골세포(osteocyte)의 분석 및 이미징

요약

이 연구는 전산 유체 역학(CFD) 분석을 위해 LCN(lacunar-canalicular network) 내에서 골세포의 3차원(3D) 모델을 시각화하고 개발하는 방법을 설명합니다. 이 방법을 사용하여 생성된 모델은 건강하거나 병든 뼈에서 골세포 기계감각을 이해하는 데 도움이 됩니다.

초록

골세포(osteocyte)는 기계전달(mechanotransduction)으로 알려진 과정에서 다양한 생물학적 경로를 활성화하여 기계적 변형과 유체 흐름 전단 응력(FFSS)에 반응하는 것으로 생각되는 뼈 세포입니다. 골세포 네트워크의 컨포칼 이미지 파생 모델은 직접 측정으로 결정할 수 없는 골세포막의 전단 응력을 평가하기 위해 CFD(Computational Fluid Dynamics) 분석을 수행하는 데 유용한 도구입니다. 뼈의 미세 구조 구조에 대한 이러한 고해상도 이미지를 사용한 컴퓨터 모델링을 사용하여 뼈에 가해지는 기계적 하중을 수치적으로 시뮬레이션하고 골세포의 하중 유도 자극을 이해했습니다.

본 연구에서는 Lacunar-Canalicular Network(LCN)의 컨포칼 현미경 이미지를 이용하여 3D 단일 골세포 모델을 개발하고, 다양한 컴퓨터 모델링 소프트웨어를 활용하여 CFD 해석을 수행하는 방법을 연구한다. 컨포칼 현미경 검사에 앞서 마우스 뼈를 절편하고 FITC(Fluorescein isothiocyanate) 염료로 염색하여 LCN을 라벨링합니다. 100x 해상도에서 컨포칼 현미경을 사용하여 Z-stack 이미지를 수집하고 MIMICS 소프트웨어(3D 이미지 기반 처리 소프트웨어)로 가져와 LCN 및 골세포-수지상 과정의 표면 모델을 구성합니다.

그런 다음 3-Matic 소프트웨어(3D 데이터 최적화 소프트웨어)에서 부울 연산을 사용하여 이러한 표면을 빼서 골세포 세포체 주위의 틈새 유체 공간과 틈새낭 유체를 포함하는 수상돌기 주위의 이관 공간을 모델링합니다. CFD 해석을 위해 3D 체적 유체 형상을 ANSYS 소프트웨어(시뮬레이션 소프트웨어)로 가져옵니다. ANSYS CFX(CFD 소프트웨어)는 유체 압력으로 뼈에 생리적 하중을 가하는 데 사용되며, 골세포 및 수지상 돌기에 대한 벽 전단 응력을 측정합니다. LCN의 형태는 골세포 세포막과 세포 돌기에 의해 감지되는 전단 응력 값에 영향을 미칩니다. 따라서 컨포칼 이미지 기반 모델을 개발하는 방법에 대한 세부 정보는 골세포 기계감각을 이해하는 데 유용할 수 있으며 이 분야의 향후 연구를 위한 토대를 마련할 수 있습니다.

서문

골세포(osteocyte)는 신체 운동에 대한 반응으로 골량을 조절하는 것으로 가정된다¹. 기계적 부하로 인한 골세포의 막변형과 수지상 돌기는 FFSS를 유발하며, 이는 골세포에 의해 감지되고 세포 내 신호 전달 ^2,3,4를 유발합니다. 뼈 미세구조는 노화 또는 골다공증 및 당뇨병과 같은 뼈 질환으로 인해 골세포의 기계적 반응성 장애를 유발하는 펄레칸 결핍과 같은 상태로 인해 골수관 형태의 악화 또는 변화를 겪습니다 ^5,6. 이러한 뼈 구조의 변화로 인해 골세포는 다양한 수준의 FFSS와 균주를 경험하게 됩니다 ^7,8. 중요한 것은 기계적 부하에 대한 반응으로 골세포가 경험하는 FFSS는 석회화된 뼈 기질에 내장되어 있기 때문에 생체 내에서 정량화하기 어렵다는 것입니다.

