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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, descriviamo un protocollo generale e un disegno che potrebbe essere applicato per identificare tracce e costituenti minori nelle complesse formulazioni di prodotti naturali (matrici) nella medicina tibetana.

Abstract

Le medicine tibetane sono complesse e contengono numerosi composti sconosciuti, rendendo cruciale la ricerca approfondita sulle loro strutture molecolari. La cromatografia liquida-elettrospray ionizzazione time-of-flight mass spectrometry (LC-ESI-TOF-MS) è comunemente usata per estrarre la medicina tibetana; Tuttavia, molti composti sconosciuti imprevedibili rimangono dopo l'utilizzo del database dello spettro. Il presente articolo ha sviluppato un metodo universale per identificare i componenti della medicina tibetana utilizzando la spettrometria di massa con trappola ionica (IT-MS). Il metodo include protocolli standardizzati e programmati per la preparazione del campione, l'impostazione MS, la preesecuzione LC, la definizione del metodo, l'acquisizione MS, il funzionamento MS a più stadi e l'analisi manuale dei dati. Due composti rappresentativi nella medicina tibetana Abelmoschus manihot semi sono stati identificati utilizzando la frammentazione a più stadi, con un'analisi dettagliata delle strutture composte tipiche. Inoltre, l'articolo discute aspetti quali la selezione della modalità ionica, la regolazione della fase mobile, l'ottimizzazione del raggio di scansione, il controllo dell'energia di collisione, il passaggio alla modalità di collisione, i fattori di frammentazione e le limitazioni del metodo. Il metodo di analisi standardizzato sviluppato è universale e può essere applicato a composti sconosciuti nella medicina tibetana.

Introduzione

L'analisi qualitativa dei componenti in tracce nella medicina tradizionale cinese (MTC) è diventata un argomento cruciale nella ricerca. A causa dell'elevato numero di composti nella MTC, è difficile isolarli per l'analisi dello spettrometro di risonanza magnetica nucleare (NMR) o del diffrattometro a raggi X (XRD), rendendo sempre più popolari i metodi basati sulla spettrometria di massa (MS) che richiedono solo bassi volumi di campione. Inoltre, la cromatografia liquida (LC) accoppiata con la SM è stata ampiamente utilizzata nella ricerca TCM negli ultimi anni per la migliore separazione di campioni complessi e l'analisi qualitativa dei composti chimici1. Un metodo comune è la cromatografia liquida-elettrospray ionizzazione time-of-flight mass spectrometry (LC-ESI-TOF-MS), che è ampiamente utilizzata nella ricerca qualitativa sulla medicina tibetana2. Con questo metodo, i componenti complessi vengono arricchiti e separati in una colonna LC e il rapporto massa-carica (m/z) degli ioni addotti viene osservato utilizzando un rivelatore MS. La ricerca di database MS TANDEM (MS/MS o MS2) è attualmente l'approccio più veloce per annotazioni composte sicure nell'analisi di piccole molecole utilizzando il tempo di volo quadrupolo (Q-TOF) MS e Orbitrap MS3. Tuttavia, la scarsa qualità dei database e la presenza di vari isomeri ostacolano l'identificazione di composti sconosciuti. Inoltre, le informazioni fornite dalla banca dati MS/MS sono limitate 4,5,6,7. È importante studiare i composti chimici in ogni MTC utilizzando un protocollo generale che può essere ampiamente applicato ad altri TCM.

IT-MS cattura un'ampia gamma di ioni applicando diverse tensioni a radiofrequenza (RF) agli elettrodi ad anello8. IT-MS può eseguire scansioni MS a più stadi di serie temporali in diversi ordini cronologici, fornendo la frammentazione MS a più stadi (MS n) degli ingredienti, doven è il numero di stadi ionici del prodotto9. L'IT-MS lineare è considerato il migliore per l'identificazione della struttura in quanto può essere utilizzato per esperimenti sequenziali MSn 10. Gli ioni bersaglio possono essere isolati e accumulati in IT-MS 1 lineare. MS n (n ≥ 3) in IT-MS fornisce più informazioni sui frammenti rispetto a MS/MS in Q-TOF-MS. Poiché IT-MS non può bloccare lo ione bersaglio e i suoi ioni frammento, è un potente strumento per la spiegazione della struttura di composti sconosciuti, inclusi gli isomeri1. La tecnologia MSn è stata ampiamente applicata all'analisi strutturale di proteine, peptidi e polisaccaridi sconosciuti11,12. Il livello di abbondanza di ioni frammento in MSn fornisce maggiori informazioni sui frammenti molecolari su composti mirati in campioni complessi rispetto a MS/MS in Q-TOF-MS. Pertanto, l'applicazione della tecnologia MSn all'identificazione strutturale in MTC è essenziale.

