JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, Tibet tıbbındaki karmaşık doğal ürün formülasyonlarındaki (matrisler) eser miktarları ve küçük bileşenleri tanımlamak için uygulanabilecek genel bir protokol ve tasarımı açıklıyoruz.

Özet

Tibet ilaçları karmaşıktır ve çok sayıda bilinmeyen bileşik içerir, bu da moleküler yapıları hakkında derinlemesine araştırmayı çok önemli kılar. Sıvı kromatografisi-elektrosprey iyonizasyon uçuş süresi kütle spektrometresi (LC-ESI-TOF-MS), Tibet tıbbını çıkarmak için yaygın olarak kullanılır; Bununla birlikte, spektrum veritabanını kullandıktan sonra öngörülemeyen birçok bilinmeyen bileşik kalır. Bu makale, iyon tuzağı kütle spektrometresi (IT-MS) kullanarak Tibet tıbbındaki bileşenleri tanımlamak için evrensel bir yöntem geliştirmiştir. Yöntem, numune hazırlama, MS ayarı, LC ön çalıştırma, yöntem oluşturma, MS edinimi, çok aşamalı MS operasyonu ve manuel veri analizi için standartlaştırılmış ve programlanmış protokolleri içerir. Tibet tıbbı Abelmoschus manihot tohumlarındaki iki temsili bileşik, tipik bileşik yapılarının ayrıntılı bir analizi ile çok aşamalı parçalanma kullanılarak tanımlanmıştır. Buna ek olarak, makalede iyon modu seçimi, mobil faz ayarı, tarama aralığı optimizasyonu, çarpışma enerjisi kontrolü, çarpışma modu geçişi, parçalanma faktörleri ve yöntemin sınırlamaları gibi hususlar tartışılmaktadır. Geliştirilen standartlaştırılmış analiz yöntemi evrenseldir ve Tibet tıbbında bilinmeyen bileşiklere uygulanabilir.

Giriş

Geleneksel Çin tıbbında (TCM) eser bileşenlerin kalitatif analizi, araştırmada çok önemli bir konu haline gelmiştir. TCM'deki çok sayıda bileşik nedeniyle, nükleer manyetik rezonans spektrometresi (NMR) veya X-ışını difraktometresi (XRD) analizi için bunları izole etmek zordur, bu da sadece düşük numune hacimleri gerektiren kütle spektrometresi (MS) tabanlı yöntemleri giderek daha popüler hale getirir. Ek olarak, MS ile birleştirilmiş sıvı kromatografisi (LC), son yıllarda TCM araştırmalarında, karmaşık numunelerin daha iyi ayrılması ve kimyasal bileşiklerin kalitatif analizi için yaygın olarak kullanılmaktadır1. Yaygın bir yöntem, Tibet tıbbı2 ile ilgili nitel araştırmalarda yaygın olarak kullanılan sıvı kromatografisi-elektrosprey iyonizasyon uçuş süresi kütle spektrometrisidir (LC-ESI-TOF-MS). Bu yöntemle, karmaşık bileşenler bir LC sütununda zenginleştirilir ve ayrılır ve bir MS dedektörü kullanılarak addukt iyonlarının kütle-yük oranı (m / z) gözlenir. Tandem MS (MS/MS veya MS2) veritabanlarında arama yapmak, şu anda kuadrupol uçuş süresi (Q-TOF) MS ve Orbitrap MS3 kullanarak küçük molekül analizinde kendinden emin bileşik ek açıklamalar için en hızlı yaklaşımdır. Bununla birlikte, veritabanlarının düşük kalitesi ve çeşitli izomerlerin varlığı, bilinmeyen bileşiklerin tanımlanmasını engellemektedir. Ayrıca MS/MS veri tabanının sağladığı bilgiler 4,5,6,7 ile sınırlıdır. Her TCM'deki kimyasal bileşikleri, diğer TCM'lere yaygın olarak uygulanabilecek genel bir protokol kullanarak araştırmak önemlidir.

