エクスビボ ポリビニルアルコール培養におけるマウス造血幹細胞の増殖と遺伝子操作

要約

ここでは、 ex vivo ポリビニルアルコールベースの増殖を使用してマウス造血幹細胞培養を開始、維持、および分析するためのプロトコルと、レンチウイルス形質導入およびエレクトロポレーションによってそれらを遺伝子操作する方法を紹介します。

要約

自己複製型多能性造血幹細胞(HSC)は、生涯を通じて造血をサポートし、移植後に血液系全体を再構成する能力があるため、重要な細胞型です。造血幹細胞は、さまざまな血液疾患の治癒的治療を表す幹細胞移植療法で臨床的に使用されています。造血幹細胞活性と造血を調節するメカニズムの理解と、新しいHSCベースの治療法の開発の両方に大きな関心が寄せられています。しかしながら、幹細胞幹細胞の ex vivoでの安定した培養および増殖は、取り扱い可能な ex vivo システムでこれらの幹細胞を研究する上で大きな障壁となってきた。我々は最近、移植可能なマウス造血幹細胞の長期的・大規模拡大を支援できるポリビニルアルコールベースの培養系と、それらを遺伝子編集する方法を開発しました。このプロトコルは、エレクトロポレーションおよびレンチウイルス形質導入 を介して マウスHSCを培養および遺伝子操作する方法について説明しています。このプロトコルは、HSC生物学と造血に関心のある幅広い実験血液学者に役立つことが期待されます。

概要

造血系は、酸素供給から病原体との戦いまで、特殊な血液および免疫細胞タイプを通じて、哺乳類のさまざまな重要なプロセスをサポートします。造血幹および前駆細胞(HSPC)1によって維持される血液系の恒常性をサポートするためには、継続的な血液産生(造血)が必要です¹。最も原始的な造血細胞は造血幹細胞(HSC)であり、これは自己複製および多系統分化のためのユニークな能力を有する^2,3。これはまれな細胞集団であり、主に成体の骨髄⁴に見られ、約30,000細胞に1個の頻度で発生します。造血幹細胞は、生涯にわたる造血をサポートし、血液学的ストレス後の造血を再確立するのに役立つと考えられています。これらの能力はまた、HSCが照射されたレシピエントへの移植後に造血系全体を安定して再構成することを可能にする⁵。これは、HSCの機能的定義を表しており、さまざまな血液および免疫疾患の治癒的治療法であるHSC移植療法の科学的根拠も形成します⁶。これらの理由から、造血幹細胞は実験血液学の主要な焦点です。

研究の大きな焦点にもかかわらず、HSCをex vivo⁷で安定的に増殖させることは依然として困難でした。私たちは最近、マウス造血幹細胞⁸用の最初の長期生体外増殖培養システムを開発しました。このアプローチは、移植可能なHSCを4週間の培養で234〜899倍拡大することができます。他のアプローチと比較して、プロトコルの主な変更は、血清アルブミンの除去と合成ポリマーへの置き換えでした。ポリビニルアルコール(PVA)は、マウスHSC培養⁸に最適なポリマーとして同定され、現在では他の造血細胞タイプ⁹の培養にも使用されています。しかし、Soluplus(ポリビニルカプロラクタム-アセテート - ポリエチレングリコールグラフトコポリマー)と呼ばれる別のポリマーも最近同定されており、クローンHSCの膨張を改善するようです¹⁰。ポリマーを使用する前は、ウシ胎児血清、ウシ血清アルブミン画分V、または組換え血清アルブミンの形態の血清アルブミンが使用されていましたが、これらはHSC増殖のサポートが限られており、短期間(~1週間)のex vivo培養のみをサポートしていました⁷。しかしながら、HSCを静止状態で保持するHSC培養プロトコルは、より長いエクスビボ培養時間をサポートできることに留意すべきである^11、12。

