Analyse et imagerie des ostéocytes

Résumé

Cette étude décrit la méthode de visualisation et de développement de modèles tridimensionnels (3D) d’ostéocytes au sein du réseau lacunaire-canaliculaire (LCN) pour l’analyse de la dynamique des fluides numérique (CFD). Les modèles générés à l’aide de cette méthode aident à comprendre la mécanosensation des ostéocytes dans les os sains ou malades.

Résumé

Les ostéocytes sont les cellules osseuses dont on pense qu’elles réagissent aux contraintes mécaniques et au stress de cisaillement de l’écoulement des fluides (FFSS) en activant diverses voies biologiques dans un processus connu sous le nom de mécanotransduction. Les modèles confocaux de réseaux d’ostéocytes dérivés d’images sont un outil précieux pour effectuer une analyse CFD (Computational Fluid Dynamics) afin d’évaluer les contraintes de cisaillement sur la membrane ostéocytaire, qui ne peuvent pas être déterminées par mesure directe. La modélisation informatique utilisant ces images à haute résolution de l’architecture microstructurale de l’os a été utilisée pour simuler numériquement la charge mécanique exercée sur l’os et comprendre la stimulation des ostéocytes induite par la charge.

Cette étude développe les méthodes de développement de modèles 3D d’ostéocytes uniques à l’aide d’images au microscope confocal du réseau Lacunaire-Canaliculaire (LCN) pour effectuer une analyse CFD à l’aide de divers logiciels de modélisation informatique. Avant la microscopie confocale, les os de la souris sont sectionnés et colorés avec un colorant isothiocyanate de fluorescéine (FITC) pour marquer le LCN. À une résolution de 100x, les images de la pile Z sont collectées à l’aide d’un microscope confocal et importées dans le logiciel MIMICS (logiciel de traitement d’images 3D) pour construire un modèle de surface du LCN et des processus ostéocytaires-dendritiques.

Ces surfaces sont ensuite soustraites à l’aide d’une opération booléenne dans le logiciel 3-Matic (logiciel d’optimisation de données 3D) pour modéliser l’espace fluidique lacunaire autour du corps cellulaire ostéocytaire et l’espace canaliculaire autour des dendrites contenant du liquide lacunocanaliculaire. La géométrie volumétrique des fluides 3D est importée dans le logiciel ANSYS (logiciel de simulation) pour l’analyse CFD. ANSYS CFX (logiciel CFD) est utilisé pour appliquer une charge physiologique sur l’os sous forme de pression de fluide, et les contraintes de cisaillement de la paroi sur les ostéocytes et les processus dendritiques sont déterminées. La morphologie du LCN affecte les valeurs de contrainte de cisaillement détectées par la membrane cellulaire ostéocytaire et les processus cellulaires. Par conséquent, les détails de la façon dont les modèles confocaux basés sur l’image sont développés peuvent être précieux pour comprendre la mécanosensation des ostéocytes et peuvent jeter les bases d’études futures dans ce domaine.

Introduction

On postule que les ostéocytes régulent la masse osseuse en réponse à l’exercice physique¹. La déformation membranaire des ostéocytes et de leurs processus dendritiques due à une charge mécanique les soumet à la FFSS, qui est détectée par les ostéocytes et déclenche la signalisation intracellulaire ^2,3,4. La microstructure osseuse subit une détérioration ou des altérations de sa morphologie lacune-canaliculaire dues au vieillissement ou à des maladies osseuses telles que l’ostéoporose et le diabète et dans des conditions telles que la carence en perlecan qui entraîne une altération de la mécano-réactivité des ostéocytes ^5,6. Ces changements dans l’architecture osseuse font que les ostéocytes subissent différents niveaux de FFSS et de souches ^7,8. Il est important de noter que les FFSS subis par les ostéocytes en réponse à une charge mécanique sont difficiles à quantifier in vivo car ils sont intégrés dans la matrice osseuse calcifiée.

