胎児の子羊における 子宮内 連続テレメトリー気管圧測定

要約

先天性横隔膜ヘルニア (CDH) の 子宮内 矯正治療を改善するためには、気管閉塞を伴う肺形成不全を改善するために必要な閉塞圧と閉塞時間の最適化が不可欠です。この研究では、CDHの閉塞および閉塞していない子羊胎児の手術モデルにおける気管圧の連続測定のための新しい方法を報告しています。

要約

子宮内での正常な肺の発達と成長は、空域の拡大と羊水腔への肺液の制御された排出に依存しています。先天性横隔膜ヘルニア(CDH)の乳児は、胃と腸、そして最も重篤な場合には肝臓による胸腔の占有による肺形成不全も持っています。バルーン気管閉塞は、CDHの胎児における肺形成不全の重症度を低下させますが、早産のリスクを高めます。気管閉塞を伴う肺形成不全を改善するために必要な最適な閉塞圧と持続時間を理解することは、CDHの子宮内矯正治療を改善するために不可欠です。この研究では、CDHの閉塞していない子羊の胎児手術モデルにおける気管内圧と羊水圧を連続的に測定する新しい方法が報告されています。妊娠期間のあるメリノ雌羊は、2回の回復子宮切開術を受けました:1回目は妊娠~80日でCDHを作成し、2回目は妊娠~101日で胎児の気管を閉塞し、気管内および羊水圧測定装置を埋め込みます。子羊は~142日で分娩され、圧力測定装置を取り外して洗浄しました。データはダウンロードされ、6時間のウィンドウを使用してフィルタリングされました。気道圧を計算しました。

概要

正常な肺の発達と成長は、胎児の肺液による潜在的な空域の拡大と、羊水^腔1,2,3,4,5への肺液の制御された排出に依存しています。胎児の肺液の生成と上気道の抵抗は、子宮内^胸腔内圧1を作り出します。歴史的に、胎内胎児の気道圧の測定値は、腹壁を通って胎児の気管にトンネルされたカテーテルを介して外部圧力センサーを使用して取得されていました^{5,6,7,8,9,10,11,12,13}.これらのカテーテルと外部センサー(測定部位の遠位)を使用すると、圧力信号が減衰し、連続測定または妊娠期間全体での間隔で得られる測定のために雌羊の動きを制限する必要がある場合があります。本研究は、拘束されていない妊娠動物の胎児の気管内圧および羊水圧を連続的にモニタリングできる方法を開発することを目的とした。胎児の気管内圧と羊水圧の連続測定により、妊娠期間中にこれらの圧力が一日中どのように変化するかを完全に理解できます。

先天性横隔膜ヘルニア(CDH)のヒト胎児は、胃、腸、および肝臓(最も重症の場合)が胸腔にヘルニアされるため、肺形成不全を呈します。気管閉鎖症(気管の狭窄)の乳児における肺過形成は、CDH¹⁴の出生前治療のための治療的気管閉塞の可能性を強調しました。気管内バルーンを使用した気管閉塞は、CDHの胎児の肺形成不全の重症度を軽減しますが、早産のリスクが増加します15,16,17。バルーンが出生前に除去されない場合、誤嚥または窒息の追加のリスクが存在します。その結果、現在の気管閉塞プロトコルでは、出生前にバルーン閉塞を取り除くための2回目の胎児処置が必要です¹⁷。気管閉塞を伴う肺形成不全を改善するために必要な最適な閉塞圧と持続時間は不明ですが、この知識は CDHの子宮内矯正治療の最適化に不可欠です。

外科的に作成された横隔膜ヘルニアの腹腔ヘルニアと気管閉塞のない子羊の胎児を使用して、この方法をテストしました。

プロトコル

この議定書は、科学的な目的での動物の世話と使用に関するオーストラリア国立保健医療研究評議会のオーストラリアのコードに準拠していました¹⁸。西オーストラリア大学の動物倫理委員会は、この議定書(RA3/100/1596)を前向きに承認しました。羊は西オーストラリア大学(UWA)のリッジフィールド農場(2018-2020)から供給されました。羊は、外科的介入の2〜3週間前にAAALAC認定のUWA大型動物施設に紹介されました。羊は当初、共有の高床式の囲いで屋内で飼育されていましたが、周術期には単一の囲いが使用されました。羊には、ペレット、オーテンチャフ、ルピナスを与え、体重に基づいて計算されたミネラルミックスを与えました。部屋の温度(20.5-21.5°C)が制御され、12:12時間の明暗サイクルで維持されました。痛みと健康状態は、術後の期間に 1 日 2 回、7 日間評価され、その後、研究が完了するまで毎日評価されました。モニタリングされた術後パラメーターには、痛みの兆候、眼窩の引き締め、呼吸努力、体温、心拍数、手術部位、食欲と水分摂取、活動、跛行、コートの状態、糞便の一貫性、早産、態度、および妊娠中毒症の兆候が含まれていました。各パラメータに起因するスコアは、必要に応じて介入をトリガーしました。

