e sviluppare modelli tridimensionali (3D) di osteociti all'interno della rete lacunare-canalicolare (LCN) per l'analisi della fluidodinamica computazionale (CFD). I modelli generati utilizzando questo metodo aiutano a comprendere la meccanosensazione degli osteociti in ossa sane o malate.

Abstract

Gli osteociti sono le cellule ossee che si ritiene rispondano alle sollecitazioni meccaniche e allo stress da taglio del flusso di fluidi (FFSS) attivando vari percorsi biologici in un processo noto come meccanotrasduzione. I modelli confocali derivati da immagini di reti di osteociti sono uno strumento prezioso per condurre analisi di fluidodinamica computazionale (CFD) per valutare le sollecitazioni di taglio sulla membrana degli osteociti, che non possono essere determinate mediante misurazione diretta. La modellazione computazionale utilizzando queste immagini ad alta risoluzione dell'architettura microstrutturale dell'osso è stata utilizzata per simulare numericamente il carico meccanico esercitato sull'osso e comprendere la stimolazione indotta dal carico degli osteociti.

Questo studio elabora i metodi per sviluppare modelli 3D di singoli osteociti utilizzando immagini al microscopio confocale della rete Lacunar-Canalicolare (LCN) per eseguire analisi CFD utilizzando vari software di modellazione computazionale. Prima della microscopia confocale, le ossa del topo vengono sezionate e colorate con il colorante isotiocianato di fluoresceina (FITC) per marcare l'LCN. A una risoluzione di 100x, le immagini Z-stack vengono raccolte utilizzando un microscopio confocale e importate nel software MIMICS (software di elaborazione 3D basato su immagini) per costruire un modello di superficie dei processi LCN e osteociti-dendritici.

Queste superfici vengono quindi sottratte utilizzando un'operazione booleana nel software 3-Matic (software di ottimizzazione dei dati 3D) per modellare lo spazio fluidico lacunare attorno al corpo cellulare degli osteociti e lo spazio canalicolare attorno ai dendriti contenenti liquido lacunocanalicolare. La geometria volumetrica 3D del fluido viene importata nel software ANSYS (software di simulazione) per l'analisi CFD. ANSYS CFX (software CFD) viene utilizzato per applicare il carico fisiologico sull'osso sotto forma di pressione del fluido e per determinare le sollecitazioni di taglio della parete sugli osteociti e i processi dendritici. La morfologia dell'LCN influenza i valori di sforzo di taglio rilevati dalla membrana cellulare degli osteociti e dai processi cellulari. Pertanto, i dettagli su come vengono sviluppati i modelli confocali basati su immagini possono essere preziosi per comprendere la meccanosensazione degli osteociti e possono gettare le basi per studi futuri in questo settore.

Introduzione

Si ipotizza che gli osteociti regolino la massa ossea in risposta all'esercizio fisico¹. La deformazione della membrana degli osteociti e i loro processi dendritici dovuti al carico meccanico, li sottopone a FFSS, che viene rilevata dagli osteociti e innesca la segnalazione intracellulare ^2,3,4. La microstruttura ossea subisce deterioramenti o alterazioni della sua morfologia lacunare-canalicolare a causa dell'invecchiamento o di malattie ossee come l'osteoporosi e il diabete e in condizioni come la carenza di perlecan che causa una compromissione della meccano-responsività degli osteociti ^5,6. Questi cambiamenti nell'architettura ossea fanno sì che gli osteociti sperimentino diversi livelli di FFSS e ceppi ^7,8. È importante sottolineare che la FFSS sperimentata dagli osteociti in risposta al carico meccanico è difficile da quantificare in vivo perché è incorporata nella matrice ossea calcificata.

La modellazione confocale basata su immagini è una tecnica potente per superare i limiti dello studio di osteociti inaccessibili nel loro ambiente naturale replicando modelli computerizzati della LCN ^9,10. L'elaborazione e la modellazione della rete interconnessa di LCN in 3D è stata una sfida. Esistono diverse tecniche di imaging, come la microscopia elettronica a trasmissione (TEM), la microscopia elettronica a scansione (SEM), il sezionamento seriale della faccia a blocchi e la microscopia elettronica a scansione a scansione a fascio ionico focalizzato seriale (FIB/SEM)^2,11,12. È stata sviluppata una tecnica preziosa per visualizzare l'osso 13,14,15 e generare modelli 3D di osteociti tramite microscopia confocale a scansione laser (CLSM). Il CLSM è stato scelto qui per la modellazione computazionale piuttosto che per altre tecniche di imaging grazie alla sua capacità di visualizzare tutto il volume di lacuna e la maggior parte dei canalicoli in 3D^16,17. La geometria LCN può essere generata utilizzando CLSM per l'analisi degli elementi finiti (FEA) degli osteociti per prevedere i ceppi ossei. Tuttavia, l'analisi dei fluidi per prevedere la FFSS sperimentata dagli osteociti è più complicata in quanto richiede la modellazione della membrana cellulare dell'osteocita e dei suoi dendriti all'interno dell'LCN per consentire la modellazione dello stretto spazio lacunare-canalicolare, in cui il liquido interstiziale si muove intorno a¹⁸.