La medicina tibetana è una componente significativa della MTC13 e questi farmaci derivano principalmente da animali, piante e minerali trovati nell'area dell'altopiano14. La medicina tibetana Abelmoschus manihot seeds (AMS) è il seme di Abelmoschus manihot (linn.) medicus. AMS è una medicina tradizionale a base di erbe usata per trattare condizioni come la dermatite atopica, reumatismi e lebbra. Contiene calcone, che possiede effetti antibatterici, antimicotici, antitumorali, antiossidanti e antinfiammatori15. Nel presente studio, le procedure MS n sono state migliorate ed è stato sviluppato un metodo dettagliato per identificare le strutture composte nella medicina tibetana AMS utilizzando IT-MS e MSn. Alcuni parametri MS, tra cui la modalità ionica, l'intervallo di scansione e la modalità di collisione, sono stati ottimizzati per superare i problemi nell'identificazione dei composti in tracce. Questo studio mira a promuovere l'identificazione standardizzata della struttura dei composti in tracce nella MTC.

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Protocollo

1. Preparazione del campione

  1. Pesare accuratamente 1 g del campione AMS e metterlo in un matraccio conico con 30 mL di metanolo all'80%. Trasferire la miscela in un sonicatore a bagno ad ultrasuoni per 30 minuti di estrazione a 25 °C. Centrifugare il campione a 14.000 x g per 5 minuti.
    NOTA: La frequenza del sonicatore del bagno ad ultrasuoni è 40 KHz.
  2. Preparare una siringa per iniezione e un filtro a membrana microporosa (0,22 μm, solo organico). Filtrare il surnatante in un flacone campione da 2 ml.

2. Impostazione MS

  1. Accendere l'interruttore della pompa per vuoto. Aprire la valvola principale del cilindro di argon e la valvola di pressione parziale e regolare la pressione a circa 0,3 MPa. Aprire la valvola dell'azoto.
    NOTA: Attendere almeno 8 h per garantire un grado di vuoto sufficiente per le condizioni sperimentali. Verificare che la pressione del gas di argon e azoto sia sufficientemente elevata prima dell'analisi.
  2. Avviare il software di controllo MS. Fare clic su Heated SEI Source nel pannello software e immettere i parametri MS, tra cui la temperatura del riscaldatore (350 °C), la portata del gas della guaina (35 arb), la portata del gas aux (15 arb), la tensione di spruzzatura (3,8 KV per la modalità positiva, -2,5 KV per la modalità negativa) e la temperatura capillare (275 °C). Fare clic sul pulsante Applica per attivare la sorgente di ioni.