注:2つの回復外科的処置が必要でした:雌羊の準備、外科的アプローチと閉鎖、および雌羊の回復は両方の外科的処置で同じです。最初の手順は、子羊の胎児の横隔膜ヘルニアの外科的作成です。2番目の手順は、胎児の介入および圧力監視装置の配置のためのものです。この研究デザインでは、横隔膜ヘルニアの作成後に腹部の内容物が胸腔に移動するようにするために 2 回の生存手術が必要であり、その後の介入手術の前に肺形成不全が発生する可能性があります。

1. 子羊胎児の横隔膜ヘルニアの外科的造作

1. 雌羊の準備
   1. 妊娠~80日で、アセプロマジン(0.04 mg / Kg)とモルヒネ(0.3 mg / Kg)の筋肉内注射で雌羊を前投薬します。.
   2. ケタミン(5 mg / Kg)とミダゾラム(0.25 mg / Kg)で静脈内麻酔を誘発します。.
   3. 気管内チューブ(内径8 mm[ID])で雌羊気管を挿管します。.陽圧換気(10-12呼吸/分、潮汐量8-10mL / kg)によって供給されるイソフルラン(酸素中1%-3%)で麻酔を維持します。
   4. 心電図 (ECG)、耳動脈カテーテルによる侵襲的動脈血圧、期限切れの CO₂、末梢酸素飽和度、および手術中の温度による雌羊モニタリングを確立します。
   5. 雌羊の仰臥位を担架に置きます。雌羊の足にロープを巻き付け、テーブルにそっと固定します。
   6. 雌羊の腹部と脇腹から羊毛を刈り取り、皮膚に近づけてクリップします。
   7. 雌羊の腹部、脇腹、鼠径部から石鹸と水で汚れとラノリンを取り除きます。
   8. 手術中は90分ごとにセファゾリン(20 mg / Kg)を静脈内投与します。.
   9. 雌羊を担架で手術室に移します。
   10. 雌羊を輸送用担架から手術台に移動します。
   11. 雌羊を手術台の背側横臥位に置きます。
   12. すべての手足を柔らかいロープタイで手術台に固定します。
   13. 露出した腹部の無菌製剤:4%クロルヘキシジン外科用スクラブで3回洗浄し、70%アルコールで各洗浄の間に汚染された溶液を除去します。
   14. 腹部、脇腹、鼠径部に10%ヨウ素溶液を軽く噴霧することにより、完全な滅菌調製が可能です。
   15. 雌羊を滅菌穴あき手術用ドレープで覆い、腹部切開部位のみが露出するようにします。手術中に使用されるすべての手術器具、カテーテル、注射器、および溶液が無菌であることを確認してください。
2. 外科的アプローチ
   1. 10 mL シリンジと 22 G 針を使用して、ブピバカイン (5%; 9.5 mL) の局所皮下および筋肉浸潤により、ラインブロック局所麻酔を確立します。
   2. 雌羊の皮膚、皮下組織、および切開出血を最小限に抑えるために必要に応じて焼灼付きのサイズ10の外科用ブレードで作られたlinea albaを通るパラミッドライン腹部切開(8-11 cm)によって子宮を露出させます。
3. 横隔膜ヘルニアの作成
   1. 触診で胎児の頭部/胸部を特定します。
   2. 子宮を滅菌ラップで覆います。
   3. 手術用ハサミを使って、ラップの中に窓(6cm×4cm)を作ります。
   4. 子宮と羊水嚢を通して5〜7cmの子宮切開を行い、子宮血管と胎盤子葉を避けて、焼灼術で切除します。
   5. 胎児の頭と前肢を外装します。