컨포칼 이미지 기반 모델링은 LCN ^9,10의 컴퓨터 모델을 복제하여 자연 환경에서 접근할 수 없는 골세포를 연구하는 한계를 극복하는 강력한 기술입니다. LCN의 상호 연결된 네트워크를 3D로 처리하고 모델링하는 것은 어려운 작업이었습니다. 투과 전자 현미경 (TEM), 주사 전자 현미경 (SEM), 연속 블록 얼굴 절편 및 직렬 집속 이온 빔 주사 전자 현미경 (FIB / SEM) ^2,11,12와 같은 여러 이미징 기술이 있습니다. 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)을 통해 뼈 13,14,15를 시각화하고 3D 골세포 모델을 생성하기 위한 귀중한 기술이 개발되었습니다. CLSM은 3D에서 모든 틈새 부피와 대부분의 근관을 이미지화할 수 있는 능력 때문에 다른 이미징 기술보다 컴퓨터 모델링을 위해 여기에서 선택되었습니다^16,17. LCN 기하학은 골세포 유한 요소 분석(FEA)을 위한 CLSM을 사용하여 뼈 변형을 예측할 수 있습니다. 그러나 골세포가 경험하는 FFSS를 예측하기 위한 유체 분석은 간질액이^{약 18}도로 이동하는 좁은 열공-이관 공간을 모델링할 수 있도록 LCN 내의 골세포의 세포막과 수상돌기의 모델링이 필요하기 때문에 더 복잡합니다.

이 프로토콜에서는 컨포칼 현미경 검사 전에 석회질화되지 않은 두꺼운 뼈 절편에 FITC(fluorescein isothiocyanate) 염료를 적용하여 뼈 내부의 LCN을 라벨링하고, LCN의 이미징 데이터를 기반으로 골세포-수지상 막을 모델링합니다. 틈새-이관 공간은 컴퓨터 모델링을 사용하여 시뮬레이션하고 신체 활동으로 인한 생리학적 하중은 CFD 접근 방식을 사용하여 모델링합니다. 골세포는 CFD 소프트웨어에서 유체 압력 구배를 거쳐 LCN 내부의 유체 프로파일을 분석하고 골세포 및 수지상막에서 FFSS를 측정합니다. 또한 FEA 접근법은 압축된 기계적 하중을 적용하여 골세포 변형 또는 응력을 측정할 수 있습니다.

또한 노화된 동물이나 뼈 질환이 있는 동물의 변형된 틈새-이관 형태를 시뮬레이션하기 위해 젊고 건강한 뼈의 이미지에서 파생된 미세 구조를 수정하기 위해 기하학적 수정 기술도 개발되었습니다. 뼈 미세구조의 변경에는 노화에 따른 이관 수 감소, 펄레칸 결핍에서 일어나는 일을 모델링하기 위해 틈새-이관 공간 영역을 줄이고 노화 효과를 모델링하기 위해 증가, 당뇨병 뼈를 모델링하기 위해 이관 및 수상돌기 벽 면적을 줄이는 것이 포함되었습니다 ^5,6. 기하학적 변형 기법을 사용하면 뼈의 골세포가 경험하는 FFSS를 젊은 동물과 노화된 동물의 뼈 또는 건강한 동물과 병든 동물의 뼈와 같은 다양한 미세 구조를 가진 것으로 비교할 수 있습니다.

전반적으로 컨포칼 이미지 기반 모델링은 건강한 뼈에서 골세포의 형태뿐만 아니라 골세포 형태학의 노화/질병 관련 변화를 시뮬레이션하는 데 유용한 도구입니다. 또한, lacunar-canalicular space의 표면적 및 부피와 같은 osteocyte 형태학적 매개변수를 다양한 뼈에서 측정하고 비교하여 기계적 변형에 대한 세포 반응을 예측할 수 있습니다.

