イオントラップ質量分析と多段階フラグメンテーション分析を用いたチベット医学における化合物構造の標準化された同定

要約

ここでは、チベット医学における複雑な天然物製剤(マトリックス)中の微量および微量成分を特定するために適用できる一般的なプロトコルと設計について説明します。

要約

チベットの医薬品は複雑で、未知の化合物を多数含んでいるため、その分子構造に関する詳細な研究が不可欠です。液体クロマトグラフィー-エレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析(LC-ESI-TOF-MS)は、チベット医学の抽出に一般的に使用されます。しかし、スペクトルデータベースを使用した後、多くの予測不可能な未知の化合物が残っています。本稿では、イオントラップ質量分析(IT-MS)を用いてチベット医学の成分を同定するための普遍的な方法を開発しました。この方法には、サンプル調製、MS設定、LCプリラン、メソッド確立、MS取得、多段階MS操作、および手動データ分析のための標準化およびプログラムされたプロトコルが含まれます。チベット医学 Abelmoschus manihot 種子中の2つの代表的な化合物は、典型的な化合物構造の詳細な分析とともに、多段階の断片化を使用して同定されました。さらに、イオンモードの選択、移動相調整、スキャン範囲の最適化、衝突エネルギー制御、衝突モードの切り替え、フラグメンテーション要因、および方法の制限などの側面について説明します。開発された標準化された分析法は普遍的であり、チベット医学の未知の化合物に適用することができます。

概要

伝統的な漢方薬(TCM)における微量成分の定性的分析は、研究の重要なトピックになっています。TCMには化合物の数が多いため、核磁気共鳴分光計(NMR)やX線回折装置(XRD)分析のためにそれらを分離することは困難であり、少量のサンプルしか必要としない質量分析(MS)ベースの方法がますます普及しています。さらに、MSと組み合わせた液体クロマトグラフィー(LC)は、複雑なサンプルの分離の改善と化合物の定性分析のために、近年TCM研究で広く使用されています¹。一般的な方法の1つは、液体クロマトグラフィー-エレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析(LC-ESI-TOF-MS)であり、チベット医学の質的研究で広く使用されています²。この方法では、複雑な成分をLCカラムで濃縮および分離し、MS検出器を使用して付加体イオンの質量電荷比(m/z)を観察します。タンデム MS(MS/MS または MS²)データベースの検索は、現在、四重極飛行時間型 (Q-TOF) MS および Orbitrap MS³ を使用した低分子分析において、信頼性の高い化合物アノテーションを得るための最速のアプローチです。しかしながら、データベースの質の低さと様々な異性体の存在は未知の化合物の同定を妨げる。さらに、MS/MSデータベースによって提供される情報は制限されています^4,5,6,7。他のTCMに広く適用できる一般的なプロトコルを使用して、各TCMの化合物を調査することは重要です。

IT-MSは、リング電極⁸に異なる無線周波数(RF)電圧を印加することにより、広範囲のイオンを捕捉する。IT-MSは、さまざまな時系列で時系列の多段階MSスキャンを実行でき、成分の多段階MS(MS n)フラグメンテーションを提供します(ⁿはプロダクトイオンステージ^の数9)。リニアIT-MSは、シーケンシャルMSⁿ実験に使用できるため、構造同定に最適と考えられています¹⁰。標的イオンは、リニアIT-MS¹で単離および蓄積できます。IT-MSのMSⁿ(n ≥ 3)は、Q-TOF-MSのMS/MSよりも多くのフラグメント情報を提供します。IT-MSは標的イオンとそのフラグメントイオンをロックできないため、異性体¹を含む未知化合物の構造解明のための強力なツールです。MSⁿ技術は、未知のタンパク質、ペプチド、および多糖類の構造解析に広く適用されています^11,12。MSⁿのフラグメントイオンの存在量は、Q-TOF-MSのMS/MSよりも複雑なサンプル中の標的化合物に関するより多くの分子フラグメント情報を提供します。したがって、TCMの構造同定にMSⁿ技術を適用することが不可欠です。

チベット医学は^TCM13の重要な要素であり、これらの薬は主に高原地域で見つかった動物、植物、鉱物に由来します¹⁴。チベット薬のアベルモスカス・マニホット種子(AMS)は、アベルモスカス・マニホット(リン)メディカスの種子です。AMSは、アトピー性皮膚炎、リウマチ、ハンセン病などの症状を治療するために使用される伝統的な漢方薬です。抗菌、抗真菌、抗癌、抗酸化、抗炎症効果を持つカルコンが含まれています¹⁵。本研究では、MS nの手順を改善し、IT-MSとMSⁿを使用してチベット医学AMSの化合物構造を特定するための詳細な方法を開発した。イオンモード、スキャン範囲、衝突モードなどの特定のMSパラメータは、微量化合物の同定における問題を克服するために最適化されました。この研究は、TCMにおける微量化合物の標準化された構造同定を促進することを目的としています。