In questo protocollo, il colorante isotiocianato di fluoresceina (FITC) viene applicato a sezioni ossee spesse non decalcificate prima della microscopia confocale per marcare l'LCN all'interno dell'osso e le membrane osteociti-dendritiche vengono modellate sulla base dei dati di imaging dell'LCN. Lo spazio lacunare-canalicolare viene simulato utilizzando la modellazione computazionale e il carico fisiologico dovuto all'attività fisica viene modellato utilizzando un approccio CFD. Gli osteociti sono sottoposti a un gradiente di pressione del fluido nel software CFD per analizzare il profilo del fluido all'interno dell'LCN e misurare la FFSS sulle membrane osteocitarie e dendritiche. Inoltre, un approccio FEA può misurare le deformazioni o le sollecitazioni degli osteociti applicando un carico meccanico compressivo.

È stata inoltre sviluppata una tecnica di modifica della geometria per modificare le microstrutture derivate da immagini di osso giovane e sano al fine di simulare l'alterazione della morfologia lacunare-canalicolare negli animali anziani o con malattie ossee. Le alterazioni della microstruttura ossea includevano la riduzione del numero di canalicoli con l'invecchiamento, la riduzione dell'area dello spazio lacunare-canalicolare per modellare ciò che accade nella carenza di perlecan e aumentarla per modellare gli effetti dell'invecchiamento, e la riduzione dell'area della parete canalicolare e dendritica per modellare l'osso diabetico ^5,6. La tecnica di modifica della geometria ci permette di confrontare la FFSS sperimentata dagli osteociti nelle ossa con diverse microstrutture, come i giovani rispetto agli anziani o le ossa negli animali sani rispetto a quelli malati.

Nel complesso, la modellazione confocale basata su immagini è uno strumento prezioso per simulare la morfologia degli osteociti nell'osso sano e nei cambiamenti associati all'invecchiamento/alla malattia nella morfologia degli osteociti. Inoltre, i parametri morfologici degli osteociti, come l'area superficiale e il volume dello spazio lacunare-canalicolare, possono essere misurati e confrontati in varie ossa per prevedere le risposte cellulari alla sollecitazione meccanica.

Protocollo

Gli esperimenti sugli animali sono stati condotti con l'approvazione del Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali presso l'Università del Missouri, Kansas City (UMKC), e sono stati conformi alle linee guida federali pertinenti.

1. Processo di preparazione ossea

1. Raccogliere i femmina di topi C57BL6 di 4 mesi e 22 mesi e fissarli in paraformaldeide fredda al 4% in PBS per 24 ore a 4 °C con un leggero dondolio, quindi sciacquarli in PBS e conservarli in etanolo al 70% prima di incorporarli.
   NOTA: Il volume fissativo dovrebbe essere circa 20 volte il volume del tessuto
2. Incorporare rapidamente le ossa in un acrilico a polimerizzazione rapida (Tabella dei materiali) seguendo le istruzioni del produttore.
   NOTA: È importante utilizzare una resina a polimerizzazione rapida per questa fase (~10 min). Lo scopo è quello di sostenere il tessuto osseo durante il sezionamento utilizzando la sega diamantata, ma senza che la resina penetri nell'LCN, il che impedirebbe alla macchia FITC di penetrare.
3. Tagliare fette trasversali spesse 300 μm di spessore da un sito standardizzato sopra il terzo trocantere utilizzando una sega diamantata e conservarle a 4 °C in etanolo al 70% prima della colorazione FITC.
4. Lucidare le sezioni utilizzando carta vetrata a grana 600, 800 e poi 1200 fino a uno spessore finale di ~90-100 μm.
   NOTA: Il raggiungimento del corretto spessore è stato garantito utilizzando un calibro digitale.
5. Sciacquare le sezioni in etanolo al 70%, 95% e 100% per 5 minuti ciascuna.
6. Colorarli in FITC all'1% in etanolo al 100% per 4 ore a temperatura ambiente (RT) al buio agitando moderatamente.
7. Lavare le sezioni in etanolo al 100% per 30 minuti agitando delicatamente al buio. Quindi, asciugali all'aria per una notte al buio.
8. Per il montaggio, posizionare la sezione in una goccia di supporto di montaggio su un vetrino da microscopio. Utilizzare una pinza per posizionare la sezione il più piatta possibile contro il vetrino, evitando di generare bolle d'aria e utilizzando la resina circostante per manipolare il campione. Montare un vetrino coprioggetti sul campione.