La modélisation confocale basée sur l’image est une technique puissante pour surmonter les limites de l’étude des ostéocytes inaccessibles dans leur environnement naturel en répliquant des modèles informatiques du LCN ^9,10. Le traitement et la modélisation du réseau interconnecté de LCN en 3D ont été un défi. Il existe plusieurs techniques d’imagerie, telles que la microscopie électronique à transmission (MET), la microscopie électronique à balayage (MEB), la section de visage en bloc en série et la microscopie électronique à balayage à faisceau d’ions focalisée en série (FIB/SEM)^2,11,12. Une technique précieuse a été mise au point pour visualiser l’os 13,14,15 et générer des modèles d’ostéocytes 3D via la microscopie confocale à balayage laser (CLSM). CLSM a été choisi ici pour la modélisation informatique plutôt que pour d’autres techniques d’imagerie en raison de sa capacité à imager tout le volume lacunaire et la plupart des canalicules en 3D^16,17. La géométrie LCN peut être générée à l’aide de CLSM pour l’analyse par éléments finis (FEA) des ostéocytes afin de prédire les déformations osseuses. Cependant, l’analyse des fluides pour prédire les FFSS subies par les ostéocytes est plus compliquée car elle nécessite la modélisation de la membrane cellulaire de l’ostéocyte et de ses dendrites au sein du LCN pour permettre la modélisation de l’espace lacunaire-canaliculaire étroit, dans lequel le liquide interstitiel se déplace autour de¹⁸.

Dans ce protocole, un colorant isothiocyanate de fluorescéine (FITC) est appliqué sur des coupes osseuses épaisses non décalcifiées avant la microscopie confocale pour marquer le LCN à l’intérieur de l’os, et les membranes ostéocytaires-dendritiques sont modélisées sur la base des données d’imagerie du LCN. L’espace lacunaire-canaliculaire est simulé à l’aide d’une modélisation informatique, et la charge physiologique due à l’activité physique est modélisée à l’aide d’une approche CFD. Les ostéocytes sont soumis à un gradient de pression de fluide dans le logiciel CFD pour analyser le profil fluide à l’intérieur du LCN et mesurer la FFSS sur les membranes ostéocytaires et dendritiques. De plus, une approche FEA permet de mesurer les déformations ou les contraintes ostéocytaires en appliquant une charge mécanique compressive.

Une technique de modification de la géométrie a également été développée pour modifier les microstructures dérivées d’images d’os jeunes et sains afin de simuler la morphologie lacunaire-canaliculaire modifiée chez les animaux âgés ou atteints de maladies osseuses. Les modifications de la microstructure osseuse comprenaient la réduction du nombre de canalicules avec l’âge, la réduction de la zone de l’espace lacinaire-canaliculaire pour modéliser ce qui se passe en cas de carence en perlecan et son augmentation pour modéliser les effets du vieillissement, et la réduction de la surface de la paroi canaliculaire et dendritique pour modéliser l’os diabétique ^5,6. La technique de modification de la géométrie nous permet de comparer les FFSS subis par les ostéocytes dans des os avec différentes microstructures, telles que jeunes par rapport aux personnes âgées ou os chez des animaux sains par rapport aux animaux malades.

Dans l’ensemble, la modélisation confocale basée sur l’image est un outil précieux pour simuler la morphologie des ostéocytes dans les os sains ainsi que les changements de morphologie des ostéocytes associés au vieillissement ou à la maladie. De plus, les paramètres morphologiques des ostéocytes, tels que la surface et le volume de l’espace lacunaire-canaliculaire, peuvent être mesurés et comparés dans divers os pour prédire les réponses cellulaires aux contraintes mécaniques.

Protocole

Les expériences sur les animaux ont été menées avec l’approbation du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université du Missouri, Kansas City (UMKC), et se sont conformées aux directives fédérales pertinentes.

1. Processus de préparation osseuse

1. Prélever des fémurs de souris C57BL6 femelles de 4 mois et de 22 mois et les fixer dans du paraformaldéhyde froid à 4 % dans du PBS pendant 24 h à 4 °C en les balançant doucement, puis les rincer dans du PBS et les stocker dans de l’éthanol à 70 % avant de les enrober.
   REMARQUE : Le volume fixateur doit être d’environ 20 fois le volume tissulaire
2. Incorporez rapidement les os dans un acrylique à polymérisation rapide (Table des matériaux) en suivant les instructions du fabricant.
   REMARQUE : Il est important d’utiliser une résine à polymérisation rapide pour cette étape (~10 min). Le but est de soutenir le tissu osseux pendant la coupe à l’aide de la scie à diamant, mais sans que la résine ne pénètre dans le LCN, ce qui empêcherait la coloration FITC de pénétrer à l’intérieur.
3. Coupez des tranches transversales épaisses de 300 μm d’épaisseur à partir d’un site normalisé au-dessus du troisième trochanter à l’aide d’une scie diamantée et stockez-les à 4 °C dans de l’éthanol à 70 % avant la coloration FITC.
4. Polissez les sections à l’aide de papier de verre de grain 600, 800 puis 1200 jusqu’à une épaisseur finale de ~90-100 μm.
   REMARQUE : L’obtention de l’épaisseur appropriée a été assurée à l’aide d’un pied à coulisse numérique.
5. Rincez les sections à 70 %, 95 % et 100 % éthanol pendant 5 minutes chacune.
6. Colorez-les dans du FITC à 1 % dans de l’éthanol à 100 % pendant 4 h à température ambiante (RT) dans l’obscurité en secouant modérément.
7. Lavez les sections dans de l’éthanol à 100 % pendant 30 minutes en secouant doucement dans l’obscurité. Ensuite, faites-les sécher à l’air libre pendant la nuit dans l’obscurité.
8. Pour le montage, placez la section dans une goutte de support de montage sur une lame de microscope en verre. À l’aide d’une pince, positionnez la section aussi à plat que possible contre la lame, en évitant de générer des bulles d’air et en utilisant la résine environnante pour manipuler l’échantillon. Montez une lamelle sur l’échantillon.