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プロトコル

1. サンプル調製

1. AMSサンプル1 gを正確に計量し、30 mLの80%メタノールを入れた円錐フラスコに入れます。混合物を超音波浴超音波処理器に移し、25°Cで30分間抽出する。 サンプルを14,000 x g で5分間遠心分離します。
   注:超音波浴超音波処理器の周波数は40KHzです。
2. 注射器と微多孔膜フィルター(0.22 μm、有機のみ)を準備します。上清をろ過して2 mLサンプルボトルに入れます。

2. MS設定

1. 真空ポンプのスイッチをオンにします。アルゴンシリンダーのメインバルブと分圧バルブを開き、圧力を約0.3MPaに調整します。窒素バルブを開きます。
   注意: 実験条件に十分な真空度を確保するために、少なくとも8時間待ちます。分析前に、アルゴンと窒素のガス圧が十分に高いことを確認してください。
2. MS制御ソフトウェアを起動します。ソフトウェアパネルの 加熱SEIソース をクリックし、ヒーター温度(350°C)、シースガス流量(35 arb)、補助ガス流量(15 arb)、スプレー電圧(正モードの場合は3.8 KV、負モードの場合は-2.5 KV)、キャピラリー温度(275 °C)などのMSパラメータを入力します。[ 適用 ]ボタンをクリックして、イオン源をアクティブにします。

3. LCプレラン、メソッド確立、MS取得

1. 移動相Aおよび移動相Bをそれぞれ0.1%ギ酸水溶液および純粋なアセトニトリルを用いて調製する。超音波浴超音波処理器で少なくとも15分間脱気する。溶液をそれぞれAとBの流体通路に接続します(図1A)。メタノール-水(1:9 v / v)溶液を準備し、ポンプとインジェクターの洗浄液ボトルに手で充填します。
   注:超音波浴超音波処理器の周波数は40KHzです。
2. LC-MS制御ソフトウェアを起動します。
   1. ダイレクトコントロールボタンをクリックして、LCコントロールパネルを開きます。ポンプモジュールのパージバルブを反時計回りに開きます(図1B)。
   2. [その他のオプション]ボタンをクリックしてポンプ設定を開き、パージパラメータを5 mLmin⁻¹で3分間設定します。[パージ]ボタンをクリックして、バブルの除去を開始します。続いて、パージバルブを閉じます。
3. プライムシリンジ、洗浄バッファーループ、およびニードル外部洗浄ボタンをクリックして、シリンジをそれぞれ3サイクル、ループを1サイクル、ニードルを1サイクルすすぎます。サンプルボトルをサンプラーに入れます(図1C)。
4. 計測器設定ボタンをクリックして、メソッド編集ウィンドウを開きます。新規ボタンをクリックして、新しいLC-MS装置メソッドを作成します。
5. LC メソッドの合計実行時間を設定します。次に、メソッド編集ウィンドウで圧力限界、総流量、流量勾配、サンプル温度、カラム温度、および準備温度デルタを設定する値を入力します。
   注:移動相のデフォルトの総流量は、クロマトグラフィーカラムがない場合、カラム温度なしで、50%Aおよび50%Bで0.3 mL/minで一定です。サンプル温度と準備温度デルタのデフォルト値は、それぞれ15°Cと0.1°Cです。その他の設定は、使用する液体クロマトグラフィーカラムのタイプによって異なります。
6. MSメソッドの 実験 タイプとして一般MSまたは MSⁿ を選択します。値を入力して、アクイジション時間、極性、質量範囲、迂回値番号、および迂回値期間を設定します。 [保存 ]ボタンをクリックして、インストゥルメントメソッドとして設定を構成します。
   注:クロマトグラフィーカラムなしのデフォルト設定は次のとおりです:取得時間、2分;極性、正または負。質量範囲、100〜1,200;転用値番号、2。値の長さを流用する、1.99分。