IT-MS, halka elektrotlarına farklı radyo frekansı (RF) voltajları uygulayarak çok çeşitli iyonları yakalar8. IT-MS, zaman serisi çok aşamalı MS taramalarını çeşitli kronolojik sıralarda gerçekleştirebilir ve bileşen çok aşamalı MS (MS n) parçalanmasını sağlar, buradan, ürün iyonu aşamalarınınsayısı 9'dur. Doğrusal IT-MS, sıralı MSn deneyleri için kullanılabileceğinden, yapı tanımlaması için en iyisi olarak kabul edilir10. Hedeflenen iyonlar lineer IT-MS1'de izole edilebilir ve biriktirilebilir. IT-MS'deki MS n (n ≥ 3), Q-TOF-MS'deki MS / MS'den daha fazla parça bilgisi sağlar. IT-MS, hedef iyonu ve parça iyonlarını kilitleyemediğinden, izomerler1 de dahil olmak üzere bilinmeyen bileşiklerin yapı aydınlatması için güçlü bir araçtır. MSn teknolojisi, bilinmeyen proteinlerin, peptitlerin ve polisakkaritlerin yapısal analizine yaygın olarak uygulanmaktadır11,12. MSn'deki fragman iyonlarının bolluk seviyesi, karmaşık örneklerde hedeflenen bileşikler hakkında Q-TOF-MS'deki MS / MS'den daha fazla moleküler fragman bilgisi sağlar. Bu nedenle, MSn teknolojisinin TCM'de yapısal tanımlamaya uygulanması esastır.

Tibet tıbbı TCM13'ün önemli bir bileşenidir ve bu ilaçlar öncelikle plato bölgesi14'te bulunan hayvanlardan, bitkilerden ve minerallerden elde edilir. Tibet tıbbı Abelmoschus manihot tohumları (AMS), Abelmoschus manihot (keten.) medicus'un tohumudur. AMS, atopik dermatit, romatizma ve cüzzam gibi durumları tedavi etmek için kullanılan geleneksel bir bitkisel ilaçtır. Antibakteriyel, antifungal, antikanser, antioksidatif ve antienflamatuar etkilere sahip olan kalkon içerir15. Bu çalışmada, MSn prosedürleri geliştirilmiş ve Tibet tıbbı AMS'deki bileşik yapıları IT-MS ve MSn kullanarak tanımlamak için ayrıntılı bir yöntem geliştirilmiştir. İyon modu, tarama aralığı ve çarpışma modu dahil olmak üzere belirli MS parametreleri, eser bileşiklerin tanımlanmasındaki sorunların üstesinden gelmek için optimize edilmiştir. Bu çalışma, TCM'de eser bileşiklerin standartlaştırılmış yapı tanımlamasını teşvik etmeyi amaçlamaktadır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Numune hazırlama

  1. AMS numunesinin 1 gramını doğru bir şekilde tartın ve 30 mL% 80 metanol içeren konik bir şişeye yerleştirin. Karışımı 25 ° C'de 30 dakikalık ekstraksiyon için bir ultrason banyosu sonikatörüne aktarın. Numuneyi 5 dakika boyunca 14.000 x g'de santrifüj edin.
    NOT: Ultrason banyosu sonikatörünün frekansı 40 KHz'dir.
  2. Bir enjeksiyon şırıngası ve mikro gözenekli bir membran filtresi hazırlayın (0,22 μm, yalnızca organik). Süpernatantı 2 mL'lik bir numune şişesine filtreleyin.

2. MS ayarı

  1. Vakum pompasının anahtarını açın. Argon silindirinin ana valfini ve kısmi basınç valfini açın ve basıncı yaklaşık 0,3 MPa'ya ayarlayın. Azot valfini açın.
    NOT: Deney koşulları için yeterli vakum derecesini sağlamak için en az 8 saat bekleyin. Analizden önce argon ve azotun gaz basıncının yeterince yüksek olup olmadığını kontrol edin.
  2. MS kontrol yazılımını başlatın. Yazılım panelinde Isıtmalı SEI Kaynağı'na tıklayın ve ısıtıcı sıcaklığı (350 ° C), kılıf gazı akış hızı (35 arb), aux gazı akış hızı (15 arb), püskürtme voltajı (pozitif mod için 3,8 KV, negatif mod için -2,5 KV) ve kılcal sıcaklık (275 ° C) dahil olmak üzere MS parametrelerini girin. İyon kaynağını etkinleştirmek için Uygula düğmesine tıklayın.