   6. バブコック子宮クランプを使用して子宮切開部の端をシールし、羊水の損失を防ぐために胎児の腹部に滅菌プラスチックをしっかりと包みます。
   7. 胎児を右側に置き、外部の胎児に2番目の滅菌プラスチックラップを固定して、熱と湿気の損失を減らします。左側の9^番目 と10^番目の 肋骨の間の肋間腔を特定し、手術用ハサミでラップに穴を開けて、目的の胎児切開部位にアクセスします。
   8. ブピバカインの局所皮下および筋肉浸潤により、胎児のラインブロック局所麻酔を確立します (5%、滅菌生理食塩水で 0.5 mL に希釈、1 mL 滅菌注射器と 27 G 針) 10^番目の肋^{骨の上部境界}に隣接する 9 番目の肋間腔で、肋骨下血管を避けます。
   9. 60 mLの滅菌シリンジを使用して、露出した胎児の皮膚を温かいハルトマン溶液(5〜10分ごとに5〜10 mL)で浴び、その後のステップ全体で胎児の皮膚を湿らせます。.
   10. 10 肋骨の頭蓋境界に隣接する 9 番目の肋間腔に電気焼灼で 2 〜 4 cm の皮膚切開を行うことにより、左後外側開胸術を作成します。
   11. 蚊止血剤を使用して、皮下組織、肋間筋、胸膜を鈍く解剖し、横隔膜にアクセスします。
   12. 2つの小さな蚊止血器を使用して、目的の長さ1cmのヘルニア部位の両端にある横隔膜を拾い上げ、横隔膜を頭蓋で持ち上げて、下にある胃、肝臓、脾臓から遠ざけます。
   13. 小さな角度のハサミを使用して、2つの止血器の間に1cmの切開を行います。
   14. 横隔膜を保持している止血剤を放します。
   15. 非外傷性のポッツ鉗子を使用して、横隔膜の穴から胃を上向きに引き抜きます。
   16. 吸収性のある5-0ポリジオキサノンモノフィラメント(RB-1テーパーポイントニードル)のシングルタイを使用して、9^番目 と10^番目の 肋骨を慎重に包み込み、胎児の肋骨に対抗し、下にある肺を避けます。
   17. マットレス縫合糸(吸収性5-0ポリジオキサノンモノフィラメント)による閉開胸切開。
4. 外科手術用クロージャー
   1. 胎児を羊水嚢に戻します。
   2. 術後鎮痛のために、術中メロキシカム(0.25 mg / Kg;皮下)を羊に投与します。.
   3. 温めたハルトマン液(~50 mL)と羊膜内ピペラシリン/タゾバクタム(1000 mg / 125 mg)を使用して、失われた羊水を置き換えます。.
   4. 絨毛羊膜と隣接する子宮壁の対向面を貼り付け、吸収性ポリグラクチン910編組2-0縫合糸と逆さマットレス縫合糸を使用して、子宮と羊膜嚢を一緒に閉じます。
   5. 雌羊の白脈、皮下組織、皮膚(それぞれ吸収性ポリジオキサノンモノフィラメント1、吸収性ポリグルカプロン25モノフィラメント3-0、非吸収性ポリプロピレンモノフィラメント2-0)を閉じます。
5. Eweの回復と監視
   1. 術後に腹部の傷口に防水包帯保持テープをスプレーし、包帯で覆うことで術後の創傷感染のリスクを軽減します。
   2. 経皮フェンタニルパッチ(100μg / h)を鼠径部に塗布して、術後鎮痛を追加します。
   3. 雌羊を回復し、自発的に呼吸するときに抜管し、その後、それが目覚めるのを待ちます。
   4. 胎児介入手術のために、出産まで毎日雌羊を監視します。
   5. 14日後に縫合糸を抜く。