프로토콜

동물 실험은 UMKC(University of Missouri, Kansas City)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받아 수행되었으며 관련 연방 지침을 준수했습니다.

1. 뼈 준비 과정

1. 생후 4개월과 22개월 된 암컷 C57BL6 마우스의 대퇴골을 채취하여 PBS의 차가운 4% 파라포름알데히드에 4°C에서 24시간 동안 부드럽게 흔들어 고정한 다음 PBS에서 헹구고 70% 에탄올에 보관한 후 매립합니다.
   참고: 정착량은 조직 부피의 약 20배여야 합니다.
2. 제조업체의 지침에 따라 빠른 중합 아크릴(Table of Materials)에 뼈를 빠르게 삽입하십시오.
   참고: 이 단계(~10분)에는 빠른 중합 수지를 사용하는 것이 중요합니다. 목적은 다이아몬드 톱을 사용하여 절편하는 동안 뼈 조직을 지지하는 것이지만 수지가 LCN으로 침투하지 않아 FITC 염색이 침투하는 것을 막을 수 있습니다.
3. 다이아몬드 톱을 사용하여 세 번째 트로챈터 위의 표준화된 부위에서 300μm 두께의 두꺼운 횡방향 슬라이스를 절단하고 FITC 염색 전에 4°C의 70% 에탄올에 보관합니다.
4. 600, 800, 1200방 사포를 사용하여 단면을 연마하여 최종 두께가 ~90-100μm가 되도록 합니다.
   참고: 디지털 캘리퍼를 사용하여 적절한 두께를 확보했습니다.
5. 섹션을 70%, 95% 및 100% 에탄올로 각각 5분 동안 헹굽니다.
6. 100% 에탄올에 1% FITC를 넣고 어두운 곳에서 적당한 쉐이킹으로 4시간 동안 염색합니다.
7. 100% 에탄올로 섹션을 30분 동안 세척하고 어둠 속에서 부드럽게 흔듭니다. 그런 다음 어둠 속에서 밤새 자연 건조하십시오.
8. 장착하려면 유리 현미경 슬라이드의 장착 매체 한 방울에 섹션을 놓습니다. 겸자를 사용하여 슬라이드에 대해 섹션을 가능한 한 평평하게 배치하여 기포가 생성되지 않도록 하고 주변 수지를 사용하여 샘플을 조작합니다. 시편에 커버슬립을 장착합니다.

2. 컨포칼 현미경 검사

1. 컨포칼 현미경을 사용하여 FITC로 염색된 뼈 절편의 이미징을 수행합니다.
2. 1.7의 디지털 줌과 0.126μm의 스텝 크기를 가진 100x 1.44NA 오일 대물렌즈를 사용하여 1024 x 1024 픽셀, 0.089 μm 픽셀 해상도에서 400개의 Z-평면에 대한 상세한 Z-스택을 수집합니다.
3. 여기(excitation)를 위해 496-596nm의 방출 수집 창과 함께 488nm 레이저를 사용합니다. 이미징 깊이가 증가함에 따라 신호 손실을 보정하기 위해 보정 설정을 사용하여 이미지 스택을 수집합니다.
4. 오버샘플링 및 라인 평균화 증가와 같은 이미지 수집 기술을 사용하여 이미지의 정확도와 해상도를 높입니다. 또한 그림 1과 같이 대퇴골 단면의 횡단면을 5배, 20배, 100배 해상도로 확대하여 이미지를 수집합니다.
   참고: 그림 1 의 저해상도(5x) 이미지는 100x 이미징 필드에 대해 3개의 영역이 선택된 대퇴골의 전체 단면적을 보여줍니다.
5. 골세포의 컴퓨터 모델링을 위해 100x Z-스택을 사용합니다.