3. LC ön çalıştırma, yöntem oluşturma ve MS edinimi

  1. Mobil faz A ve mobil faz B'yi sırasıyla% 0.1 formik asit sulu çözelti ve saf asetonitril kullanarak hazırlayın. Onları en az 15 dakika boyunca bir ultrason banyosu sonikatöründe gazdan arındırın. Çözeltileri sırasıyla A ve B sıvı geçişlerine bağlayın (Şekil 1A). Bir metanol suyu (1:9 v/v) çözeltisi hazırlayın ve ardından pompanın ve enjektörün temizleme sıvısı şişelerine elle doldurun.
    NOT: Ultrason banyosu sonikatörünün frekansı 40 KHz'dir.
  2. LC-MS kontrol yazılımını başlatın.
    1. LC kontrol panelini açmak için Doğrudan Kontrol düğmesine tıklayın. Boşaltma vanasını pompa modülü üzerinde saat yönünün tersine çevirerek açın (Şekil 1B).
    2. Pompa ayarını açmak için Diğer Seçenek düğmesine tıklayın ve boşaltma parametrelerini 3 dakika boyunca 5 mLmin−1 olarak ayarlayın. Balonun kaldırılmasını başlatmak için Temizle düğmesine tıklayın. Daha sonra, boşaltma vanasını kapatın.
  3. Şırıngayı sırasıyla üç döngü, bir döngü için döngü ve iğneyi bir döngü boyunca durulamak için Prime Şırınga, Yıkama Tampon Döngüsü ve Yıkama İğnesi Harici düğmelerine tıklayın. Numune şişesini numune alma cihazına yerleştirin (Şekil 1C).
  4. Yöntem düzenleme penceresini açmak için Instrument Setup (Cihaz Kurulumu ) düğmesine tıklayın. Yeni bir LC-MS enstrüman yöntemi oluşturmak için Yeni düğmesine tıklayın.
  5. LC yöntemi için toplam çalışma süresi belirleyin. Ardından, yöntem düzenleme penceresinde basınç sınırını, toplam akış hızını, akış gradyanını, numune sıcaklığını, sütun sıcaklığını ve hazır sıcaklık deltasını ayarlamak için değerleri girin.
    NOT: Mobil fazın varsayılan toplam akış hızı, kromatografik bir sütunun yokluğunda kolon sıcaklığı olmadan% 50 A ve% 50 B ile 0,3 mL / dak'da sabittir. Numune sıcaklığının ve hazır sıcaklık deltasının varsayılan değerleri sırasıyla 15 °C ve 0,1 °C'dir. Diğer ayarlar, kullanılan sıvı kromatografisi sütununun türüne bağlıdır.
  6. MS yöntemi için Genel MS veya MSn deneme türünü seçin. Edinme süresini, polariteyi, kütle aralığını, yönlendirme değeri numarasını ve yönlendirme değeri süresini yapılandırmak için değerleri girin. Ayarları bir enstrüman yöntemi olarak yapılandırmak için Kaydet düğmesine tıklayın.
    NOT: Kromatografi sütunu olmayan varsayılan ayarlar aşağıdaki gibidir: edinme süresi, 2 dakika; polarite, pozitif veya negatif; kütle aralığı, 100 ila 1.200; yönlendirme değeri numarası, 2; ve yönlendirme değeri süresi, 1,99 dk.

4. Çok aşamalı kütle spektrometrisinin çalıştırılması

  1. Dizi tablosunu açmak için Sequence Setup (Sıralı Kurulum ) düğmesine tıklayın.
    1. Tabloya şu bilgileri girin: örnek türü, dosya adı, yol, örnek kimliği, enstrüman yöntemi, konum ve enjeksiyon hacmi.
    2. Sıra tablosunu kaydetmek için Kaydet düğmesine tıklayın ve ardından ayarları uygulamak ve MS alımını başlatmak için Analizi Başlat düğmesine tıklayın.
      NOT: Varsayılan örnek türü bilinmeyen olarak seçilir. Enstrüman yöntemi, adım 3.6'da kaydedilen yöntemdir. Numune şişesi, numune odasındaki eşsiz yerine yerleştirilir. Örneğin, RA1 , örnek odadaki kırmızı alanın ilk satırındaki ilk konumdur. Varsayılan enjeksiyon hacmi genellikle numunenin konsantrasyonuna bağlı olarak 2 μL'dir.
  2. MS verilerini veri işleme yazılımına yüklemek için gezgindeki ham dosyaya çift tıklayın. Temel tepe kromatogramında (BPI), fareyi tıklatıp sürükleyerek eğrinin altında maksimum alana (AUC) sahip alanı seçin. İlgili MS spektrumları aynı pencerede görüntülenecektir.
  3. Bir sonraki MS/MS analizi için hedeflenen iyonu seçin.
    1. Yöntem düzenleme penceresini yeniden açın. MSn Ayar tablosunda, hedeflenen iyonun m/z'sini Üst Kütle sütununda bir ondalık basamağa ayarlayın.
    2. Çarpışma modu'nu seçin ve çarpışma enerjisi (CE) değerini girin. MS/MS tarama aralığını ayarlayın. MS yöntemini kaydetmek için Kaydet düğmesine tıklayın ve sıra tablosuna yeni bir dosya adı girin. MS / MS alımını başlatmak için Başlat düğmesine tıklayın.
      NOT: MS/MS tarama aralığı, hedeflenen ana iyonun %40-%130'u arasındaydı. Çarpışma kaynaklı ayrışma (CID) modunda varsayılan CE değeri %35'tir.
  4. MS/MS raw dosyasını veri işleme yazılımına yüklemek için explorer'da ham dosyaya çift tıklayın.
    1. MS/MS spektrumundaki en güçlü parça iyonunu tanımlayın ve m/z değerini MSn yöntem listesine girin. MSn Ayarı tablosunda, çarpışma modu, CE değeri ve tarama aralığı dahil olmak üzere MS3 parametrelerini ayarlayın.
    2. MS yöntemini kaydetmek için Kaydet düğmesine tıklayın ve sıra tablosuna yeni bir dosya adı girin. MS3 alımını başlatmak için Başlat düğmesine tıklayın.
  5. MS3 raw dosyasını veri işleme yazılımına yüklemek için gezginde ham dosyaya çift tıklayın. MS4 spektrumunu elde etmek için adım 4.4'ü yineleyin.
  6. Spektrumda kararlı bir parça iyonu gözlenmediğinde MSn deneyini tamamlayın.