4.多段階質量分析の操作

1. シーケンス設定ボタンをクリックして、 シーケンス テーブルを開きます。
   1. 表に、サンプルタイプ、ファイル名、パス、サンプルID、装置メソッド、位置、注入量を入力します。
   2. 保存ボタンをクリックしてシーケンステーブルを記録し、次に[分析の開始]ボタンをクリックして設定を実装し、MS取得を開始します。
      注: デフォルトのサンプルタイプは不明として選択されています。インストゥルメントメソッドは、ステップ3.6で保存したメソッドです。サンプルボトルは、サンプルルーム内の固有の場所に配置されます。たとえば、 RA1 はサンプル ルームの赤い領域の最初の行の最初の場所です。デフォルトの注入量は通常2μLで、これはサンプルの濃度によって異なります。
2. エクスプローラーで生のファイルをダブルクリックして、MSデータをデータ処理ソフトウェアにロードします。ベースピーククロマトグラム(BPI)で、マウスをクリックしてドラッグすることにより、曲線下面積(AUC)が最大になる領域を選択します。対応するMSスペクトルが同じウィンドウに表示されます。
3. 次のMS/MS分析のターゲットイオンを選択します。
   1. メソッド編集ウィンドウを再度開きます。 MSⁿ 設定 表で、ターゲットイオンのm/zを 親質量 列の小数点以下1桁に設定します。
   2. [衝突モード]を選択し、 衝突 エネルギー(CE)値を入力します。MS/MS スキャン範囲を設定します。 [保存 ]ボタンをクリックしてMSメソッドを記録し、シーケンステーブルに新しいファイル名を入力します。 [スタート ]ボタンをクリックして、MS/MSアクイジションを開始します。
      注:MS / MSスキャン範囲は、ターゲット親イオンの40%〜130%でした。衝突誘起解離(CID)モードのデフォルトのCE値は35%です。
4. エクスプローラーでRAWファイルをダブルクリックして、MS / MS RAWファイルをデータ処理ソフトウェアにロードします。
   1. MS/MSスペクトルの中で最も強いフラグメントイオンを特定し、そのm/z値をMSⁿメソッドリストに入力します。MS ⁿ設定テーブルで、衝突モード、CE値、スキャン範囲などのMS³パラメータを設定します。
   2. [保存]ボタンをクリックしてMSメソッドを記録し、シーケンステーブルに新しいファイル名を入力します。[スタート]ボタンをクリックして、MS³の取得を開始します。
5. エクスプローラーでRAWファイルをダブルクリックして、MS³ RAWファイルをデータ処理ソフトウェアにロードします。手順4.4を繰り返して、^MS4 スペクトルを取得します。
6. スペクトルに安定なフラグメントイオンが観察されない場合は、MSⁿ 実験を完了します。

5. 手動MSⁿ データ解析

1. 生のファイルをダブルクリックして、MSからMSⁿまでのすべてのマススペクトルを開きます。イオンと対応するフラグメントイオンの間のm/z差値を手動で計算します。
   注:たとえば、イオン(m / z 617.25)と対応するフラグメントイオン(m / z 571.28)のm / z差値はMS / MSで45.97であり、イオン(m / z 571.28)と対応するフラグメントイオン(m / z 525.38)の間のm / z差値はMS³で45.90であり、イオン(m / z 525.38)と対応するフラグメントイオン(m / z 344.93および273.16)の間のm / z差値は180.45であり、MS⁴ではそれぞれ252.22です。
2. MS⁴ の結果(MSⁿの最後のレベル)に従って「コア」構造を手動で描画します。m/z差値に基づいて官能基または分子セグメントを使用して、元の構造を手動で導き出します。MSⁿの各分子構造に従って分子切断経路を手動で描画します。手動による分子誘導の例は、代表的な結果のセクションで詳しく説明されています。

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結果

セロビオースは、正イオンモードでのMSⁿの実現可能性を検証するためのモデルとして使用されました。図2Aに示すように、セロビオース[C 12 H₂₂O₁₁]+のESI-MS(正イオンモード)は、m/z 365でプロトン化された分子[M + H]⁺を生成しました。m/z 365での[M+H]⁺のプロダクトイオンスキャン(CID-MS/MS)により、m/z 305で2番目のフラグメ...

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ディスカッション

IT-MSとそのMSⁿ技術は、微量TCM化合物の構造を特定するための新しいアプローチを提供します。フラグメントイオンを深く同定できなかったQ-TOF-MSとは異なり、MSⁿ技術を用いたIT-MSは、イオンを単離・蓄積する能力に優れています。この記事では、IT-MSおよびMSⁿ技術を使用してチベット医学の微量化合物を同定する方法について概説します。この方法は、MSNにおけるn値を?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Thermo Scientific	CAS 75-05-8	LC-MS grade
Formic Acid	Knowles	CAS 64-18-6	HPLC grade
Linear ion trap mass spectrometer	Thermo Scientific	LTQ XL
liquid chromatograph	Thermo Scientific	U3000
LTQ Tune	Thermo Scientific	version 2.8.0	MS control software
Methanol	Thermo Scientific	CAS 67-56-1	LC-MS grade
Pure water	Thermo Scientific	CAS 7732-18-5	LC-MS grade
Xcalibur	Thermo Scientific	version 2.0	LC-IT-MS operational software