3. 컴퓨터 모델링

1. 수집된 100x 이미지를 TIFF 형식으로 ImageJ 소프트웨어로 가져와 Z 방향의 LCN 이미지 시퀀스를 구축합니다.
2. Z-스택을 3D 이미지 기반 처리 소프트웨어로 가져와 이미지 방향을 정의한 후 LCN의 마스크를 구성합니다.
3. 각각 30,012-45,677 Hounsfield 단위와 15,000-46,701 Hounsfield 단위 사이의 어린 마우스와 늙은 마우스의 원본 이미지를 LCN과 매우 유사하게 임계 값을 설정합니다. 섹션 메뉴에서 Threshold 를 조정하여 마스크에 포함할 픽셀 강도 제한을 변경합니다.
4. Crop Mask 작업을 사용하여 스택에서 관심 영역(ROI)으로 운관을 사용하여 하나의 틈새를 자릅니다. ROI가 큐브 중앙의 틈새를 둘러싸고 연결된 모든 이관이 큐브의 측면으로 확장되도록 ROI를 정의합니다. 한 변의 길이가 21 μm, 14 μm, 19 μm인 가상의 더 큰 입방체에 틈새를 넣습니다.
5. 모델은 여러 부분으로 생성되므로 영역 성장 작업을 수행하여 연결된 픽셀 영역을 선택하고 노이즈와 얼룩을 제거하여 균일한 LCN을 생성합니다.
6. 3D 이미지 기반 처리 소프트웨어에서 Calculated Part 작업을 사용하여 lacunar-canalicular mask를 객체로 변환합니다.
7. Smoothing 작업을 사용하여 LCN 부피를 줄여 골세포와 수지상 막을 구축합니다. 이 작업을 여러 번 수행하여 각각 0.75μm 및 0.08μm의 틈새 및 이관 공간 두께를 얻을 수 있습니다 ^9,18.
8. 3D 이미지 기반 처리 소프트웨어의 마지막 단계로 개체(STL 형식)를 내보냅니다.
9. LCN 및 골세포-수지상 막의 두 층을 3D 데이터 최적화 소프트웨어로 가져와 볼륨 메시를 생성합니다.
10. 소프트웨어에서 Fix Wizard 도구를 사용하여 각 파트의 메시 문제를 식별합니다. 각 작업 후 Fix Wizard 의 진단 섹션에서 메쉬 품질을 확인하십시오.
11. 반전된 수직 파트, 교차하는 삼각형 및 잘못된 윤곽을 Fix Wizard의 Auto-Fix 작업을 사용하여 제거합니다.
12. 겹치는 삼각형은 새 삼각형을 정의하여 수동으로 교체하거나 Fill Hole Normal 작업을 통해 자동으로 교체합니다.
13. 날카로운 삼각형, 작은 가장자리 및 작은 쉘 필터링을 포함한 작업을 사용하여 메쉬 품질을 향상시킵니다.
14. 메쉬 품질을 개선한 후 LCN과 골세포-수지상막의 두 표면을 비매니폴드 어셈블리를 사용하여 두 부분에 속하는 하나의 표면(틈새-이관 유체 공간)으로 결합합니다.
15. Remesh 작업을 사용하여 lacunar-canalicular 공간의 체적 모델을 만든 다음 STL 파일로 내보냅니다. 개체 크기를 export 섹션에서 마이크로미터 단위로 조정합니다.

4. 3D 이미지 기반 처리 소프트웨어 및 3D 데이터 최적화 소프트웨어의 기하학적 수정 기술

참고: 기하학적 변형 기법은 노화 또는 뼈 질환으로 인한 이관 밀도 및 직경, 틈새-이관 두께와 같은 골세포 형태의 변화를 모델링하는 데 사용됩니다.