2. Microscopia confocale

1. Utilizzare un microscopio confocale per l'imaging di fette ossee colorate con FITC.
2. Utilizza un obiettivo a olio 100x 1,44NA con uno zoom digitale di 1,7 e una dimensione del passo di 0,126 μm per raccogliere stack Z dettagliati di 400 piani Z a 1024 x 1024 pixel, risoluzione pixel di 0,089 μm.
3. Utilizzare un laser a 488 nm per l'eccitazione, con una finestra di raccolta delle emissioni di 496-596 nm. Raccogli le pile di immagini utilizzando le impostazioni di compensazione per correggere la perdita di segnale con l'aumentare della profondità dell'immagine.
4. Aumenta l'accuratezza e la risoluzione delle immagini utilizzando tecniche di raccolta delle immagini come il sovracampionamento e l'aumento della media delle linee. Inoltre, raccogli le immagini con un ingrandimento di risoluzione 5x, 20x e 100x delle sezioni trasversali delle sezioni del femore, come mostrato nella Figura 1.
   NOTA: L'immagine a bassa risoluzione (5x) nella Figura 1 mostra l'intera area della sezione trasversale del femore, con tre regioni selezionate per campi di imaging 100x.
5. Utilizza gli Z-stack 100x per la modellazione computerizzata degli osteociti.

3. Modellazione al computer

1. Importa le immagini 100x raccolte, in formato TIFF, nel software ImageJ per creare una sequenza di immagini dell'LCN in direzione Z.
2. Importa gli Z-stack nel software di elaborazione 3D basato su immagini per costruire una maschera dell'LCN dopo aver definito l'orientamento dell'immagine.
3. Soglia l'immagine originale dei topi giovani e anziani tra 30.012-45.677 unità di Hounsfield e 15.000-46.701 unità di Hounsfield, rispettivamente, per assomigliare molto alla LCN. Regolate la Soglia nel menu della sezione per modificare i limiti di intensità dei pixel da includere in una maschera.
4. Ritaglia una lacuna con i relativi canalicoli come regione di interesse (ROI) dalla pila utilizzando l'operazione Maschera di ritaglio . Definire la ROI in modo che circondi la lacuna al centro del cubo e che tutti i relativi canalicoli collegati si estendano ai lati del cubo. Racchiudi la lacuna in un cubo immaginario più grande con lunghezze laterali di 21 μm, 14 μm e 19 μm.
5. Poiché il modello è costituito da più parti, eseguire un'operazione di ingrandimento della regione per selezionare le regioni di pixel collegate, rimuovere il rumore e despeckle per generare un LCN uniforme.
6. Converti la maschera lacunare-canalicolare in un oggetto utilizzando l'operazione Parte calcolata nel software di elaborazione 3D basato su immagini.
7. Costruire le membrane osteocitarie e dendritiche riducendo il volume LCN utilizzando l'operazione di levigatura. Eseguire questa operazione più volte per ottenere uno spessore dello spazio lacunare e canalicolare di 0,75 μm e 0,08 μm, rispettivamente ^9,18.
8. Esportazione degli oggetti (formato STL) come ultimo passaggio nel software di elaborazione 3D basato su immagini.
9. Importa due strati dell'LCN e delle membrane osteociti-dendritiche nel software di ottimizzazione dei dati 3D per generare una mesh di volume.
10. Utilizza lo strumento Fix Wizard nel software per identificare i problemi di mesh in ogni parte. Controllare la qualità della mesh nella sezione diagnostica della procedura guidata di correzione dopo ogni operazione.
11. Rimuovere le parti normali invertite, i triangoli che si intersecano e i contorni errati utilizzando l'operazione di correzione automatica nella procedura guidata di correzione.
12. Sostituire i triangoli sovrapposti manualmente definendone di nuovi o automaticamente tramite l'operazione Riempi foro normale .
13. Migliora la qualità della mesh utilizzando operazioni che includono il filtraggio di triangoli acuti, bordi piccoli e piccoli gusci.
14. Dopo aver migliorato la qualità della mesh, combinare due superfici dell'LCN e delle membrane osteociti-dendritiche in un'unica superficie (spazio fluidico lacunare-canalicolare) che appartiene a entrambe le parti utilizzando un assemblaggio non collettore.
15. Creare un modello volumetrico dello spazio lacunare-canalicolare utilizzando l'operazione Remesh e quindi esportarlo come file STL. Regola la scala dell'oggetto in modo che sia in micrometri nella sezione di esportazione.