2. 胎児インターベンションと圧力監視装置の配置

1. 妊娠101日での胎児介入手術の準備
   1. 早産のリスクを減らすために、妊娠~85日(期間~147日)にメドロキシプロゲステロン(1 mL)を筋肉内注射します。.
   2. 最初の横隔膜作成手術に使用したのと同じ麻酔薬および外科的準備手順を使用します。
      1. ステップ 1.2.1-1.2.2 と同様に、ステップ 2.1.2.2 と 2.1.2.3 の外科的アプローチに従います。
      2. 10 mL シリンジと 22 G 針を使用して、ブピバカイン (5 %; 9.5 mL) の局所皮下および筋肉浸潤により、ラインブロック局所麻酔を確立します。
      3. 横隔膜作成手術に使用した腹部切開部位に隣接するパラミッドライン腹部切開(8〜11cm)で、雌羊の皮膚、皮下組織、およびサイズ10の外科用ブレードで作られたリネアアルバで子宮を露出させます。
   3. さらに、オキシテトラサイクリン(20 mg / Kg)を羊に筋肉内投与して、慢性的に埋め込まれたモニタリングデバイスに対する胎児の抗菌保護を提供します。.
2. デバイスのアクティベーション
   1. 圧力測定装置¹⁹をアクティブにします。
   2. 止血剤付きクランプ圧力測定チューブ。
   3. 0.08%過酢酸と1%過酸化水素の混合物が入った滅菌ボウルにデバイス全体を少なくとも1時間入れ、デバイス全体が覆われていることを確認します。
   4. 滅菌クランプを使用して、胎児の着床の少なくとも10分前に、デバイスを滅菌水が入った滅菌ボウルに移動します。.デバイス全体が滅菌水で覆われていることを確認してください。
3. 外科的アプローチと胎児介入
   1. 子宮切開術により胎児の頭部を外部に形成します 最初の手術に使用されたのと同じ外科的アプローチを使用しますが、隣接する子宮切開があります (ステップ 1.1-2.2)。
   2. 外側に浮かぶ胎児の頭と首を滅菌プラスチックのドレープで包み、温度と体液の損失を最小限に抑えます。
   3. 圧力測定用のカテーテルで気管を計装します(図1)。
      1. 閉塞していない気管の場合は、手順2.3.3.2〜2.3.3.3に従います。
      2. 子羊の口角で吸引コネクタを14cmの深さまで取り外した5フレンチ(1.67 mm ID)吸引カテーテルで子羊の胎児を挿管します。.
      3. カテーテルの外端を1.59 mm(外径、OD)から3.18 mm(OD)コネクタで長さ30 cmの3.18 mm(ID)シリコンチューブに接続します。
      4. 閉塞した気管の場合は、手順2.3.3.5〜2.3.3.6に従います。
      5. 子羊の口角まで14cmの深さまでコネクターを外した状態で、3.0マイクロカフ気管内チューブで子羊の胎児を挿管します。.
      6. カテーテルの外部端を3.18 mm(OD)から3.18 mm(OD)コネクタで長さ30 cm、3.18 mm(ID)シリコンチューブに接続します。
   4. 長さ30 cmの3.18 mm(ID)シリコンチューブのもう一方の端を、圧力測定デバイスの3.18 mm(OD)〜1.59 mm(OD)コネクタで圧力測定デバイスに接続します。
   5. 子羊の口と首の角でカテーテルを縫合します(非吸収性ナイロンモノフィラメント4-0)。
   6. 圧力測定装置を子羊の胸部の皮膚に固定します(非吸収性ナイロンモノフィラメント4-0)(図2)。
4. 最初の横隔膜ヘルニア作成手術(ステップ1.4-1.5)に従って、胎児および雌羊の外科的切開を閉じます。
5. テストデバイス
   1. デバイスが信号¹⁹を送信しているかどうかをテストします。
6. Eweの回復と監視
   1. 最初の手術に従って雌羊を回復します。
   2. 配達まで毎日雌羊を監視します。
   3. メドロキシプロゲステロン (0.5 mL) の 2 回目の投与は、妊娠 ~120 日で筋肉内投与します。
   4. 帝王切開の48時間前と24時間前にベタメタゾン(5.7 mg)を筋肉内投与して、出生後のケアのための胎児の成熟を促進します。.
7. ラムの配達
   1. 妊娠~142日(期間~147-150日)で、アセプロマジン(0.03 mg / Kg)とモルヒネ(0.3 mg / Kg)の筋肉内注射により雌羊を前投薬します。
   2. チオペンタール (10-15 mg/Kg) で静脈内麻酔を誘発し、気管内チューブ (サイズ 8.5 mm) で雌羊を挿管し、イソフルオランによる麻酔を維持し、以前の麻酔薬ごとに適切なモニタリングを行います。
   3. 以前の手術に従って子宮切開術による胎児の外科的分娩を進め、雌羊を背側横臥にします (ステップ 1.1 - 2.2)。
   4. 監視デバイスを取り外します。水と70%エタノールでデバイスを洗浄します。
   5. ペントバルビトンナトリウム溶液160mg / Kgの静脈内注射で雌羊を人道的に殺します。
   6. 子羊を2〜3時間蘇生させて換気し、人道的に殺します(160 mg / Kgのペントバルビトンナトリウム溶液、静脈内注射)。
8. データ
   1. データをラップトップにダウンロードして分析する¹⁹.6-h ウィンドウを使用して圧力データをフィルタリングします。羊水圧と気管圧の圧力差を計算します。

結果

先天性横隔膜ヘルニアの作成と圧力測定デバイスの挿入は、28 頭の子羊 (14 頭が閉塞していない子羊と 14 頭のバルーンが閉塞している) で行われました。15匹の子羊の胎児(6匹は閉塞せず、9匹はバルーン閉塞)は、ほぼ正期(妊娠142日、妊娠~147日)まで生存しました。14日間の圧力測定記録は、8匹の胎児の子羊(4匹は閉塞せず、4匹はバルーン閉塞)で成功しました。

ディスカッション

胎児の肺液は、妊娠中に潜在的な空域を満たし、正常な肺の発達に不可欠です¹。正常な肺液の量と圧力を変更すると、胎児の肺の成長に影響が及びます:胎児の気管の狭窄または狭窄は、肺の過形成につながります。逆に、羊水過少症と肺液の慢性的なドレナージは、肺形成不全を引き起こします20,21,22,23。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.59 mm (outside diameter, OD) to 3.18 mm (OD) connector	Qosina	11913
3.18 mm (OD) to 3.18 mm (OD) connector	Qosina	11684
70 % Alcohol	Henry Schein	1127067
Absorbable poliglecaprone 25 monofilament 3-0	Riverpoint Medical	Q316
Absorbable polydioxanone monofilament 1	Riverpoint Medical	D879
Absorbable polyglactin 910 braided 2-0	Riverpoint Medical	V317
Absorbable polydioxanone monofilament 5-0	Riverpoint Medical	D303
Acepromazine	Ceva Animal Health	APVMA No: 36680
Babcock, uterine forceps 6.25 inch	Roboz	RS-8022
Betamethasone	Merck Sharp & Dohme	Aust R 18777
Blade, size 10	Becton Dickinson	371110
Blade, size 15	Becton Dickinson	371115
Bupivacaine	Pfizer Australia Pty Ltd	AUST R 11312
Cefazolin	AFT pharmaceuticals	AUST R 171582
Chlorhexidine	Henry Schein	0404-0175-02
Endotracheal tube (size 8.0)	Jorgen Kruuse	272411
Forceps, Potts-Smith	Roboz	RS-5314
Iodine solution (10 %)	Henry Schein	6907281
Isoflurane	Piramal Critical Care	APVMA No: 53120/112272 M. L. No.:220/AP/MD/96/B&F/R
Ketamine	Ceva Animal Health	APVMA 37711/58317 KETALAB04
Hartmanns Solution	Baxter	AUST R 48510
Hemostats, Mosquito forceps curved delicate	Roboz	RS-7271
Medroxyprogesterone acetate	Pfizer Australia Pty Ltd	AUST R 12300
Meloxicam	Ilium	APVMA Approval No.: 62535/127884 LI0119V1
Methocel	Colorcon	ID34435
Microcuff endotracheal tube (3.0)	Halyard	35111
Midazolam	Mylan	AUST R 160205
Morphine	Pfizer Australia Pty Ltd	AUST R 101240
Needle, 22 G	Becton Dickinson	305155
Needle, 27 G	Becton Dickinson	305109
Nonabsorbable nylon monofilament 4-0	Riverpoint Medical	662BL
Nonabsorbable polypropylene monofilament 2-0	Riverpoint Medical	P8411
OpSite Transparent Film	Smith and Nephew	66000040
Oxytetracycline	Norbrook	APVMA Approval No: 53087/49616
Pentobarbitone sodium 300 mg/mL	Jurox	APVMA 36208
Peracetic acid/hydrogen peroxide	Medivators Inc	ref: 78401-649
Piperacillin/Tazobactam	Sandoz Pty Ltd	AUST R 140840
Scissors, Metzenbaum Surgical 7 inch straight	Roboz	RS-6955SC
Scissors, Vannas 0.15 mm tip width	Roboz	RS-5618
Silicone tubing (1.59 mm inside diameter)	Qosina	T2013
Suction catheter (5 French)	Covidien	30500
Syringe, 1 mL	Becton Dickinson	309659
Syringe, 10 mL	Becton Dickinson	309604
Syringe, 60 mL	Becton Dickinson	309654
Telemetry device	Politecnico di Milano	-	Not commercially available
Thiopentone sodium	Jurox Pty Ltd	APVMA No. 51520/5g/0809
Transdermal fentanyl patch	Janssen-Cilag Pty Ltd	AUST R 112371