1. 젊은 골세포를 기본 모델로 선택하고 형태학적 변형을 적용하여 다른 고유한 골세포 모델을 구축하도록 수정합니다.
2. 3D 이미지 기반 처리 소프트웨어에서 이미지 임계값을 변경하여 기본 모델과 다른 이관 밀도를 가진 골세포 모델을 생성합니다.
   1. 더 낮은 임계값을 선택하여 이미지의 광도를 줄이고 canaliculi가 더 적은 틈새를 얻습니다. 임계값 지정 기술의 장점은 틈새 모양과 크기가 동일하게 유지되고 이관 밀도의 영향만 연구된다는 것입니다. 그림 2 는 기하학적 변형 기법을 사용하여 젊은 골세포에서 생성된 시뮬레이션된 노화 모델을 보여줍니다.
3. 3D 이미지 기반 처리 소프트웨어 및 3D 데이터 최적화 소프트웨어에서 다양한 lacunar-canalicular 공간 두께 또는 수상돌기/이관 직경을 가진 골세포 모델을 개발합니다. 각각 Wrapping 또는 Smoothing 작업을 통해 더 크거나 더 작은 골세포 모델을 구축합니다. 그림 3 은 젊은 골세포에서 발달된 기하학적 변화를 가진 6개의 골세포 모델을 보여줍니다.

5. CFD 분석

참고: 체적 골세포 모델을 생성한 후 형상, 메쉬 및 설정을 포함한 여러 단계가 시뮬레이션 소프트웨어의 CFX 모듈에서 수행됩니다.

1. 시뮬레이션 소프트웨어에서 유체 흐름을 작성하여 CFD 해석을 위한 모델을 준비합니다.
2. 개발된 컨포칼 이미지 기반 형상을 ANSYS SpaceClaim(3D 모델링 도구)으로 알려진 CFX의 형상 섹션으로 가져올 수 있습니다. 설정에서 단위 치수를 나노미터로 설정합니다.
3. 기하학은 LCN과 골세포-수지상 과정의 두 가지 측면으로 나타납니다. 상단 메뉴에서 Facet 을 클릭하고 교차점, 날카롭거나 과도하게 연결된 가장자리, 각 패싯에 대한 정점, 개구부 또는 구멍과 같은 기하학적 오류를 제거합니다.
4. Facet 메뉴에서 Subtract를 클릭하여 더 큰 패싯인 LCN에서 더 작은 패싯 및 골세포-수지상 돌기를 줄여 lacunar-canalicular space의 단일 바디를 얻습니다. 그런 다음 생성된 패싯을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 면을 병합하지 않고 깎인면에서 솔리드 도메인으로 변환합니다. 그림 4는 lacunar-canalicular space를 나타내는 young osteocyte model의 단면적을 보여줍니다.
5. 메쉬를 클릭하고 0.06μm의 요소 크기를 사용하여 선형 사면체 요소를 선택합니다. 메쉬 수렴 스터디를 통해 메쉬를 미세 조정하여 작은 수지상 시스템에 충분한 요소를 포함하여 결과가 메쉬 크기와 무관하도록 합니다.
6. 표면을 선택하고 가상 입방체의 위쪽에 있는 이관을 유체 유입구로 선택합니다. 상자 선택을 사용하여 다른 5개 면의 이관을 유체 배출구로 선택합니다.
7. 메시(fluent 파일 형식)를 다음 단계의 설정에서 더 빠르게 로드되므로 내보냅니다.
8. 시뮬레이션 소프트웨어에서 다른 유체 흐름을 만들고 fluent mesh를 CFX의 설정 섹션으로 가져옵니다. 입구/출구로 미리 선택된 면에 대한 입구와 출구의 두 경계 조건을 Enter Boundary 옵션을 사용하여 정의합니다.
9. 생리적 조건을 모방하려면 입구와 출구에 각각 300 Pa 및 0 Pa의 유체 입구 압력을 가하십시오^19,20. 나머지 표면을 벽의 경계면에서 속도가 0인 유체에서 미끄럼 방지 조건이 있는 벽으로 취급합니다. 유체는 수상돌기와 골세포 세포체 주위의 입구에서 흘러나와 배출구로 할당된 다른 이관에서 빠져 나옵니다.
10. 간질 층류를 재료 라이브러리에서 선택한 물⁹로 처리합니다. Heat Transfer, Combustion, Thermal Radiation 섹션을 None으로 설정하는데, 문제에 heat transfer가 정의되어 있지 않기 때문입니다. 터뷸런스 모드를 층류^{유체 9}인 LCN의 유체 특성으로 선택합니다.
11. Double Precision 및 Direct Start를 제출 유형으로 사용하여 소프트웨어를 실행합니다. 잔류물이 떨어지고 일정해질 때까지 질량과 운동량을 모니터링합니다. 솔루션 컨버전스 후 CFD 소프트웨어의 CFD-post 섹션을 사용하여 FFSS 데이터를 측정합니다.