4. Tecnica di modifica della geometria nel software di elaborazione 3D basato su immagini e nel software di ottimizzazione dei dati 3D

NOTA: La tecnica di modifica della geometria viene utilizzata per modellare i cambiamenti nella morfologia degli osteociti, come la densità e il diametro canalicolare e lo spessore lacunare-canalicolare dovuti all'invecchiamento o alle malattie ossee.

1. Scegli il giovane osteocita come modello base e modificalo per costruire altri modelli di osteociti distinti applicando alterazioni morfologiche.
2. Genera un modello di osteociti con densità canalicolari diverse dal modello di base modificando la soglia dell'immagine nel software di elaborazione 3D basato su immagini.
   1. Selezionare una soglia più bassa per ridurre l'intensità luminosa dell'immagine e ottenere una lacuna con meno canalicoli. Il vantaggio della tecnica del thresholding è che la forma e la dimensione della lacuna rimangono le stesse e viene studiata solo l'influenza della densità canalicolare. La Figura 2 mostra il modello invecchiato simulato generato dal giovane osteocita utilizzando la tecnica di modifica della geometria.
3. Sviluppa modelli di osteociti con diversi spessori dello spazio lacunare-canalicolare o diametri dendritici/canalicolari nel software di elaborazione 3D basato su immagini e nel software di ottimizzazione dei dati 3D. Costruisci modelli di osteociti più grandi o più piccoli rispettivamente con operazioni di avvolgimento o levigatura . La Figura 3 mostra sei modelli di osteociti con geometria alterata sviluppati dal giovane osteocita.

5. Analisi CFD

NOTA: Dopo aver generato i modelli volumetrici di osteociti, nel modulo CFX del software di simulazione vengono eseguiti diversi passaggi, tra cui la geometria, la mesh e l'impostazione.

1. Creare un flusso di fluido nel software di simulazione per preparare i modelli per l'analisi CFD.
2. Importa le geometrie confocali basate su immagini sviluppate nella sezione geometrica di CFX, nota come ANSYS SpaceClaim (strumento di modellazione 3D). Impostare le dimensioni dell'unità su nanometri nell'impostazione.
3. La geometria appare come due aspetti della LCN e dei processi osteociti-dendritici. Fare clic su Sfaccettatura nel menu in alto e rimuovere gli errori geometrici come intersezioni, spigoli vivi o sovraconnessi e vertici, aperture o fori per ogni sfaccettatura.
4. Fare clic su Sottrai nel menu Sfaccettatura per ridurre la faccetta più piccola e i processi osteociti-dendritici dalla faccetta più grande, l'LCN, per ottenere un unico corpo di spazio lacunare-canalicolare. Quindi, fare clic con il pulsante destro del mouse sulla sfaccettatura generata e convertirla da sfaccettature a un dominio solido senza unire le facce. La Figura 4 illustra l'area della sezione trasversale del modello di osteocita giovane, che rappresenta lo spazio lacunare-canalicolare.
5. Fare clic sulla mesh e selezionare gli elementi tetraedrici lineari utilizzando una dimensione dell'elemento di 0,06 μm. Perfeziona la mesh con uno studio di convergenza della mesh per avere abbastanza elementi nel minuscolo sistema dendritico per garantire che i risultati siano indipendenti dalla dimensione della mesh.
6. Seleziona la superficie e scegli i canalicoli sul lato superiore del cubo immaginario come ingressi del fluido. Selezionare i canalicoli sulle altre cinque facce come uscite del fluido utilizzando la casella di selezione.
7. Esporta la mesh (formato di file fluente) man mano che si carica più velocemente nella configurazione nel passaggio successivo.
8. Creare un altro flusso di fluido nel software di simulazione e importare la mesh fluente nella sezione di configurazione di CFX. Definire due condizioni al contorno di ingressi e uscite per le facce preselezionate come ingressi/uscite utilizzando l'opzione Inserisci contorno .
9. Per imitare le condizioni fisiologiche, esercitare una pressione di ingresso del fluido di 300 Pa e 0 Pa sugli ingressi e sulle uscite, rispettivamente^19,20. Trattare le superfici rimanenti come pareti con una condizione di non scivolamento in quel fluido che ha velocità zero all'interfaccia delle pareti. Il fluido scorre dagli ingressi intorno ai dendriti e al corpo cellulare degli osteociti ed esce dagli altri canalicoli assegnati come sbocchi.
10. Trattare il liquido laminare interstiziale come acqua⁹, scelta dalla libreria dei materiali. Impostate le sezioni Trasferimento di calore, Combustione e Radiazione termica su Nessuno, poiché nel problema non è definito alcun trasferimento di calore. Selezionare la modalità Turbolenza come caratteristica del fluido nell'LCN, che è un fluido laminare⁹.
11. Eseguire il software utilizzando Doppia precisione e Avvio diretto come tipo di invio. Monitorare la massa e la quantità di moto fino a quando i residui non scendono e diventano costanti. Dopo la convergenza della soluzione, misurare i dati FFSS utilizzando la sezione CFD-post del software CFD.