5. Manuel MSn veri analizi

  1. MS'den MSn'ye kadar tüm kütle spektrumlarını açmak için ham dosyalara çift tıklayın. İyon ve karşılık gelen parça iyonları arasındaki m/z fark değerlerini manuel olarak hesaplayın.
    NOT: Örneğin, MS/MS'de iyon (m/z 617.25) ile karşılık gelen parça iyonları (m/z 571.28) arasındaki m/z fark değeri 45.97, MS3'te iyon (m/z 571.28) ile karşılık gelen parça iyonları (m/z 525.38) arasındaki m/z fark değeri 45.90 ve iyon (m/z 525.38) ile karşılık gelen parça iyonları (m/z 344.93 ve 273.16) arasındaki m/z fark değerleri 180.45 ve MS4'te sırasıyla 252.22.
  2. "Çekirdek" yapısını MS4 sonuçlarına göre manuel olarak çizin (MSn'nin son seviyesi). Orijinal yapıyı, m/z fark değerine dayalı fonksiyonel gruplar veya moleküler segmentler kullanarak manuel olarak türetin. MSn'de her moleküler yapıya göre moleküler bölünme yollarını manuel olarak çizin. Manuel moleküler türev örnekleri temsili sonuçlar bölümünde detaylandırılmıştır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Sellobioz, MSn'nin pozitif iyon modunda fizibilitesini doğrulamak için bir model olarak kullanıldı. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, selobiyozun [C 12 H22O11] + ESI-MS (pozitif iyon modu), m / z 365'te protonlanmış molekülü [M + H] + üretti. m/z 365'te [M+H]+ ürün iyonu taraması (CID-MS/MS), M/Z 305'te ikinci fragman iyonu ile sonuçlandı (Şekil 2B), MS3 ve MS4 analizleri kullan?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

IT-MS ve MSn teknolojisi, eser TCM bileşiklerinin yapısını tanımlamak için yeni bir yaklaşım sunmaktadır. Parça iyonlarını derinlemesine tanımlayamayan Q-TOF-MS'in aksine, MSn teknolojisine sahip IT-MS, iyonları izole etme ve biriktirme kabiliyeti nedeniyle üstündür. Bu makalede, Tibet tıbbında IT-MS ve MSn tekniğini kullanarak eser bileşikleri tanımlamak için kullanılan bir yöntem özetlenmektedir. Yöntem, sağlanan parça iyonu bilgisinin miktarını belirlemek...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar rakip finansal çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma, TCM Chengdu Üniversitesi Xinglin Yetenek Programı (No. 030058191), Sichuan Doğa Bilimleri Vakfı (2022NSFSC1470) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82204765) tarafından finanse edildi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
AcetonitrileThermo ScientificCAS 75-05-8LC-MS grade
Formic AcidKnowlesCAS 64-18-6HPLC grade
Linear ion trap mass spectrometerThermo ScientificLTQ XL
liquid chromatographThermo ScientificU3000
LTQ TuneThermo Scientificversion 2.8.0MS control software
MethanolThermo ScientificCAS 67-56-1LC-MS grade
Pure waterThermo ScientificCAS 7732-18-5LC-MS grade
XcaliburThermo Scientificversion 2.0LC-IT-MS operational software