他の培養方法と比較して、PVAベースの培養の主な利点は、生成できる細胞の数と、プロトコルを使用して幹細胞をex vivoで追跡できる時間の長さです。これは、マウスあたりの単離可能なHSCの数が少ない(数千人のみ)ことや、in vivoでHSCを経時的に追跡することの難しさなど、実験血液学の分野におけるいくつかの障壁を克服します。ただし、これらの培養物はHSC増殖を刺激しますが、in vivo HSCプールは主に定常状態で静止していることを覚えておくことが重要です¹³。さらに、培養物は造血幹細胞に選択的ですが、時間の経過とともに追加の細胞型が培養物とともに蓄積し、移植可能な造血幹細胞は1か月後に34細胞に約1個しか表しません。骨髄系造血前駆細胞は、これらのHSC培養において主要な夾雑細胞型であると思われる⁸。それにもかかわらず、これらの培養物を使用して、不均一な細胞集団からの造血幹細胞を濃縮することができます(例:c-Kit⁺骨髄HSPC14)。また、遺伝子操作のためのHSCの形質導入またはエレクトロポレーションもサポートしています^14,15,16。不均一な培養HSPC集団からの造血幹細胞の同定を支援するために、CD201(EPCR)は最近、有用なex vivo HSCマーカー10,17,18として同定され、移植可能な造血幹細胞はCD201+CD150+c-Kit⁺Sca1⁺系統^画分に限定されています。

このプロトコルでは、PVAベースのマウスHSC増殖培養を開始、維持、および評価する方法、およびエレクトロポレーションまたはレンチウイルスベクター形質導入を使用したこれらの培養内での遺伝子操作のプロトコルについて説明します。これらの手法は、様々な実験的血液学者にとって有用であることが期待されます。

プロトコル

繁殖や安楽死を含むすべての動物の手順は、制度的および国のガイドラインの範囲内で実行されなければなりません。以下に詳述する実験は、英国内務省によって承認されました。このプロトコルで使用されるすべての材料、試薬、および機器のリストについては、 材料の表 を参照してください。

1.ストックソリューションの準備

1. PVAストックソリューション
   1. 50 mLの組織培養品質の水を小さなガラス瓶に入れます(オートクレーブに適しています)。電子レンジで沸騰近くまで水を温めます。
   2. 5 gのPVA粉末を量り、水に加える。
      注意: 1〜5 gのPVAのみを溶解することをお勧めします。大量に溶解すると、再構成が不完全になる可能性があります。
   3. 蓋をしっかり閉め、振って混ぜます。次に、蓋を緩めます。
      注意: 水温の変化により圧力が変化する可能性があるため、再開するときは注意してください。
   4. オートクレーブして冷まします。蓋をしっかり閉め、振って混ぜます。滅菌チューブにアリコートを入れ、4°Cで最大3ヶ月間保存します。
2. 凍結乾燥サイトカインを1 mg/mL PVAを含むF-12培地に溶解します。幹細胞因子を10 μg/mLに、トロンボポエチンを100 μg/mLに再構成して、1:1,000のストックを生成します。滅菌チューブにアリコートを入れ、-80°Cで長期保存します。 または、アリコートを4°Cで最大1週間保存します。
   注:マウスHSCの増殖に悪影響を与えるため、ウシ血清アルブミン中のサイトカインの再構成は避けてください。

2. HSC骨髄抽出とc-Kit⁺ エンリッチメント

1. 安楽死させたばかりの8〜12週齢のC57BL / 6マウスから大腿骨、脛骨、骨盤、および脊椎を解剖し(CO₂窒息および/または頸椎脱臼を介して)、骨を氷上のPBSに置きます。
   注意: 表面とツールが70%エタノールで滅菌されていることを確認してください。
2. 糸くずの出ない繊細なタスクワイプを使用して骨をきれいにし、筋肉と脊髄を取り除き、~3mLのPBSを乳鉢に加えます。
   注意: 乳棒と乳鉢が70%エタノールで滅菌されていることを確認してから、PBSで一度洗い流してください。
3. せん断力を最小限に抑えるために、粉砕せずに乳棒で骨を粉砕します。5 mLシリンジに取り付けられた19 G針を使用して、PBSに放出された大きな骨髄断片を分解します。細胞懸濁液を70 μmフィルターを通して50 mLコニカルチューブに移します。
4. 懸濁液が移されたら、骨が漂白され、骨髄が見えなくなるまで、新鮮なPBSで繰り返します。マウスあたり~30 mL、2匹のマウスで~50 mLのエンドボリュームを目指します。
5. 骨髄細胞を混合し、10 μLの細胞を収集し、血球計算盤で1:10〜1:20の希釈でTürksの溶液を使用してカウントします。
   注:1匹のマウスは、2〜5×10⁸ 個の全骨髄細胞を生成すると予想されます。
6. 450 × g で4°Cで5分間スピンし、上清を捨て、ペレットを冷たいPBS(1匹のマウスで350 μL、2匹のマウスで500 μL)に再懸濁します。
7. 1,000万細胞あたり0.2 μLのアロフィコシアニン(APC)抗c-Kit抗体を添加し、4°Cの暗所で30分間インキュベートします。
8. インキュベートした細胞に5 mLのコールドPBSを加えて余分な抗体を洗い流し、50 μmのフィルターを通して新しい15 mLコニカルチューブにろ過します。
9. 元のチューブを7 mLの冷たいPBSで洗浄し、フィルターを通過させます。フィルターの目詰まりが発生した場合は、P1000チップでフィルター表面を傷つけてください。
10. 450 × g で4°Cで5分間スピンし、上清を捨て、ペレットを冷たいPBS(1匹のマウスで350 μL、または2匹のマウスで500 μL)に再懸濁します。
11. 1,000万細胞あたり0.2 μLの抗APCマイクロビーズを添加し、4°Cの暗所で15分間インキュベートします。 12 mLの滅菌PBSを加えて、余分なマイクロビーズを洗い流します。
12. 細胞を450 × g で4°Cで5分間スピンダウンし、2 mLのコールドPBSに再懸濁します。このステップでセルが回転している間に、ステップ2.13に進みます。
13. 磁気ろ過カラムを磁気カラムセパレーターの磁石に配置し、上部に50 μmフィルター、下部に15 mLコニカルチューブを配置して、カラム濃縮の準備をします。
14. 3 mLの滅菌PBSを50 μmのフィルターとろ過カラムに通します。PBSが通過したら、細胞懸濁液をカラムに通し、毎回3 mLの冷たいPBSを3回洗浄します。洗浄ごとに、カラムの滴下が止まるのを待ってから、次の洗浄を追加します。
15. カラムをマグネットから取り外し、新しい15 mLチューブの上に置きます。5 mLのコールドPBSを加え、カラムプランジャーをカラムに取り付け、プランジャーを押して細胞を溶出します。
16. c-Kit濃縮細胞を混合し、10 μLの細胞を収集し、Türksの溶液を血球計算盤で1:2の希釈でカウントします。1匹のマウスからの典型的な収量は、2〜5×10⁶ c-Kit⁺ 細胞です。
    注:この時点で、細胞をHSC培地に直接播種するか、HSC蛍光活性化セルソーティング(FACS)精製用に調製することができます。

3. c-Kit濃縮HSPCによる細胞培養の開始

1. 必要な細胞/ウェル数に合わせて新鮮な培地(表1)を準備します。c-Kit濃縮HSPC用にmLあたり0.5〜100万個の細胞を播種します。
2. c-Kit濃縮細胞をスピンダウンし、目的の細胞密度でHSC培地に再懸濁します。
3. 細胞をフィブロネクチンコーティングまたはネガティブ表面荷電プレートに、96ウェルプレートあたり200 μLまたは24ウェルプレートあたり1 mLで移します。
4. 細胞を37°Cおよび5%_CO2に設定された組織培養インキュベーターに入れる。

4. FACS精製造血幹細胞による細胞培養の開始

1. 適量のビオチン化系統抗体染色剤を調製する:1000万細胞あたり3μLのマスターミックス(表2)をPBSで1:100に希釈する。
2. c-Kit濃縮細胞をスピンダウンし、4°Cで30分間、系統抗体染色剤に再懸濁します。
3. 10 mLの滅菌PBSで洗浄し、450 × g で4°Cで5分間スピンダウンします。
4. 適切な量の新鮮なHSC抗体染色剤(表3)を調製する:1000万細胞あたり300μL。このサンプル染色と並行して、補正とゲーティングのために適切な染色コントロールサンプルを準備します。
   注:色素結合抗体を使用する場合は、ライトをオフにして組織培養フード内で作業してください。
5. 細胞をHSC抗体染色剤に再懸濁し、4°Cで90分間インキュベートします。細胞のペレット化を防ぐために、タップして20〜30分ごとに細胞を混合します。
6. 10 mLの滅菌PBSで洗浄し、450 × g で4°Cで5分間スピンダウンします。
7. 上清を吸引し、ペレットをフリックして破砕し、0.5 μg/mLのヨウ化プロピジウム(PI)を含む滅菌PBSに再懸濁します。
8. 必要なウェル数分の新しい培地(表1)を調製し、フィブロネクチンまたは負の表面荷電プレート(96ウェルプレートあたり200 μLまたは24ウェルプレートあたり1 mL)にプレートします。
9. FACSマシンをソーティング用に準備し、CD150⁺CD34-c-Kit⁺Sca1⁺系統^-HSCを培地含有ウェルに直接ソーティングします(ここで使用する標準的なFACSゲーティング戦略については、図1を参照してください)。96ウェルプレートウェルあたり最大200セル、または24ウェルプレートウェルあたり最大1,000セルをソーティングできます。
   注意: FACSマシンは、訓練を受けた科学者が操作する必要があります。マウスHSCのFACS分離の経験がない場合は、最寄りのFACS施設に連絡して、このソーティング戦略について話し合うことをお勧めします。

5. メディア変更の実行

1. c-Kit濃縮細胞から開始した細胞培養の場合は、2日後に培地交換を開始します。FACS単離された造血幹細胞から開始された細胞培養の場合は、5日後に培地交換を開始します。
2. すべてのウェルに十分な新鮮な予温(~37°C)HSC培地(表1)を準備します。
3. プレートを組織培養インキュベーターからそっと取り外します。
   注:負の表面帯電プレート上のHSPCはフィブロネクチン上のHSPCよりも乱されやすいため、負の表面帯電プレート上の培地を交換するときは、細胞培養を乱さないように特に注意する必要があります。
4. ピペットまたは真空ポンプを使用して、ウェルメニスカスから培地の~90%-95%をゆっくりと除去します。
   注:ウェルのベースから培地を引き出さないでください、さもなければ多くの細胞が取り除かれます。
5. 200 μL(96ウェルプレートの場合は1 mL)、新鮮な培地をウェルに加えます。
6. プレートを組織培養インキュベーターに戻します。
7. 実験の終了点まで、5.1〜5.6日ごとに手順2〜3を繰り返します。
8. c-Kit濃縮HSPCで開始した細胞培養(セクション3)では、~3週間後に培養液を1:2-1:3の比率で分割します。FACS精製造血幹細胞で開始した細胞培養(セクション4)では、~3週間後、培養物が>90%コンフルエントになった時点で、培養物を1:2-1:3の比率で分割します。
   注:正確なタイムラインは、実験の関心によって異なります。これらの培養物は4〜8週間特徴付けられています⁸、しかし、追加の培養長は可能かもしれません。

6. エレクトロポレーション培養HSPC

注:このプロトコルは、Cas9 / sgRNAリボ核タンパク質(RNP)のエレクトロポレーション用ですが、mRNAまたは他の組換えタンパク質のエレクトロポレーションにも適用できます。目的の実験時点でこれを実行するために、十分な数の細胞で培養を開始します。

1. セクション5で説明されているように、エレクトロポレーションの1日前に培地交換を実行します。
   注:エレクトロポレーションの前に、少なくとも一晩培養することをお勧めします。ただし、細胞は通常、形質導入の前に1〜3週間培養されます。
2. エレクトロポレーション当日、ヌクレオフェクターを設置します。マシンの電源を入れます。タッチスクリーンで、 X モジュールを選択してから、使用する キュベットサイズ を選択します。
3. エレクトロポレーションのスケール(キュベットあたり100 μLまたはマイクロキュベットあたり20 μL)に十分なP3溶液を(製造元の指示に従って)調製し、室温に平衡化させます。
4. 播種するウェル数に対して十分な新鮮な培地(表1)を準備し、24ウェルプレートウェル用に500 μLの培地を、96ウェルプレートウェルに100 μLの培地を追加します。
5. sgRNA(RNaseフリー水で2 μg/mLに希釈済み)を氷上で解凍し、滅菌PCRチューブ内で16 μgのsgRNAと30 μgのCas9酵素(10 μg/mL)を混合します。コントロールとしてCas9タンパク質のみを含む追加のPCRチューブを含めます。チューブをフリックして混合し、次に短く回転させます。サーモサイクラーで25°Cで10分間インキュベートしてRNPを複雑にした後、チューブを氷上に保ちます。
   注:マイクロキュベットでエレクトロポレーションを行う場合、これは5倍に縮小できます。
6. エレクトロポレーション用のHSPCを混合してチューブに移します。10 μLの細胞を収集し、血球計算盤で1:2の希釈でTürksの溶液を使用してカウントします。
   注:100 μLキュベットあたり1〜500万個の細胞をエレクトロポレーションすることをお勧めします(マイクロキュベットの場合は5倍に縮小)。
7. 1.5 mLチューブで450 × g 、4°Cで5分間、適切な数のセルをスピンダウンします。 できるだけ多くの上清を吸引し、100 μLのヌクレオフェクションバッファーで再懸濁します。
8. 細胞懸濁液を複合RNPとピペットを含むPCRチューブに直ちに移し、ゆっくりと混合し、100 μLのエレクトロポレーションキュベットに移します。混合物をゆっくりと1回の流体運動でキュベットに排出し、キュベット内の気泡の形成を回避します。
9. エレクトロポレーターで、エレクトロポレーションするウェルの位置を選択します。タッチスクリーンを使用して、細胞タイプ プログラムCD34⁺、 ヒトを選択するか、パルスコード EO100を入力します。 OK ボタンを押します。
10. キュベットをエレクトロポレーターに移します。タッチスクリーンの スタート ボタンを押して、エレクトロポレーションを開始します。エレクトロポレーションの直後に、500 μLの培養液をキュベットに加えます(マイクロキュベットを使用する場合は100 μL)。
11. 細胞を準備したプレートに静かに移し、組織培養インキュベーターに戻します。
12. AAV6ドナーテンプレートを使用する手順では、細胞をフィブロネクチンコーティングプレートに5,000ベクター/細胞の濃度で転写した直後にベクターを追加します。
13. 6〜18時間後、新しい培地を準備し、セクション5に記載されているように培地交換を実行します。この培地交換では、培地の80%〜90%のみを除去します。
    注意: ウェルの底から培地を引き上げることは避けてください。
14. 2日以上経過した時点でフローサイトメトリーで細胞を分析します(詳細はセクション8を参照)。
15. 実験の終点に達するまで、セクション5で説明されているように、2日ごとに培地交換を実行し続けます。
    注:この方法を使用したCRISPR/Cas9の編集速度は、設計されたsgRNAのターゲティング効率に大きく依存します。最大95%の編集率が効率的なガイド¹⁵で観察されています。sgRNA設計のガイドラインは、以前に他の場所で詳述されている^19,20。

7. レンチウイルスベクターによる培養造血幹細胞の形質導入

注:十分な数の細胞で培養を開始し、目的の実験時点でこれを実行します。

1. レンチウイルスベクターの生成と力価(実験目標による)。レンチウイルスベクターを氷上で解凍します。
2. 中程度の変更を実行します(セクション5のように)。次に、形質導入用のHSPCを混合してチューブに移します。10 μLの細胞を収集し、血球計算盤で1:2の希釈でTürksの溶液を使用してカウントします。
   注:細胞はメッキ直後に形質導入することができます。ただし、細胞は通常、形質導入の前に1〜3週間培養されます。
3. 形質導入に必要な量の細胞を再プレートします(通常、96ウェルプレートあたり100,000細胞)。別に、形質導入されていないネガティブコントロール細胞をプレート化する。
   注:負の表面帯電プレートを使用する場合は、レンチウイルスベクター形質導入のために細胞をフィブロネクチンコーティングプレートに移します。
4. レンチウイルスベクターを細胞の各ウェルに添加:細胞あたり20の形質導入ユニットを追加して、~30%の形質導入効率を達成します。ただし、実験要件に応じて、レンチウイルスベクターの用量を経験的に決定します。
   注:レンチウイルスベクターが施設のガイドラインに従って廃棄されていることを確認してください。
5. 細胞を組織培養インキュベーターに6時間戻す。その後、セクション5の説明に従って培地交換を実行します。
   注:上清には生きたウイルスが含まれています。機関のガイドラインに従って廃棄してください。
6. 2日以上後にフローサイトメトリー(例えば、GFP発現)によって細胞を分析する。詳細については、セクション 8 を参照してください。
7. 実験の終点に達するまで、セクション5で説明されているように、2日ごとに培地交換を実行し続けます。

8. HSPC培養物のフローサイトメトリー解析

1. 2%FBSを含むPBS中で濃縮培養 したエクスビボ HSC抗体ミックスを調製する(表4)。混合物を暗所で4°Cで最大1か月間保管します。
   注:色素標識抗体を使用する場合は、ライトをオフにして組織培養フードで作業してください。
2. 2 μLの濃縮抗体ミックスを50 μLの細胞に加えます。暗所で4°Cで30分間インキュベートします。このサンプル染色と並行して、補正とゲーティングのために適切な染色コントロールサンプルを準備します。
3. 2% FBSを含むPBSを200〜1,000 μL加え、450 × g で4°Cで5分間遠心分離します。 できるだけ多くの上清を除去し、2%FBSおよび0.5 μg/mL PIを含む100〜500 μLのPBSに再懸濁します。
4. フローサイトメーターをセットアップし、サンプルあたり少なくとも10,000の生細胞を記録します。
   注意: フローサイトメーターは、訓練を受けた科学者が操作する必要があります。フローサイトメトリーの経験がない場合は、最寄りのFACS施設に連絡して、この分析について話し合う必要があります。
5. データをFCS形式でエクスポートし、適切なフローサイトメトリー解析ソフトウェアを使用してデータを解析します。ここで使用する標準のゲーティング戦略については、 図 2 を参照してください。

結果

造血幹細胞のFACS精製では、c-Kitが豊富な骨髄内で、細胞の~0.2%が若い(8-12週齢)C57BL/6マウスのCD150+CD34-c-Kit⁺Sca1⁺系統^集団であると予想しています(図1)。ただし、トランスジェニックマウスまたは異なる年齢のマウスは、異なるHSC頻度を示す可能性があります。4週間の培養後、CD201+CD150⁺c-Kit⁺Sca1⁺系統

ディスカッション

このプロトコルが、HSC生物学、造血、および血液学をより一般的に調査するための有用なアプローチを提供することを願っています。FACS精製^HSCs8のPVAベースの培養法の最初の開発以来、この方法は拡張されてきた。例えば、この方法は、骨髄および負の表面荷電プレート¹⁴で富化されたc−Kitで機能することが示されている。形質導入およびエレクトロポレ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Dissection kit	Fisher Scientific	12764416
Hemocytometer	Appleton Woods Ltd	HC002
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit	Lonza	V4XP-3024
Pestle and mortar	Scientific Laboratory Supplies Limited	X18000
QuadroMACS separator	Miltenyi Biotec	130-090-976
Materials
5 mL syringe	VWR International Ltd	720-2519
19 G needle	VWR International Ltd	613-5394
50 μm cell strainer	Sysmex	04-004-2317
70 μm cell strainer	Corning	431751
Kimtech wipes	VWR International Ltd	115-2075
LS MACS column	Miltenyi Biotec	130-042-401
Reagents
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 μg	IDT	1081058
Animal free recombinant mouse stem cell factor	Peprotech	AF-250-03
Animal free recombinant mouse thrombopoietin	Peprotech	AF-315-14
Anti-mouse CD117 APC (clone: 2B8)	ThermoFisher	17-1171-83
Anti-mouse CD117 BV421 (clone: 2B8)	Biolegend	105828
Anti-mouse CD127 APC/Cy7 (clone: A7R34)	Biolegend	135040
Anti-mouse CD127 biotin (clone: A7R34)	Biolegend	135006
Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2)	Biolegend	115914
Anti-mouse CD201 APC (clone: eBio1560)	ThermoFisher	17-2012-82
Anti-mouse CD34 FITC (clone: RAM34)	ThermoFisher	11-0341-85
Anti-mouse CD4 APC/Cy7 (clone: RM4-5)	Biolegend	100526
Anti-mouse CD4 biotin (clone: RM4-5)	Biolegend	100508
Anti-mouse CD45R APC/Cy7 (clone: RA3-6B2)	Biolegend	103224
Anti-mouse CD45R biotin (clone: RA3-6B2)	Biolegend	103204
Anti-mouse CD48 BV421 (clone: HM48-1)	Biolegend	103428
Anti-mouse CD8 biotin (clone: 53-6.7)	Biolegend	100704
Anti-mouse CD8a APC/Cy7 (clone: 53-6.7)	Biolegend	100714
Anti-mouse Ly6G/Ly6C APC/Cy7 (clone: RB6-8C5)	Biolegend	108424
Anti-mouse Ly6G/Ly6C biotin (clone: RB6-8C5)	Biolegend	108404
Anti-mouse Sca1 PE (clone: D7)	Biolegend	108108
Anti-mouse Ter119 APC/Cy7 (clone: TER-119)	Biolegend	116223
Anti-mouse Ter119 biotin (clone: TER-119)	Biolegend	116204
CellBIND plates, 24-well	Corning	3337	negative surface charged
CellBIND plates, 96-well	Corning	3330	negative surface charged
Custom synthetic sgRNA	Synthego, Sigma Aldrich, IDT	Custom order
Fetal bovine serum	Merck Life Science UK Limited	F7524-50ML
Fibronectin Coated plates, 96-well	BD Biosciences	354409
Ham's F-12 Nutrient Mix	Gibco	11765054
Insulin-Transferrin-Selenium-X (100x)	Gibco	51500.056
Phosphate buffered saline	Alfa Aesar	J61196.AP
Polyvinyl alcohol	Sigma Aldrich	P8136
Propidium Iodide	Enzo Life Sciences (UK) Ltd	EXB-0018
Streptavidin APC/Cy7	Biolegend	405208
Türks’ solution	Sigma Aldrich	109277
Virkon	Mettler-Toledo Ltd	95015662