3. Pre-esecuzione LC, definizione del metodo e acquisizione MS

  1. Preparare la fase mobile A e la fase mobile B utilizzando rispettivamente una soluzione acquosa di acido formico allo 0,1% e acetonitrile puro. Degasarli in un sonicatore a ultrasuoni per almeno 15 minuti. Collegare le soluzioni ai passaggi del fluido A e B, rispettivamente (Figura 1A). Preparare una soluzione di metanolo-acqua (1:9 v/v), quindi riempirla a mano nelle bottiglie di liquido di pulizia della pompa e dell'iniettore.
    NOTA: La frequenza del sonicatore del bagno ad ultrasuoni è 40 KHz.
  2. Avviare il software di controllo LC-MS.
    1. Fare clic sul pulsante Controllo diretto per aprire il pannello di controllo LC. Aprire la valvola di spurgo in senso antiorario sul modulo pompa (Figura 1B).
    2. Fare clic sul pulsante Altre opzioni per aprire l'impostazione della pompa e impostare i parametri di spurgo su 5 mLmin−1 per 3 minuti. Fare clic sul pulsante Purge per avviare la rimozione della bolla. Successivamente, chiudere la valvola di spurgo.
  3. Fare clic sui pulsanti Prime Syringe, Wash Buffer Loop e Wash Needle Externally per sciacquare la siringa per tre cicli, l'anello per un ciclo e l'ago per un ciclo, rispettivamente. Posizionare il flacone del campione nel campionatore (Figura 1C).
  4. Fare clic sul pulsante Impostazione strumento per aprire la finestra di modifica del metodo. Fare clic sul pulsante Nuovo per creare un nuovo metodo di strumento LC-MS.
  5. Stabilire un tempo di esecuzione totale per il metodo LC. Quindi, immettere i valori per impostare il limite di pressione, la portata totale, il gradiente di flusso, la temperatura del campione, la temperatura della colonna e il delta della temperatura pronta nella finestra di modifica del metodo.
    NOTA: La portata totale predefinita della fase mobile è costante a 0,3 ml/min con 50% A e 50% B e senza temperatura della colonna in assenza di colonna cromatografica. I valori predefiniti della temperatura del campione e del delta della temperatura pronta sono rispettivamente 15 °C e 0,1 °C. Altre impostazioni dipendono dal tipo di colonna cromatografica liquida utilizzata.
  6. Selezionare il tipo di esperimento MS generale o MS n per il metodo MS. Immettete i valori per configurare il tempo di acquisizione, la polarità, l'intervallo di massa, il numero del valore di deviazione e la durata del valore di deviazione. Fare clic sul pulsante Salva per configurare le impostazioni come metodo dello strumento.
    NOTA: Le impostazioni predefinite senza colonna cromatografica sono le seguenti: tempo di acquisizione, 2 min; polarità, positiva o negativa; gamma di massa, da 100 a 1.200; numero di valore di deviazione, 2; e durata del valore di deviazione, 1,99 min.

4. Funzionamento della spettrometria di massa a più stadi

  1. Fate clic sul pulsante Imposta sequenza (Sequence Setup ) per aprire la tabella delle sequenze.
    1. Nella tabella, immettere le seguenti informazioni: tipo di campione, nome file, percorso, ID campione, metodo dello strumento, posizione e volume di iniezione.
    2. Fare clic sul pulsante Salva per registrare la tabella delle sequenze, quindi fare clic sul pulsante Avvia analisi per implementare le impostazioni e avviare l'acquisizione MS.
      Nota : il tipo di esempio predefinito è selezionato come sconosciuto. Il metodo dello strumento è il metodo salvato al punto 3.6. La bottiglia campione viene collocata nella sua posizione unica nella stanza dei campioni. Ad esempio, RA1 è la prima posizione nella prima riga dell'area rossa nella stanza campione. Il volume di iniezione predefinito è solitamente di 2 μL, che dipende dalla concentrazione del campione.
  2. Fare doppio clic sul file raw in Explorer per caricare i dati MS nel software di elaborazione dati. Nel cromatogramma del picco di base (BPI), selezionare l'area con l'area massima sotto la curva (AUC) facendo clic e trascinando il mouse. Gli spettri MS corrispondenti verranno visualizzati nella stessa finestra.
  3. Selezionare uno ione di destinazione per la successiva analisi MS/MS.
    1. Riaprire la finestra di modifica dei metodi. Nella tabella MSn Setting , impostare m/z dello ione di destinazione su una cifra decimale nella colonna Parent Mass .
    2. Selezionare Modalità collisione e immettere il valore dell'energia di collisione (CE). Impostare l'intervallo di scansione MS/MS. Fare clic sul pulsante Salva per registrare il metodo MS e immettere un nuovo nome di file nella tabella delle sequenze. Fare clic sul pulsante Start per avviare l'acquisizione MS/MS.
      NOTA: l'intervallo di scansione MS/MS era del 40%-130% dello ione genitore mirato. Il valore CE predefinito in modalità di dissociazione indotta da collisione (CID) è 35%.
  4. Fare doppio clic sul file raw in Explorer per caricare il file raw MS/MS nel software di elaborazione dati.
    1. Identificare lo ione frammento più forte nello spettro MS/MS e inserire il suo valore m/z nell'elenco dei metodi MSn. Nella tabella MS n Setting, impostare i parametri MS3, tra cui la modalità di collisione, il valore CE e l'intervallo di scansione.
    2. Fare clic sul pulsante Salva per registrare il metodo MS e immettere un nuovo nome di file nella tabella delle sequenze. Fare clic sul pulsante Start per avviare l'acquisizione MS3 .
  5. Fare doppio clic sul file raw in Explorer per caricare il file raw MS3 nel software di elaborazione dati. Ripetere il passaggio 4.4 per ottenere lo spettro MS4 .
  6. Completare l'esperimento MSn quando non si osservano ioni frammenti stabili nello spettro.