6. Post-elaborazione CFD

1. Per rappresentare la FFSS sperimentata dagli osteociti e dai loro dendriti, inserire un nuovo contorno nella sezione dei risultati del software CFD. Crea un contorno FFSS scegliendo il taglio della parete sulle membrane osteociti-dendritiche come variabile al dominio.
   NOTA: Per mostrare meglio un FFSS elevato sulle membrane dendritiche, l'intervallo di FFSS è impostato su Specificato dall'utente per modificare i valori min/max di FFSS.
2. Inserire un contorno delle linee di flusso di velocità all'interno del dominio lacunare-canalicolare a partire dalle bocchette. Impostate il campionamento su equidistanza e selezionate il numero di punti come 2500. Una sezione di animazione nel software CFD mostra accuratamente in 3D come le particelle di fluido fluiscono all'interno degli spazi lacunari-canalicolari utilizzando il grafico di velocità di flusso.
3. Utilizza lo strumento Function Calculator nel software CFD per analizzare l'entità della FFSS o la velocità in base a parametri geometrici, specialmente dove ci sono vari modelli di osteociti (ad esempio, giovani o anziani). Misurare il volume e l'area superficiale dello spazio lacunare-canalicolare come parametri geometrici insieme ai valori FFSS massimi, minimi o medi.

Risultati

Questo protocollo descrive come sviluppare modelli di osteociti di derivazione confocale per studiare la quantità di stress di taglio del flusso di fluido a cui un osteocita e i suoi processi dendritici sono sottoposti a causa del carico meccanico. Un topo C57BL6 invecchiato e uno giovane sono stati selezionati per costruire modelli di osteociti confocali basati su immagini giovani e invecchiati. Altri sei modelli di osteociti simulati sono stati generati dallo stesso modello di osteoci...

Discussione

Questo protocollo delinea una tecnica di imaging confocale per la visualizzazione e la modellazione computazionale degli osteociti. Prima dell'imaging confocale, viene eseguito il processo di preparazione ossea per il sezionamento e la colorazione dei campioni ossei. Le immagini confocali con ingrandimento 100x vengono importate in vari software per sviluppare modelli computerizzati degli osteociti e dello spazio lacunare-canalicolare. Infine, viene condotta un'analisi CFD sui modelli co...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,200 Grit sandpaper	Buehler	30-5170-012-100
3-Matic software	Materialise	https://www.materialise.com/en/industrial/software/3-matic	3D data optimization software
600 grit sandpaper	Buehler	30-5118-600-100
800 Grit sandpaper	Buehler	30-5170-800-100
ANSYS software	ANSYS	https://www.ansys.com/	simulation software
Fluorescein Isothiocyanate (FITC)	Sigma-Aldrich	F7250
ImageJ software		https://imagej.net/ij/
Immersion Oil for Microscopes	Leica Microsystems	195371-10-9
Leica TCS Sp5 II confocal microscope	Leica Microsystems	TCS Sp5 II
Leitz 1600 inner hole diamond saw	Leica
MIMICS Innovation Suite software	Materialise	https://www.materialise.com/en/healthcare/mimics-innovation-suite	3D image-based processing software
Permount mount medium	Fisher scientific	SP15-500
Sampl-Kwick Fast Cure Acrylic Kit	Buehler	20-3560
Single Platform Laboratory Shaker	Reliable scientific INC	Model 55S