Ex Vivo Expansion et manipulation génétique de cellules souches hématopoïétiques de souris dans des cultures à base d’alcool polyvinylique

Résumé

On présente ici un protocole pour initier, maintenir et analyser des cultures de cellules souches hématopoïétiques de souris en utilisant une expansion ex vivo à base d’alcool polyvinylique, ainsi que des méthodes pour les manipuler génétiquement par transduction lentivirale et électroporation.

Résumé

Les cellules souches hématopoïétiques multipotentes (CSH) autorenouvelables sont un type cellulaire important en raison de leur capacité à soutenir l’hématopoïèse tout au long de la vie et à reconstituer l’ensemble du système sanguin après la transplantation. Les CSH sont utilisées cliniquement dans les thérapies de transplantation de cellules souches, qui représentent un traitement curatif pour une gamme de maladies du sang. Il existe un intérêt considérable à la fois pour la compréhension des mécanismes qui régulent l’activité des CSH et de l’hématopoïèse, et pour le développement de nouvelles thérapies basées sur les CSH. Cependant, la culture stable et l’expansion des CSH ex vivo ont été un obstacle majeur à l’étude de ces cellules souches dans un système ex vivo traitable. Nous avons récemment développé un système de culture à base d’alcool polyvinylique qui peut soutenir l’expansion à long terme et à grande échelle des CSH de souris transplantables et des méthodes pour les modifier génétiquement. Ce protocole décrit les méthodes de culture et de manipulation génétique des CSH de souris par électroporation et transduction lentivirale. Ce protocole devrait être utile à un large éventail d’hématologues expérimentaux intéressés par la biologie des CSH et l’hématopoïèse.

Introduction

Le système hématopoïétique soutient une gamme de processus essentiels chez les mammifères, de l’apport d’oxygène à la lutte contre les agents pathogènes, en passant par des types de cellules sanguines et immunitaires spécialisées. La production sanguine continue (hématopoïèse) est nécessaire pour soutenir l’homéostasie du système sanguin, qui est soutenue par les cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC)¹. La cellule hématopoïétique la plus primitive est la cellule souche hématopoïétique (CSH), qui possède des capacités uniques d’auto-renouvellement et de différenciation multilignée ^2,3

Protocole

Toutes les procédures animales, y compris l’élevage et l’euthanasie, doivent être effectuées dans le respect des directives institutionnelles et nationales. Les expériences détaillées ci-dessous ont été approuvées par le ministère de l’Intérieur du Royaume-Uni. Voir le tableau des matériaux pour une liste de tous les matériaux, réactifs et équipements utilisés dans ce protocole.

1. Préparation des solutions de stock

1. Solution mère PVA
   1. Prélever 50 ml d’eau de culture tissulaire dans une petite bouteille en verre (adaptée à l’autoclavage). Réchauffer l’eau jusqu’à ce qu’elle soit presque bouil....

Résultats

Pour la purification FACS des CSH, nous nous attendons à ce que dans la moelle osseuse enrichie en c-Kit, ~0,2% des cellules soient la population CD150⁺CD34-c-Kit+Sca1⁺Lineage- pour les jeunes souris C57BL/6 (^8-12 semaines) (Figure 1). Cependant, il est probable que les souris transgéniques ou les souris d’âges différents présentent des fréquences de CSH différentes. Après 4 semaines de culture, nous nous attendons à ce que la.......

Discussion

Nous espérons que ce protocole fournira une approche utile pour étudier la biologie des CSH, l’hématopoïèse et l’hématologie plus généralement. Depuis le développement initial de la méthode de culture à base de PVA pour^{les CSH} 8 purifiés par FACS, la méthode a été étendue. Par exemple, il a été démontré que la méthode fonctionne avec c-Kit enrichi en moelle osseuse et avec des plaques chargées en surface négative¹⁴. Sa compatibilité avec la trans.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Dissection kit	Fisher Scientific	12764416
Hemocytometer	Appleton Woods Ltd	HC002
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit	Lonza	V4XP-3024
Pestle and mortar	Scientific Laboratory Supplies Limited	X18000
QuadroMACS separator	Miltenyi Biotec	130-090-976
Materials
5 mL syringe	VWR International Ltd	720-2519
19 G needle	VWR International Ltd	613-5394
50 μm cell strainer	Sysmex	04-004-2317
70 μm cell strainer	Corning	431751
Kimtech wipes	VWR International Ltd	115-2075
LS MACS column	Miltenyi Biotec	130-042-401
Reagents
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 μg	IDT	1081058
Animal free recombinant mouse stem cell factor	Peprotech	AF-250-03
Animal free recombinant mouse thrombopoietin	Peprotech	AF-315-14
Anti-mouse CD117 APC (clone: 2B8)	ThermoFisher	17-1171-83
Anti-mouse CD117 BV421 (clone: 2B8)	Biolegend	105828
Anti-mouse CD127 APC/Cy7 (clone: A7R34)	Biolegend	135040
Anti-mouse CD127 biotin (clone: A7R34)	Biolegend	135006
Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2)	Biolegend	115914
Anti-mouse CD201 APC (clone: eBio1560)	ThermoFisher	17-2012-82
Anti-mouse CD34 FITC (clone: RAM34)	ThermoFisher	11-0341-85
Anti-mouse CD4 APC/Cy7 (clone: RM4-5)	Biolegend	100526
Anti-mouse CD4 biotin (clone: RM4-5)	Biolegend	100508
Anti-mouse CD45R APC/Cy7 (clone: RA3-6B2)	Biolegend	103224
Anti-mouse CD45R biotin (clone: RA3-6B2)	Biolegend	103204
Anti-mouse CD48 BV421 (clone: HM48-1)	Biolegend	103428
Anti-mouse CD8 biotin (clone: 53-6.7)	Biolegend	100704
Anti-mouse CD8a APC/Cy7 (clone: 53-6.7)	Biolegend	100714
Anti-mouse Ly6G/Ly6C APC/Cy7 (clone: RB6-8C5)	Biolegend	108424
Anti-mouse Ly6G/Ly6C biotin (clone: RB6-8C5)	Biolegend	108404
Anti-mouse Sca1 PE (clone: D7)	Biolegend	108108
Anti-mouse Ter119 APC/Cy7 (clone: TER-119)	Biolegend	116223
Anti-mouse Ter119 biotin (clone: TER-119)	Biolegend	116204
CellBIND plates, 24-well	Corning	3337	negative surface charged
CellBIND plates, 96-well	Corning	3330	negative surface charged
Custom synthetic sgRNA	Synthego, Sigma Aldrich, IDT	Custom order
Fetal bovine serum	Merck Life Science UK Limited	F7524-50ML
Fibronectin Coated plates, 96-well	BD Biosciences	354409
Ham's F-12 Nutrient Mix	Gibco	11765054
Insulin-Transferrin-Selenium-X (100x)	Gibco	51500.056
Phosphate buffered saline	Alfa Aesar	J61196.AP
Polyvinyl alcohol	Sigma Aldrich	P8136
Propidium Iodide	Enzo Life Sciences (UK) Ltd	EXB-0018
Streptavidin APC/Cy7	Biolegend	405208
Türks’ solution	Sigma Aldrich	109277
Virkon	Mettler-Toledo Ltd	95015662