5. Analisi manuale dei dati MSn

  1. Fare doppio clic sui file raw per aprire tutti gli spettri di massa da MS a MSn. Calcolare manualmente i valori di differenza m/z tra lo ione e gli ioni frammento corrispondenti.
    NOTA: Ad esempio, il valore di differenza m/z tra lo ione (m/z 617.25) e gli ioni frammento corrispondenti (m/z 571.28) era 45.97 in MS/MS, il valore di differenza m/z tra lo ione (m/z 571.28) e gli ioni frammento corrispondenti (m/z 525.38) era 45.90 in MS3 e i valori di differenza m/z tra lo ione (m/z 525.38) e gli ioni frammento corrispondenti (m/z 344.93 e 273.16) erano 180,45 e 252,22 in MS4, rispettivamente.
  2. Disegnare manualmente la struttura "core" in base ai risultati MS4 (l'ultimo livello di MSn). Derivare manualmente la struttura originale utilizzando gruppi funzionali o segmenti molecolari basati sul valore di differenza m/z. Disegnare manualmente i percorsi di scissione molecolare in base a ciascuna struttura molecolare in MSn. Esempi di derivazione molecolare manuale sono dettagliati nella sezione dei risultati rappresentativi.

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Risultati

Il cellobiosio è stato utilizzato come modello per verificare la fattibilità di MSn in modalità ionica positiva. Come mostrato nella Figura 2A, l'ESI-MS (modalità ionica positiva) del cellobiosio [C 12 H22O11]+ ha prodotto la molecola protonata [M+H]+ a m/z 365. La scansione ionica del prodotto (CID-MS/MS) di [M+H]+ a m/z 365 ha portato al secondo ione frammento a m/z 305 (Figura 2B), che è stato ulteriormente ...

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Discussione

IT-MS e la sua tecnologia MSn offrono un nuovo approccio per identificare la struttura dei composti TCM in tracce. A differenza di Q-TOF-MS, che non è stato in grado di identificare in profondità gli ioni frammento, IT-MS con tecnologia MSn eccelle grazie alla sua capacità di isolare e accumulare ioni. Questo articolo delinea un metodo per identificare i composti in tracce nella medicina tibetana utilizzando la tecnica IT-MS e MSn . Il metodo utilizza il valore n in MSn per ...

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Divulgazioni

Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato finanziato dallo Xinglin Talent Program della Chengdu University of TCM (n. 030058191), dalla Nature Science Foundation del Sichuan (2022NSFSC1470) e dalla National Natural Science Foundation of China (82204765).

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
AcetonitrileThermo ScientificCAS 75-05-8LC-MS grade
Formic AcidKnowlesCAS 64-18-6HPLC grade
Linear ion trap mass spectrometerThermo ScientificLTQ XL
liquid chromatographThermo ScientificU3000
LTQ TuneThermo Scientificversion 2.8.0MS control software
MethanolThermo ScientificCAS 67-56-1LC-MS grade
Pure waterThermo ScientificCAS 7732-18-5LC-MS grade
XcaliburThermo Scientificversion 2.0LC-IT-MS operational software

Riferimenti

  1. Chen, X. -F., Wu, H. -T., Tan, G. -G., Zhu, Z. -Y., Chai, Y. -F. Liquid chromatography coupled with time-of-flight and ion trap mass spectrometry for qualitative analysis of herbal medicines. Journal of Pharmaceutical Analysis. 1 (4), 235-245 (2011).
  2. Ou, C., et al. Systematically investigating the pharmacological mechanism of Dazhu Hongjingtian in the prevention and treatment of acute mountain sickness by integrating UPLC/Q-TOF-MS/MS analysis and network pharmacology. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 179, 113028(2020).
  3. Kind, T., et al. Identification of small molecules using accurate mass MS/MS search. Mass Spectrometry Reviews. 37 (4), 513-532 (2018).
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  7. Chang, H. -L., et al. Uracil-DNA glycosylase assay by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments. (182), e63089(2022).
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