6. CFD 후처리

1. 골세포와 그 수상돌기가 경험하는 FFSS를 묘사하려면 CFD 소프트웨어의 결과 섹션에 새 윤곽을 삽입하십시오. 골세포-수지상 막의 벽 전단을 영역의 변수로 선택하여 FFSS 윤곽을 생성합니다.
   참고: 수지상 멤브레인에서 높은 FFSS를 더 잘 보여주기 위해 FFSS의 범위를 사용자 지정 으로 설정하여 FFSS의 최소/최대 값을 수정합니다.
2. 유입구에서 시작하여 lacunar-canalicular domain 내부에 속도 유선, 윤곽을 삽입합니다. 샘플링을 균일한 간격으로 설정하고 점 수를 2500으로 선택합니다. CFD 소프트웨어의 애니메이션 섹션은 속도 유선(velocity stream) 그래프를 사용하여 틈새-이관 공간 내부에서 유체 입자가 어떻게 흐르는지 3D로 정확하게 표시합니다.
3. CFD 소프트웨어의 함수 계산기 도구를 사용하여 특히 다양한 골세포 모델(즉, 젊은 골세포 모델과 노화된 모델)을 기반으로 FFSS의 크기 또는 속도를 분석할 수 있습니다. lacunar-canalicular space의 부피와 표면적을 최대, 최소 또는 평균 FFSS 값과 함께 기하학적 매개변수로 측정합니다.

결과

이 프로토콜은 공막 유래 골세포 모델을 개발하여 골세포 및 그 수지상 과정이 기계적 부하로 인해 받는 유체 흐름, 전단 응력의 양을 조사하는 방법을 설명합니다. 젊고 늙은 C57BL6 마우스를 선택하여 젊고 늙은 공초점 이미지 기반 골세포 모델을 구축했습니다. 노화 또는 뼈 질환으로 인한 LCN 형태의 변화를 연구하기 위해 기하학적 수정 기술을 사용하여 동일한 젊은 골?...

토론

이 프로토콜은 골세포의 시각화 및 컴퓨터 모델링을 위한 컨포칼 이미징 기술을 간략하게 설명합니다. 컨포칼 이미징 전에 뼈 샘플을 절편하고 염색하기 위한 뼈 준비 과정을 수행합니다. 100배 배율의 컨포칼 이미지를 다양한 소프트웨어로 가져와 골세포와 골협구(lacunar-canalicular space)의 컴퓨터 모델을 개발합니다. CFD 분석은 마지막으로 컨포칼 이미지 기반 모델에서 수?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,200 Grit sandpaper	Buehler	30-5170-012-100
3-Matic software	Materialise	https://www.materialise.com/en/industrial/software/3-matic	3D data optimization software
600 grit sandpaper	Buehler	30-5118-600-100
800 Grit sandpaper	Buehler	30-5170-800-100
ANSYS software	ANSYS	https://www.ansys.com/	simulation software
Fluorescein Isothiocyanate (FITC)	Sigma-Aldrich	F7250
ImageJ software		https://imagej.net/ij/
Immersion Oil for Microscopes	Leica Microsystems	195371-10-9
Leica TCS Sp5 II confocal microscope	Leica Microsystems	TCS Sp5 II
Leitz 1600 inner hole diamond saw	Leica
MIMICS Innovation Suite software	Materialise	https://www.materialise.com/en/healthcare/mimics-innovation-suite	3D image-based processing software
Permount mount medium	Fisher scientific	SP15-500
Sampl-Kwick Fast Cure Acrylic Kit	Buehler	20-3560
Single Platform Laboratory Shaker	Reliable scientific INC	Model 55S