Referanslar

  1. Chen, X. -F., Wu, H. -T., Tan, G. -G., Zhu, Z. -Y., Chai, Y. -F. Liquid chromatography coupled with time-of-flight and ion trap mass spectrometry for qualitative analysis of herbal medicines. Journal of Pharmaceutical Analysis. 1 (4), 235-245 (2011).
  2. Ou, C., et al. Systematically investigating the pharmacological mechanism of Dazhu Hongjingtian in the prevention and treatment of acute mountain sickness by integrating UPLC/Q-TOF-MS/MS analysis and network pharmacology. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 179, 113028(2020).
  3. Kind, T., et al. Identification of small molecules using accurate mass MS/MS search. Mass Spectrometry Reviews. 37 (4), 513-532 (2018).
  4. Phetsanthad, A., Vu, N. Q., Li, L. Multi-faceted mass spectrometric investigation of neuropeptides in Callinectes sapidus. Journal of Visualized Experiments. (183), e63322(2022).
  5. Seetaloo, N., Phillips, J. J. Millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry for the study of alpha-synuclein structural dynamics under physiological conditions. Journal of Visualized Experiments. (184), e64050(2022).
  6. Karas, B. F., et al. Dose uptake of platinum-and ruthenium-based compound exposure in zebrafish by inductively coupled plasma mass spectrometry with broader applications. Journal of Visualized Experiments. (182), e6358(2022).
  7. Chang, H. -L., et al. Uracil-DNA glycosylase assay by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments. (182), e63089(2022).
  8. Wang, S., et al. Structural characterization and identification of major constituents in Jitai tablets by high-performance liquid chromatography/diode-array detection coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry. Molecules. 17 (9), 10470-10493 (2012).
  9. Pang, B., Zhu, Y., Lu, L., Gu, F., Chen, H. The applications and features of liquid chromatography-mass spectrometry in the analysis of traditional Chinese medicine. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2016, 3837270(2016).
  10. Ichou, F., et al. Comparison of the activation time effects and the internal energy distributions for the CID, PQD and HCD excitation modes. Journal of Mass Spectrometry. 49 (6), 498-508 (2014).
  11. Fu, X., et al. Suppression of oligomer formation in glucose dehydration by CO2 and tetrahydrofuran. Green Chemistry. 19 (14), 3334-3343 (2017).
  12. Fu, X., et al. Solvent effects on degradative condensation side reactions of fructose in its initial conversion to 5-Hydroxymethylfurfural. ChemSusChem. 13 (3), 501-512 (2020).
  13. Yang, S., Wang, Z., Zhao, H., Ren, X. Modern research of Tibetan medicine. World Journal of Traditional Chinese Medicine. 5 (2), 131-138 (2019).
  14. Shang, X., et al. Ethno-veterinary survey of medicinal plants in Ruoergai region, Sichuan province, China. Journal of Ethnopharmacology. 142 (2), Sichuan province, China. 390-400 (2012).
  15. Su, J., et al. Chalcone derivatives from Abelmoschus manihot seeds restrain NLRP3 inflammasome assembly by inhibiting ASC oligomerization. Frontiers in Pharmacology. 13, 932198(2022).
  16. Fu, X., et al. Mapping out the reaction network of humin formation at the initial stage of fructose dehydration in water. Green Energy & Environment. , In Press (2022).
  17. Hua, Y., Jenke, D. Increasing the sensitivity of an LC-MS method for screening material extracts for organic extractables via mobile phase optimization. Journal of Chromatographic Science. 50 (3), 213-227 (2012).
  18. Kumar, S., Singh, A., Bajpai, V., Kumar, B. Identification characterization and distribution of monoterpene indole alkaloids in Rauwolfia species by Orbitrap Velos Pro mass spectrometer. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 118, 183-194 (2016).
  19. Bayat, P., Lesage, D., Cole, R. B. Tutorial: Ion activation in tandem mass spectrometry using ultra-high resolution instrumentation. Mass Spectrometry Reviews. 39 (5-6), 680-702 (2020).
  20. Wu, S. -L., et al. Mass spectrometric determination of disulfide linkages in recombinant therapeutic proteins using online LC−MS with electron-transfer dissociation. Analytical Chemistry. 81 (1), 112-122 (2009).
  21. Echterbille, J., Quinton, L., Gilles, N., De Pauw, E. Ion mobility mass spectrometry as a potential tool to assign disulfide bonds arrangements in peptides with multiple disulfide bridges. Analytical Chemistry. 85 (9), 4405-4413 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

JoVE de Bu AySay 193yon tuza k tle spektrometrisiok a amal k tle spektrometrisiMSNTibet t bbTCM

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır