Ex Vivo Polivinil Alkol Bazlı Kültürlerde Fare Hematopoetik Kök Hücrelerinin Genleşmesi ve Genetik Manipülasyonu

Özet

Burada, ex vivo polivinil alkol bazlı genişleme kullanarak fare hematopoetik kök hücre kültürlerini başlatmak, sürdürmek ve analiz etmek için bir protokol ve ayrıca lentiviral transdüksiyon ve elektroporasyon yoluyla genetik olarak manipüle etme yöntemleri sunulmaktadır.

Özet

Kendini yenileyen multipotent hematopoetik kök hücreler (HSC'ler), yaşam boyu hematopoezi destekleme ve nakil sonrası tüm kan sistemini yeniden oluşturma yetenekleri nedeniyle önemli bir hücre tipidir. HSC'ler, bir dizi kan hastalığı için küratif tedaviyi temsil eden kök hücre nakli tedavilerinde klinik olarak kullanılmaktadır. Hem HSC aktivitesini ve hematopoezi düzenleyen mekanizmaların anlaşılmasına hem de yeni HSC tabanlı tedavilerin geliştirilmesine büyük ilgi vardır. Bununla birlikte, HSC'lerin ex vivo stabil kültürü ve genişlemesi, bu kök hücrelerin izlenebilir bir ex vivo sistemde incelenmesinde büyük bir engel olmuştur. Yakın zamanda, nakledilebilir fare HSC'lerinin uzun vadeli ve büyük ölçekli genişlemesini ve bunları genetik olarak düzenleme yöntemlerini destekleyebilecek bir polivinil alkol bazlı kültür sistemi geliştirdik. Bu protokol, elektroporasyon ve lentiviral transdüksiyon yoluyla fare HSC'lerini kültüre alma ve genetik olarak manipüle etme yöntemlerini açıklar. Bu protokolün HSC biyolojisi ve hematopoez ile ilgilenen çok çeşitli deneysel hematologlar için yararlı olması beklenmektedir.

Giriş

Hematopoetik sistem, memelilerde, oksijen tedarikinden patojenlerle savaşmaya, özel kan ve bağışıklık hücresi tiplerine kadar bir dizi temel süreci destekler. Hematopoetik kök ve progenitör hücreler (HSPC'ler) tarafından sürdürülen kan sistemi homeostazını desteklemek için sürekli kan üretimi (hematopoez) ^gereklidir1. En ilkel hematopoetik hücre, kendini yenileme ve çok soylu farklılaşma için benzersiz kapasitelere sahip olan hematopoetik kök hücredir (HSC) ^2,3. Bu, esas olarak yetişkin kemik iliği^4'te bulunan nadir bir hücre popülasyonudur ve burada yaklaşık her 30.000 hücrede sadece bir sıklıkta meydana gelir. HSC'lerin yaşam boyu hematopoezi desteklediği ve hematolojik stres sonrası hematopoezin yeniden kurulmasına yardımcı olduğu düşünülmektedir. Bu kapasiteler aynı zamanda HSC'lerin ışınlanmış bir alıcıya transplantasyonu takiben tüm hematopoetik sistemi stabil bir şekilde yeniden oluşturmasına izin verir⁵. Bu, bir HSC'nin fonksiyonel tanımını temsil eder ve aynı zamanda bir dizi kan ve bağışıklık hastalığı için iyileştirici bir tedavi olan HSC transplantasyon tedavisinin bilimsel temelini oluşturur⁶. Bu nedenlerden dolayı, HSC'ler deneysel hematolojinin ana odak noktasıdır.