2. Microscopie confocale

1. Utilisez un microscope confocal pour l’imagerie de tranches d’os colorées au FITC.
2. Utilisez un objectif à huile 100x 1,44NA avec un zoom numérique de 1,7 et une taille de pas de 0,126 μm pour collecter des piles Z détaillées de 400 plans Z à 1024 x 1024 pixels, résolution de 0,089 μm de pixels.
3. Utilisez un laser de 488 nm pour l’excitation, avec une fenêtre de collecte d’émission de 496-596 nm. Collectez les piles d’images à l’aide des paramètres de compensation pour corriger la perte de signal avec l’augmentation de la profondeur d’image.
4. Augmentez la précision et la résolution des images en utilisant des techniques de collecte d’images telles que le suréchantillonnage et l’augmentation de la moyenne des lignes. Collectez également les images avec une résolution de 5x, 20x et 100x des sections transversales des sections du fémur, comme le montre la figure 1.
   REMARQUE : L’image basse résolution (5x) de la figure 1 montre la section transversale complète du fémur, avec trois régions sélectionnées pour les champs d’imagerie 100x.
5. Utilisez les piles Z 100x pour la modélisation informatique des ostéocytes.

3. Modélisation informatique

1. Importez les images 100x collectées, au format TIFF, dans le logiciel ImageJ pour construire une séquence d’images du LCN dans la direction Z.
2. Importez les piles Z dans le logiciel de traitement d’images 3D pour construire un masque du LCN après avoir défini l’orientation de l’image.
3. Seuilz l’image originale des souris jeunes et âgées entre 30 012 et 45 677 unités Hounsfield et 15 000 à 46 701 unités Hounsfield, respectivement, pour ressembler étroitement au LCN. Ajustez le seuil dans le menu de section pour modifier les limites d’intensité des pixels à inclure dans un masque.
4. Recadrez une lacune avec ses canalicules en tant que région d’intérêt (ROI) de la pile à l’aide de l’opération Masque de recadrage . Définissez le retour sur investissement de manière à ce qu’il entoure la lacune au centre du cube et que tous ses canalicules connectés s’étendent sur les côtés du cube. Enfermez la lacune dans un cube imaginaire plus grand avec des longueurs de côté de 21 μm, 14 μm et 19 μm.
5. Étant donné que le modèle est créé à partir de plusieurs parties, effectuez une opération de croissance de région pour sélectionner les régions de pixels connectées, supprimer le bruit et éliminer les taches pour générer un LCN uniforme.
6. Convertissez le masque lacunaire-canaliculaire en objet à l’aide de l’opération Pièce calculée dans le logiciel de traitement d’images 3D.
7. Construire les membranes ostéocytaires et dendritiques en réduisant le volume LCN à l’aide de l’opération de lissage. Effectuez cette opération plusieurs fois pour obtenir une épaisseur d’espace lacunaire et canaliculaire de 0,75 μm et 0,08 μm, respectivement ^9,18.
8. Exporter les objets (format STL) en tant que dernière étape dans le logiciel de traitement d’images 3D.
9. Importez deux couches de LCN et de membranes ostéocytaires-dendritiques dans le logiciel d’optimisation des données 3D pour générer un maillage volumique.
10. Utilisez l’outil Fix Wizard du logiciel pour identifier les problèmes de maillage dans chaque pièce. Vérifiez la qualité du maillage dans la section de diagnostic de l’assistant de correction après chaque opération.
11. Supprimez les pièces normales inversées, les triangles qui se croisent et les contours défectueux à l’aide de l’opération de correction automatique de l’assistant de correction.
12. Remplacez les triangles superposés manuellement en en définissant de nouveaux ou automatiquement via l’opération Remplir le trou Normal .
13. Améliorez la qualité du maillage à l’aide d’opérations telles que le filtrage des triangles pointus, des petites arêtes et des petites coques.
14. Après avoir amélioré la qualité du maillage, combinez deux surfaces de la LCN et des membranes ostéocytaires-dendritiques en une seule surface (espace fluidique lacunaire-canaliculaire) qui appartient aux deux parties à l’aide d’un assemblage non manifold.
15. Créez un modèle volumétrique de l’espace lacunaire-canaliculaire à l’aide de l’opération Remesh , puis exportez-le sous forme de fichier STL. Ajustez l’échelle de l’objet pour qu’elle soit en micromètres dans la section d’exportation.

4. Technique de modification de la géométrie dans le logiciel de traitement d’images 3D et le logiciel d’optimisation de données 3D

REMARQUE : La technique de modification de la géométrie est utilisée pour modéliser les changements dans la morphologie des ostéocytes, tels que la densité et le diamètre canaliculaires et l’épaisseur lacune-canaliculaire due au vieillissement ou à une maladie osseuse.

1. Choisissez le jeune ostéocyte comme modèle de base et modifiez-le pour construire d’autres modèles d’ostéocytes distincts en appliquant des modifications morphologiques.
2. Générez un modèle d’ostéocytes avec des densités canaliculaires différentes de celles du modèle de base en modifiant le seuillage de l’image dans le logiciel de traitement basé sur l’image 3D.
   1. Sélectionnez un seuil plus bas pour réduire l’intensité lumineuse de l’image et obtenir une lacune avec moins de canalicules. L’avantage de la technique de seuillage est que la forme et la taille de l’écart restent les mêmes, et que seule l’influence de la densité canaliculaire est étudiée. La figure 2 montre le modèle vieilli simulé généré à partir du jeune ostéocyte à l’aide de la technique de modification de la géométrie.
3. Développez des modèles d’ostéocytes avec différentes épaisseurs d’espace lacinaire-canaliculaire ou diamètres dendrites/canaliculaires dans le logiciel de traitement d’images 3D et le logiciel d’optimisation de données 3D. Construisez des modèles d’ostéocytes plus grands ou plus petits par des opérations d’enveloppement ou de lissage , respectivement. La figure 3 montre six modèles d’ostéocytes à géométrie modifiée développés à partir de l’ostéocyte jeune.

5. Analyse CFD

REMARQUE : Après avoir généré les modèles d’ostéocytes volumétriques, plusieurs étapes, notamment la géométrie, le maillage et la configuration, sont effectuées dans le module CFX du logiciel de simulation.

1. Créez un écoulement de fluide dans le logiciel de simulation pour préparer les modèles pour l’analyse CFD.
2. Importez les géométries confocales développées basées sur l’image dans la section géométrique de CFX, connue sous le nom d’ANSYS SpaceClaim (outil de modélisation 3D). Réglez les dimensions de l’unité sur les nanomètres dans le réglage.
3. La géométrie apparaît comme deux facettes du LCN et des processus ostéocytaires-dendritiques. Cliquez sur Facette dans le menu supérieur et supprimez les erreurs géométriques telles que les intersections, les arêtes vives ou surconnectées, et les sommets, les ouvertures ou les trous pour chaque facette.
4. Cliquez sur Soustraire dans le menu Facette pour réduire les plus petites facettes et les processus ostéocytaires-dendritiques de la plus grande facette, le LCN, afin d’obtenir un seul corps d’espace lacunaire-canaliculaire. Ensuite, faites un clic droit sur la facette générée et convertissez-la de facettes en un domaine solide sans fusionner les faces. La figure 4 représente la section transversale du modèle d’ostéocytes jeunes, qui représente l’espace lacunaire-canaliculaire.
5. Cliquez sur le maillage et sélectionnez des éléments tétraédriques linéaires à l’aide d’une taille d’élément de 0,06 μm. Affinez le maillage à l’aide d’une étude de convergence du maillage pour avoir suffisamment d’éléments dans le minuscule système dendritique pour garantir que les résultats sont indépendants de la taille du maillage.
6. Sélectionnez la surface et choisissez les canalicules sur la face supérieure du cube imaginaire comme entrées de fluide. Sélectionnez les canalicules sur les cinq autres faces comme sorties de fluide à l’aide de la sélection de boîte .
7. Exportez le maillage (format de fichier fluide) car il se charge plus rapidement dans la configuration à l’étape suivante.
8. Créez un autre Fluid Flow dans le logiciel de simulation et importez le maillage fluide dans la section de configuration de CFX. Définissez deux conditions limites d’entrées et de sorties pour les faces présélectionnées en tant qu’entrées/sorties à l’aide de l’option Insérer une frontière .
9. Pour imiter les conditions physiologiques, exercer une pression d’entrée de fluide de 300 Pa et 0 Pa sur les entrées et sorties, respectivement^19,20. Traitez les surfaces restantes comme des murs avec une condition antidérapante dans ce fluide qui a une vitesse nulle à l’interface des parois. Le liquide s’écoule des entrées autour des dendrites et du corps cellulaire ostéocytaire et sort des autres canalicules désignés comme sorties.
10. Traiter le liquide laminaire interstitiel comme de l’eau⁹, choisie dans la matériauthèque. Définissez les sections Transfert de chaleur, Combustion et Rayonnement thermique sur Aucun, car aucun transfert de chaleur n’est défini dans le problème. Sélectionnez le mode Turbulence comme caractéristique de fluide dans le LCN, qui est un fluide laminaire⁹.
11. Exécutez le logiciel en utilisant la double précision et le démarrage direct comme type de soumission. Surveillez la masse et la quantité de mouvement jusqu’à ce que les résidus diminuent et deviennent constants. Après la convergence de la solution, mesurez les données FFSS à l’aide de la section CFD-post du logiciel CFD.

6. Post-traitement CFD

1. Pour décrire les FFSS subies par les ostéocytes et leurs dendrites, insérez un nouveau contour dans la section des résultats du logiciel CFD. Créez un contour FFSS en choisissant le cisaillement de la paroi sur les membranes ostéocytaires-dendritiques comme variable au niveau du domaine.
   REMARQUE : Pour mieux afficher un FFSS élevé sur les membranes dendritiques, la plage de FFSS est définie sur Spécifié par l’utilisateur pour modifier les valeurs min/max de FFSS.
2. Insérez un contour de lignes de vitesse à l’intérieur du domaine lacunaire-canaliculaire à partir des entrées. Définissez l’échantillonnage sur un espacement égal et sélectionnez le nombre de points sur 2500. Une section d’animation dans le logiciel CFD montre avec précision en 3D comment les particules de fluide s’écoulent à l’intérieur des espaces lacunaires-canaliculaires à l’aide du graphique de rationalisation de la vitesse.
3. Utilisez l’outil Calculateur de fonction dans le logiciel CFD pour analyser l’amplitude de la FFSS ou la vitesse en fonction de paramètres géométriques, en particulier lorsqu’il existe différents modèles d’ostéocytes (c’est-à-dire jeune ou âgé). Mesurez le volume et la surface de l’espace lacunaire-canaliculaire sous forme de paramètres géométriques ainsi que les valeurs FFSS maximales, minimales ou moyennes.

Résultats

Ce protocole décrit comment développer des modèles d’ostéocytes confocaux pour étudier la quantité de contrainte de cisaillement de l’écoulement des fluides à laquelle un ostéocyte et ses processus dendritiques sont soumis en raison d’une charge mécanique. Une souris C57BL6 âgée et une jeune souris ont été sélectionnées pour construire des modèles d’ostéocytes confocaux jeunes et âgés. Six autres modèles d’ostéocytes simulés ont été générés à partir...

Discussion

Ce protocole décrit une technique d’imagerie confocale pour la visualisation et la modélisation informatique des ostéocytes. Avant l’imagerie confocale, le processus de préparation osseuse pour la section et la coloration des échantillons d’os est effectué. Des images confocales d’un grossissement de 100x sont importées dans divers logiciels pour développer des modèles informatiques des ostéocytes et de l’espace lacunaire-canaliculaire. Une analyse CFD est enfin mené...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,200 Grit sandpaper	Buehler	30-5170-012-100
3-Matic software	Materialise	https://www.materialise.com/en/industrial/software/3-matic	3D data optimization software
600 grit sandpaper	Buehler	30-5118-600-100
800 Grit sandpaper	Buehler	30-5170-800-100
ANSYS software	ANSYS	https://www.ansys.com/	simulation software
Fluorescein Isothiocyanate (FITC)	Sigma-Aldrich	F7250
ImageJ software		https://imagej.net/ij/
Immersion Oil for Microscopes	Leica Microsystems	195371-10-9
Leica TCS Sp5 II confocal microscope	Leica Microsystems	TCS Sp5 II
Leitz 1600 inner hole diamond saw	Leica
MIMICS Innovation Suite software	Materialise	https://www.materialise.com/en/healthcare/mimics-innovation-suite	3D image-based processing software
Permount mount medium	Fisher scientific	SP15-500
Sampl-Kwick Fast Cure Acrylic Kit	Buehler	20-3560
Single Platform Laboratory Shaker	Reliable scientific INC	Model 55S