Geniş bir araştırma odağına rağmen, HSC'leri ex vivo^7'yi istikrarlı bir şekilde genişletmek zor olmaya devam etmiştir. Kısa bir süre önce fare HSC'leri⁸ için ilk uzun vadeli ex vivo genişletme kültürü sistemini geliştirdik. Bu yaklaşım, nakledilebilir HSC'leri 4 haftalık bir kültür boyunca 234-899 kat genişletebilir. Alternatif yaklaşımlarla karşılaştırıldığında, protokoldeki en büyük değişiklik, serum albümininin çıkarılması ve sentetik bir polimerle değiştirilmesiydi. Polivinil alkol (PVA), fare HSC kültürleri⁸ için optimal bir polimer olarak tanımlanmıştır ve şimdi diğer hematopoetik hücre tipleri^9'u kültürlemek için de kullanılmıştır. Bununla birlikte, Soluplus (bir polivinil kaprolaktam-asetat-polietilen glikol greft kopolimeri) adı verilen başka bir polimer de yakın zamanda tanımlanmıştır ve bu da klonal HSC genişlemesini iyileştirdiği görülmektedir¹⁰. Polimerlerin kullanımından önce, fetal sığır serumu, sığır serum albümin fraksiyonu V veya rekombinant serum albümini şeklinde serum albümini kullanıldı, ancak bunlar HSC genişlemesi için sınırlı desteğe sahipti ve sadece kısa süreli (~ 1 hafta) ex vivo kültürü destekledi⁷. Bununla birlikte, HSC'leri sessiz bir durumda tutan HSC kültür protokollerinin daha uzun bir ex vivo kültür süresini destekleyebileceği unutulmamalıdır^11,12.

Diğer kültür yöntemleriyle karşılaştırıldığında, PVA tabanlı kültürlerin önemli bir avantajı, üretilebilecek hücre sayısı ve protokolün HSC'leri ex vivo izlemek için kullanılabileceği sürenin uzunluğudur. Bu, deneysel hematoloji alanında, fare başına izolalanabilir düşük HSC sayısı (sadece birkaç bin) ve HSC'leri in vivo olarak zaman içinde izlemenin zorluğu gibi çeşitli engellerin üstesinden gelir. Bununla birlikte, bu kültürlerin HSC proliferasyonunu uyardığını, in vivo HSC havuzunun ise ağırlıklı olarak kararlı bir durumda sessiz olduğunu hatırlamak önemlidir¹³. Ek olarak, kültürler HSC'ler için seçici olmasına rağmen, ek hücre tipleri zamanla kültürlerle birlikte birikir ve nakledilebilir HSC'ler 1 ay sonra 34 hücreden sadece birini temsil eder. Miyeloid hematopoetik progenitör hücreler bu HSC kültürlerinde başlıca kontamine edici hücre tipi gibi görünmektedir⁸. Bununla birlikte, bu kültürleri heterojen hücre popülasyonlarından HSC'leri zenginleştirmek için kullanabiliriz (örneğin, c-Kit ⁺ kemik iliği HSPC'leri¹⁴). Ayrıca genetik manipülasyon^14,15,16 için HSC'lerin transdüksiyonunu veya elektroporasyonunu destekler. Heterojen kültürlü HSPC popülasyonundan HSC'lerin tanımlanmasına yardımcı olmak için, CD201 (EPCR) yakın zamanda CD201 + CD150 + c-Kit + Sca1 ^{+ Soy} fraksiyonu ile sınırlı nakledilebilir HSC'ler ile yararlı bir ex vivo HSC belirteci ^10,17,18 olarak tanımlanmıştır.

Bu protokol, PVA tabanlı fare HSC genişleme kültürlerini başlatmak, sürdürmek ve değerlendirmek için kullanılan yöntemleri ve ayrıca elektroporasyon veya lentiviral vektör transdüksiyonu kullanarak bu kültürlerde genetik manipülasyon protokollerini açıklar. Bu yöntemlerin bir dizi deneysel hematolog için yararlı olması beklenmektedir.

Protokol

Damızlık ve ötenazi de dahil olmak üzere tüm hayvan prosedürleri, kurumsal ve ulusal yönergeler dahilinde gerçekleştirilmelidir. Aşağıda detaylandırılan deneyler İngiltere İçişleri Bakanlığı tarafından onaylanmıştır. Bu protokolde kullanılan tüm malzemelerin, reaktiflerin ve ekipmanların bir listesi için Malzeme Tablosuna bakın.

1. Stok çözümlerinin hazırlanması

1. PVA stok çözümü
   1. Küçük bir cam şişede 50 mL doku kültürü kalitesinde su alın (otoklavlama için uygundur). Suyu mikrodalgada kaynamaya yakın bir yere ısıtın.
   2. 5 g PVA tozunu tartın ve suya ekleyin.
      NOT: Sadece 1-5 g PVA'nın çözülmesi önerilir. Daha büyük miktarların çözülmesi, eksik yeniden yapılanmaya neden olabilir.
   3. Kapağı sıkıca kapatın ve karıştırmak için çalkalayın. Ardından, kapağı gevşetin.
      NOT: Değişen su sıcaklığı nedeniyle basınç değişebileceğinden, yeniden açarken dikkatli olun.
   4. Otoklavlayın ve soğumaya bırakın. Kapağı sıkıca kapatın ve karıştırmak için çalkalayın. Alikotları steril tüplerde yapın ve 4 ° C'de 3 aya kadar saklayın.
2. Liyofilize sitokinleri 1 mg/mL PVA içeren F-12 ortamında çözün. 1:1.000 stok üretmek için kök hücre faktörünü 10 μg / mL'ye ve trombopoietini 100 μg / mL'ye yeniden oluşturun. Alikotları steril tüplerde yapın ve -80 ° C'de uzun süre saklayın. Alternatif olarak, alikotları 4 ° C'de 1 haftaya kadar saklayın.
   NOT: Fare HSC genişlemesi üzerindeki olumsuz etkisi nedeniyle sığır serum albüminindeki sitokinlerin sulandırılmasından kaçının.

2. HSC kemik iliği ekstraksiyonu ve c-Kit ⁺ zenginleştirme

1. Femurları, tibialları, pelvisleri ve omurgayı taze ötenazi yapılmış 8-12 haftalık C57BL / 6 farelerinden (CO₂ boğulma ve / veya servikal çıkık yoluyla) diseke edin ve kemikleri PBS'ye buz üzerine yerleştirin.
   NOT: Yüzeylerin ve aletlerin %70 etanol ile sterilize edildiğinden emin olun.
2. Tüy bırakmayan hassas görev mendilleri kullanarak kemikleri temizleyin, kas ve omuriliği çıkarın ve ~ 3 mL PBS içeren bir harç ekleyin.
   NOT: Havan ve harcın %70 etanol ile sterilize edildiğinden ve daha sonra PBS ile bir kez yıkandığından emin olun.
3. Kesme kuvvetlerini en aza indirmek için kemikleri taşlamadan havaneyle ezin. 5 mL'lik bir şırıngaya bağlı 19 G'lik bir iğne kullanarak PBS'ye salınan büyük kemik iliği parçalarını parçalayın. Hücre süspansiyonunu 70 μm'lik bir filtreden 50 mL'lik bir konik tüpe aktarın.
4. Süspansiyon aktarıldıktan sonra, kemikler ağartılana ve ilik görünmeyene kadar taze PBS ile tekrarlayın. Fare başına ~30 mL ve iki fare için ~50 mL'lik bir uç hacmi hedefleyin.
5. Kemik iliği hücrelerini karıştırın, 10 μL hücre toplayın ve bir hemositometre ile 1:10-1:20 seyreltmede Türks çözeltisini kullanarak sayın.
   NOT: Bir farenin 2-5 × 10⁸ tam kemik iliği hücresi vermesi beklenmektedir.
6. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 450 × g'da döndürün, süpernatanı atın ve peleti soğuk PBS'de (bir fare için 350 μL veya iki fare için 500 μL) yeniden askıya alın.
7. 10 milyon hücre başına 0.2 μL allophycocyanin (APC) anti-c-Kit antikoru ekleyin ve karanlıkta 4 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
8. Fazla antikoru temizlemek için inkübe edilmiş hücrelere 5 mL soğuk PBS ekleyin ve 50 μm'lik bir filtreden taze 15 mL'lik bir konik tüpe süzün.
9. Orijinal tüpü 7 mL soğuk PBS ile yıkayın ve filtreden geçirin. Filtre tıkanması meydana gelirse, filtre yüzeyini bir P1000 ucu ile çizin.
10. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 450 × g'da döndürün, süpernatanı atın ve peleti soğuk PBS'de (bir fare için 350 μL veya iki fare için 500 μL) yeniden askıya alın.
11. 10 milyon hücre başına 0.2 μL anti-APC mikroboncuk ekleyin ve karanlıkta 4 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edin. Fazla mikroboncukları yıkamak için 12 mL steril PBS ekleyin.
12. Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 450 × g'da döndürün ve 2 mL soğuk PBS'de tekrar askıya alın. Bu adımda hücreler dönerken, adım 2.13'e geçin.
13. Manyetik bir kolon ayırıcının mıknatısına, üstte 50 μm filtre ve aşağıda 15 mL konik tüp olacak şekilde manyetik bir filtreleme sütunu yerleştirerek kolon zenginleştirmeye hazırlanın.
14. 50 μm filtre ve filtreleme sütunundan 3 mL steril PBS çalıştırın. PBS geçtikten sonra, hücre süspansiyonunu sütundan geçirin, ardından her seferinde 3 mL soğuk PBS'nin üç yıkamasını yapın. Her yıkama için, bir sonraki yıkamayı eklemeden önce sütunun damlamasının durmasını bekleyin.
15. Kolonu mıknatıstan çıkarın ve taze 15 mL'lik bir tüpün üzerine yerleştirin. 5 mL soğuk PBS ekleyin, kolon pistonunu kolonun üzerine takın ve pistonu iterek hücreleri boşaltın.
16. C-Kit ile zenginleştirilmiş hücreleri karıştırın, 10 μL hücre toplayın ve bir hemositometre ile 1:2 seyreltmede Türklerin çözeltisini kullanarak sayın. Bir farenin tipik verimi 2-5 × 10^{6 c-Kit+} hücredir.
    NOT: Bu noktada, hücreler doğrudan HSC ortamına tohumlanabilir veya HSC floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) saflaştırması için hazırlanabilir.

3. C-Kit ile zenginleştirilmiş HSPC'lerle hücre kültürlerinin başlatılması

1. Gerekli hücre/kuyucuk sayısı için taze ortam hazırlayın (Tablo 1). C-Kit ile zenginleştirilmiş HSPC'ler için mL başına 0,5-1 milyon hücre tohumu.
2. C-Kit ile zenginleştirilmiş hücreleri döndürün ve HSC ortamında istenen hücre yoğunluğunda yeniden askıya alın.
3. Hücreleri, 96 delikli plaka başına 200 μL veya 24 delikli plaka başına 1 mL'de fibronektin kaplı veya negatif yüzey yüklü plakalara aktarın.
4. Hücreleri 37 °C ve% 5 CO_2'ye ayarlanmış bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin.

4. FACS saflaştırılmış HSC'ler ile hücre kültürlerinin başlatılması

1. Biyotinile soy antikor boyasının uygun bir hacmini hazırlayın: PBS'de 1:100 seyreltilmiş 10 milyon hücre başına 3 μL ana karışım (Tablo 2).
2. C-Kit ile zenginleştirilmiş hücreleri döndürün ve soy antikor boyasında 4 ° C'de 30 dakika boyunca tekrar askıya alın.
3. 10 mL steril PBS ile yıkayın ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 450 × g'da döndürün.
4. Taze HSC antikor boyasının uygun bir hacmini hazırlayın (Tablo 3): 10 milyon hücre başına 300 μL. Bu numune boyamanın yanı sıra, kompanzasyon ve geçit için uygun boyama kontrol numuneleri hazırlayın.
   NOT: Boya konjuge antikorları kullanırken ışık kapalı olarak bir doku kültürü başlığında çalışın.
5. HSC antikor boyasındaki hücreleri tekrar askıya alın ve 90 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Hücre peletlenmesini önlemek için hücreleri her 20-30 dakikada bir dokunarak karıştırın.
6. 10 mL steril PBS ile yıkayın ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 450 × g'da döndürün.
7. Süpernatanı aspire edin, peletin bozulması için hafifçe vurun ve steril PBS'de 0.5 μg / mL propidium iyodür (PI) ile yeniden askıya alın.
8. Gerekli kuyucuk sayısı için taze ortam hazırlayın (Tablo 1) ve fibronektin veya negatif yüzey yüklü plakalara (96 delikli plaka başına 200 μL veya 24 delikli plaka başına 1 mL) plaka hazırlayın.
9. CD150⁺CD34-c-Kit+Sca1^+Lineage- HSC'leri doğrudan ortam içeren kuyulara sıralamak ve sıralamak için FACS makinesini hazırlayın (burada kullanılan standart FACS geçit stratejisi için Şekil 1'e bakın). 96 delikli plaka kuyusu başına en fazla 200 hücreyi veya 24 delikli plaka kuyusu başına en fazla 1.000 hücreyi sıralayın.
   NOT: FACS makineleri eğitimli bir bilim adamı tarafından çalıştırılmalıdır. Fare HSC'lerinin FACS izolasyonu konusunda deneyimli olmayan kullanıcıların bu sıralama stratejisini tartışmak için yerel FACS tesislerine başvurmaları önerilir.

5. Medya değişiklikleri gerçekleştirme

1. C-Kit ile zenginleştirilmiş hücrelerden başlatılan hücre kültürleri için, 2 gün sonra ortam değişikliklerine başlayın. FACS ile izole HSC'lerden başlatılan hücre kültürleri için, 5 gün sonra ortam değişikliklerine başlayın.
2. Tüm kuyucuklar için yeterli taze ön ısıtılmış (~ 37 °C) HSC ortamı (Tablo 1) hazırlayın.
3. Plakayı doku kültürü inkübatöründen yavaşça çıkarın.
   NOT: Negatif yüzey yüklü plakalardaki HSPC'ler fibronektin üzerindeki HŞK'lerden daha kolay rahatsız edildiğinden, hücre kültürlerini rahatsız etmemek için negatif yüzey yüklü plakalardaki ortamı değiştirirken ekstra özen gösterilmelidir.
4. Bir pipet veya vakum pompası kullanarak, ortamın ~% 90 -% 95'ini kuyu menisküsünden yavaşça çıkarın.
   NOT: Ortamı kuyunun tabanından çekmekten kaçının, aksi takdirde birçok hücre çıkarılacaktır.
5. Kuyuya 200 μL (96 delikli plakalar için; 24 delikli plakalar için 1 mL) taze ortam ekleyin.
6. Plakayı doku kültürü inkübatörüne geri koyun.
7. Deneysel bitiş noktasına kadar her 2-3 günde bir 5.1-5.6 arasındaki adımları tekrarlayın.
8. C-Kit ile zenginleştirilmiş HSPC'lerle başlatılan hücre kültürleri için (bölüm 3), kültürleri ~ 3 hafta sonra 1: 2-1: 3 oranında bölün. FACS saflaştırılmış HSC'ler (bölüm 4) ile başlatılan hücre kültürleri için, kültürleri ~ 3 hafta sonra ve kültürlerin% >90'ı birleştiğinde 1: 2-1: 3 oranında bölün.
   NOT: Tam zaman çizelgesi deneysel ilgi alanlarına bağlı olacaktır. Bu kültürler 4-8 hafta⁸ boyunca karakterize edilmiştir, ancak ek kültür uzunlukları mümkün olabilir.

6. Kültürlü HSPC'lerin elektroporasyonu

NOT: Bu protokol Cas9 / sgRNA ribonükleoproteinin (RNP) elektroporasyonu içindir, ancak mRNA veya diğer rekombinant proteinlerin elektroporasyonu için uyarlanabilir. Bunu istenen deneysel zaman noktasında gerçekleştirmek için yeterli sayıda hücreye sahip kültürleri başlatın.

1. Bölüm 5'te açıklandığı gibi, elektroporasyondan 1 gün önce orta bir değişiklik yapın.
   NOT: Elektroporasyondan önce en az bir gece kültürü önerilir. Bununla birlikte, hücreler tipik olarak transdüksiyondan önce 1-3 hafta boyunca kültürlenir.
2. Elektroporasyon gününde, nükleofektoru kurun. Makineyi açın. Dokunmatik ekranda, X modülünü ve ardından kullanılan küvet boyutunu seçin.
3. Elektroporasyon ölçeği için yeterli P3 çözeltisi (üreticinin talimatlarına göre) hazırlayın (küvet başına 100 μL veya mikroküvet başına 20 μL) ve oda sıcaklığına dengelenmesine izin verin.
4. Kaplanan kuyucuk sayısı için yeterli taze ortam (Tablo 1) hazırlayın ve 24 delikli bir plaka kuyusu için 500 μL ortam veya 96 delikli bir plaka kuyusuna 100 μL ortam ekleyin.
5. Buz üzerinde sgRNA'yı (RNaz içermeyen suda 2 μg / mL'ye kadar önceden seyreltilmiş) çözün ve 16 μg sgRNA'yı steril bir PCR tüpünde 30 μg Cas9 enzimi (10 μg / mL'de) ile karıştırın. Kontrol olarak sadece Cas9 proteini içeren ekstra bir PCR tüpü ekleyin. Tüpü hafifçe vurarak karıştırın, sonra kısaca aşağı doğru döndürün. RNP'yi kompleksleştirmek için bir termosikletçide 10 dakika boyunca 25 ° C'de inkübe edin ve ardından tüpleri buz üzerinde tutun.
   NOT: Mikroküvetlerde elektroporasyon yapılırsa bu beş kat küçültülebilir.
6. HSPC'leri elektroporasyon için karıştırın ve bir tüpe aktarın; 10 μL hücre toplayın ve bir hemositometre ile 1:2 seyreltmede Türks çözeltisini kullanarak sayın.
   NOT: 100 μL küvet başına 1-5 milyon hücrenin elektroporlanması önerilir (mikroküvet için beş kat küçültülür).
7. Uygun sayı hücrelerini 1,5 mL'lik bir tüpte 450 × g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca döndürün. Süpernatantın mümkün olduğunca çoğunu aspire edin ve 100 μL nükleofeksiyon tamponu ile yeniden askıya alın.
8. Hücre süspansiyonunu derhal kompleks RNP ve pipet içeren PCR tüpüne yavaşça yukarı ve aşağı aktararak nazikçe karıştırın ve 100 μL'lik bir elektroporasyon küvetine aktarın. Küvette hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için karışımı yavaşça ve tek bir akışkan hareketle küvetin içine çıkarın.
9. Elektroporatörde, elektroporasyona tabi tutulan kuyucukların konumunu seçin. Dokunmatik ekranı kullanarak CD34⁺, insan hücre tipi programını seçin veya EO100 darbe kodunu yazın. OK düğmesine basın.
10. Küvetleri elektroporatöre aktarın. Elektroporasyonu başlatmak için dokunmatik ekrandaki Başlat düğmesine basın. Elektroporasyondan hemen sonra, küvete 500 μL kültür ortamı ekleyin (bir mikroküvet kullanılıyorsa 100 μL).
11. Hücreleri yavaşça hazırlanan plakaya aktarın ve doku kültürü inkübatörüne geri dönün.
12. Bir AAV6 donör şablonu kullanan prosedürler için, hücreler 5.000 vektör / hücre konsantrasyonunda fibronektin kaplı bir plakaya aktarıldıktan hemen sonra vektörü ekleyin.
13. 6-18 saat sonra, taze ortam hazırlayın ve bölüm 5'te açıklandığı gibi bir ortam değişikliği yapın. Bu ortam değişikliği için, ortamın sadece% 80 -% 90'ını çıkarın.
    NOT: Ortamı kuyunun tabanından çekmekten kaçının.
14. Hücreleri 2 veya daha fazla gün sonra akış sitometrisi ile analiz edin (ayrıntılar için Bölüm 8'e bakın).
15. Deneysel bitiş noktasına ulaşılana kadar, bölüm 5'te açıklandığı gibi her 2 günde bir orta değişiklikler yapmaya devam edin.
    NOT: Bu yöntemi kullanarak CRISPR / Cas9'un düzenleme oranları, tasarlanan sgRNA'nın hedefleme verimliliğine büyük ölçüde bağlıdır. Verimli bir kılavuz ile %95'e varan düzenleme oranları gözlemlenmiştir¹⁵. SgRNA tasarımı için kılavuzlar daha önce başka bir yerde detaylandırılmıştır ^19,20.

7. Kültürlü HSPC'lerin lentiviral vektör ile dönüştürülmesi

NOT: İstenilen deneysel zaman noktasında gerçekleştirmek için yeterli sayıda hücreye sahip kültürleri başlatın.

1. Lentiviral vektör üretin ve titreyin (deneysel hedeflere bağlı olarak). Buz üzerinde lentiviral vektörü çözün.
2. Orta bir değişiklik yapın (bölüm 5'te olduğu gibi); daha sonra, HSPC'leri bir tüpe transdüksiyon için karıştırın ve aktarın. 10 μL hücre toplayın ve bir hemositometre ile 1:2 seyreltmede Türks çözeltisini kullanarak sayın.
   NOT: Hücreler kaplamadan hemen sonra dönüştürülebilir. Bununla birlikte, hücreler tipik olarak transdüksiyondan önce 1-3 hafta boyunca kültürlenir.
3. Transdüksiyon için gerekli hücre dozunu yeniden plakalayın (tipik olarak 96 delikli plaka başına 100.000 hücre). Ayrı ayrı, plaka dönüştürülmemiş negatif kontrol hücreleri.
   NOT: Negatif yüzey yüklü plakalar kullanılıyorsa, lentiviral vektör transdüksiyonu için hücreleri fibronektin kaplı plakalara aktarın.
4. Her hücre kuyucuğuna lentiviral vektör ekleyin: ~% 30 transdüksiyon verimliliği elde etmek için hücre başına 20 transdüksiyon birimi ekleyin. Bununla birlikte, deneysel gereksinimlere bağlı olarak lentiviral vektör dozunu ampirik olarak belirleyin.
   NOT: Lentiviral vektörün kurumsal yönergelere göre atıldığından emin olun.
5. Hücreleri 6 saat boyunca doku kültürü inkübatörüne geri döndürün. Daha sonra, bölüm 5'te açıklandığı gibi bir orta değişiklik yapın.
   NOT: Supernatant canlı virüs içerir. Kurumsal yönergelere göre atın.
6. Hücreleri 2 gün veya daha uzun bir süre sonra akış sitometrisi (örneğin, GFP ekspresyonu için) ile analiz edin. Ayrıntılar için bölüm 8'e bakın.
7. Deneysel bitiş noktasına ulaşılana kadar, bölüm 5'te açıklandığı gibi her 2 günde bir orta değişiklikler yapmaya devam edin.

8. HSPC kültürlerinin akış sitometrik analizi

1. PBS'de %2 FBS içeren konsantre kültürlü ex vivo HSC antikor karışımı hazırlayın (Tablo 4). Karışımı karanlıkta 4 °C'de 1 aya kadar saklayın.
   NOT: Boya konjuge antikorları kullanırken ışıklar kapalı bir doku kültürü başlığında çalışın.
2. 50 μL hücreye 2 μL konsantre antikor karışımı ekleyin. Karanlıkta 4 ° C'de 30 dakika inkübe edin. Bu numune boyamanın yanı sıra, kompanzasyon ve geçit için uygun boyama kontrol numuneleri hazırlayın.
3. % 2 FBS içeren 200-1.000 μL PBS ekleyin ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 450 × g'da santrifüj yapın. Mümkün olduğunca fazla süpernatantı çıkarın ve% 2 FBS ve 0,5 μg / mL PI içeren 100-500 μL PBS'de yeniden askıya alın.
4. Akış sitometresini ayarlayın ve numune başına en az 10.000 canlı hücre kaydedin.
   NOT: Akış sitometreleri eğitimli bir bilim adamı tarafından çalıştırılmalıdır. Kullanıcılar, akış sitometrisinde deneyimli değillerse, bu analizi tartışmak için yerel FACS tesislerine başvurmalıdır.
5. Verileri FCS formatında dışa aktarın ve uygun akış sitometri analiz yazılımını kullanarak verileri analiz edin. Burada kullanılan standart geçit stratejisi için Şekil 2'ye bakın.

Sonuçlar

HSC'lerin FACS saflaştırılması için, c-Kit ile zenginleştirilmiş kemik iliği içinde, hücrelerin ~% 0.2'sinin genç (8-12 haftalık) C57BL / 6 fareler için CD150 + CD34-c-Kit + Sca1 ^{+ Soy popülasyonu} olmasını bekliyoruz (Şekil 1). Bununla birlikte, transgenik farelerin veya farklı yaşlardaki farelerin farklı HSC frekansları göstermesi muhtemeldir. 4 haftalık kültürden sonra, CD201 + CD150 + c-Kit + Sca1

Tartışmalar

Bu protokolün HSC biyolojisini, hematopoezi ve hematolojiyi daha genel olarak araştırmak için yararlı bir yaklaşım sunduğunu umuyoruz. FACS saflaştırılmış HSC'ler⁸ için PVA tabanlı kültür yönteminin ilk geliştirilmesinden bu yana, yöntem genişletilmiştir. Örneğin, yöntemin kemik iliği ile zenginleştirilmiş c-Kit ve negatif yüzey yüklü plakalarla çalıştığı gösterilmiştir¹⁴. Transdüksiyon ve elektroporasyon ile uyumluluğu da gösterilm...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Dissection kit	Fisher Scientific	12764416
Hemocytometer	Appleton Woods Ltd	HC002
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit	Lonza	V4XP-3024
Pestle and mortar	Scientific Laboratory Supplies Limited	X18000
QuadroMACS separator	Miltenyi Biotec	130-090-976
Materials
5 mL syringe	VWR International Ltd	720-2519
19 G needle	VWR International Ltd	613-5394
50 μm cell strainer	Sysmex	04-004-2317
70 μm cell strainer	Corning	431751
Kimtech wipes	VWR International Ltd	115-2075
LS MACS column	Miltenyi Biotec	130-042-401
Reagents
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 μg	IDT	1081058
Animal free recombinant mouse stem cell factor	Peprotech	AF-250-03
Animal free recombinant mouse thrombopoietin	Peprotech	AF-315-14
Anti-mouse CD117 APC (clone: 2B8)	ThermoFisher	17-1171-83
Anti-mouse CD117 BV421 (clone: 2B8)	Biolegend	105828
Anti-mouse CD127 APC/Cy7 (clone: A7R34)	Biolegend	135040
Anti-mouse CD127 biotin (clone: A7R34)	Biolegend	135006
Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2)	Biolegend	115914
Anti-mouse CD201 APC (clone: eBio1560)	ThermoFisher	17-2012-82
Anti-mouse CD34 FITC (clone: RAM34)	ThermoFisher	11-0341-85
Anti-mouse CD4 APC/Cy7 (clone: RM4-5)	Biolegend	100526
Anti-mouse CD4 biotin (clone: RM4-5)	Biolegend	100508
Anti-mouse CD45R APC/Cy7 (clone: RA3-6B2)	Biolegend	103224
Anti-mouse CD45R biotin (clone: RA3-6B2)	Biolegend	103204
Anti-mouse CD48 BV421 (clone: HM48-1)	Biolegend	103428
Anti-mouse CD8 biotin (clone: 53-6.7)	Biolegend	100704
Anti-mouse CD8a APC/Cy7 (clone: 53-6.7)	Biolegend	100714
Anti-mouse Ly6G/Ly6C APC/Cy7 (clone: RB6-8C5)	Biolegend	108424
Anti-mouse Ly6G/Ly6C biotin (clone: RB6-8C5)	Biolegend	108404
Anti-mouse Sca1 PE (clone: D7)	Biolegend	108108
Anti-mouse Ter119 APC/Cy7 (clone: TER-119)	Biolegend	116223
Anti-mouse Ter119 biotin (clone: TER-119)	Biolegend	116204
CellBIND plates, 24-well	Corning	3337	negative surface charged
CellBIND plates, 96-well	Corning	3330	negative surface charged
Custom synthetic sgRNA	Synthego, Sigma Aldrich, IDT	Custom order
Fetal bovine serum	Merck Life Science UK Limited	F7524-50ML
Fibronectin Coated plates, 96-well	BD Biosciences	354409
Ham's F-12 Nutrient Mix	Gibco	11765054
Insulin-Transferrin-Selenium-X (100x)	Gibco	51500.056
Phosphate buffered saline	Alfa Aesar	J61196.AP
Polyvinyl alcohol	Sigma Aldrich	P8136
Propidium Iodide	Enzo Life Sciences (UK) Ltd	EXB-0018
Streptavidin APC/Cy7	Biolegend	405208
Türks’ solution	Sigma Aldrich	109277
Virkon	Mettler-Toledo Ltd	95015662