Standardisierte Identifizierung der Substanzstruktur in der tibetischen Medizin mittels Ionenfallen-Massenspektrometrie und mehrstufiger Fragmentierungsanalyse

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein allgemeines Protokoll und Design, das angewendet werden könnte, um Spuren und Nebenbestandteile in den komplexen Naturstoffformulierungen (Matrixen) in der tibetischen Medizin zu identifizieren.

Zusammenfassung

Tibetische Arzneimittel sind komplex und enthalten zahlreiche unbekannte Verbindungen, so dass eine eingehende Erforschung ihrer molekularen Strukturen von entscheidender Bedeutung ist. Die Flüssigchromatographie-Elektrospray-Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie (LC-ESI-TOF-MS) wird häufig zur Extraktion tibetischer Medizin verwendet. Viele unvorhersehbare unbekannte Verbindungen bleiben jedoch nach der Verwendung der Spectrum-Datenbank zurück. In der vorliegenden Arbeit wurde eine universelle Methode zur Identifizierung von Komponenten in der tibetischen Medizin mittels Ionenfallen-Massenspektrometrie (IT-MS) entwickelt. Die Methode umfasst standardisierte und programmierte Protokolle für die Probenvorbereitung, die MS-Einstellung, den LC-Prerun, die Methodenetablierung, die MS-Erfassung, den mehrstufigen MS-Betrieb und die manuelle Datenanalyse. Zwei repräsentative Verbindungen in den Samen der tibetischen Medizin Abelmoschus manihot wurden mittels mehrstufiger Fragmentierung identifiziert, wobei typische Substanzstrukturen detailliert analysiert wurden. Darüber hinaus werden Aspekte wie die Auswahl des Ionenmodus, die mobile Phaseneinstellung, die Optimierung des Scanbereichs, die Kontrolle der Kollisionsenergie, die Umschaltung des Kollisionsmodus, die Fragmentierungsfaktoren und die Grenzen der Methode erörtert. Die entwickelte standardisierte Analysemethode ist universell einsetzbar und kann auf unbekannte Verbindungen in der tibetischen Medizin angewendet werden.

Einleitung

Die qualitative Analyse von Spurenelementen in der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM) ist zu einem entscheidenden Thema in der Forschung geworden. Aufgrund der hohen Anzahl von Verbindungen in der TCM ist es schwierig, sie für die Analyse von Kernspinresonanzspektrometern (NMR) oder Röntgendiffraktometern (XRD) zu isolieren, wodurch massenspektrometrische (MS) basierte Methoden, die nur geringe Probenvolumina erfordern, immer beliebter werden. Darüber hinaus wurde die Flüssigchromatographie (LC) gekoppelt mit MS in den letzten Jahren in der TCM-Forschung zur verbesserten Trennung komplexer Proben und zur qualitativen Analyse chemischer Verbindungen eingesetzt¹. Eine gängige Methode ist die Flüssigchromatographie-Elektrospray-Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie (LC-ESI-TOF-MS), die in der qualitativen Forschung zur tibetischen Medizin weit verbreitet ist². Bei dieser Methode werden komplexe Komponenten in einer LC-Säule angereichert und separiert, und das Masse-zu-Ladungs-Verhältnis (m/z) der Addukt-Ionen wird mit einem MS-Detektor beobachtet. Die Suche in Tandem-MS-DATENBANKEN (MS/MS oder MS²) ist derzeit der schnellste Ansatz für zuverlässige Verbindungsannotationen in der Analyse kleiner Moleküle unter Verwendung von Quadrupol-Flugzeit-MS (Q-TOF) MS und Orbitrap MS³. Die schlechte Qualität der Datenbanken und das Vorhandensein verschiedener Isomere erschweren jedoch die Identifizierung unbekannter Verbindungen. Darüber hinaus sind die von der MS/MS-Datenbank bereitgestellten Informationen begrenzt 4,5,6,7. Es ist wichtig, die chemischen Verbindungen in jeder TCM unter Verwendung eines allgemeinen Protokolls zu untersuchen, das auf andere TCM angewendet werden kann.

IT-MS fängt eine breite Palette von Ionen ein, indem unterschiedliche Hochfrequenzspannungen (HF) an die Ringelektroden⁸ angelegt werden. IT-MS kann mehrstufige MS-Scans in verschiedenen zeitlichen Reihenfolgen in Zeitreihen durchführen und eine mehrstufige MS (MS n)-Fragmentierung der Inhaltsstoffe ermöglichen, wobeiⁿ die Anzahl der Produktionenstufen⁹ ist. Die lineare IT-MS gilt als die beste für die Strukturidentifikation, da sie für sequentielle^{MS-n-Experimente} verwendet werden kann¹⁰. Gezielte Ionen können isoliert und in linearer IT-MS¹ akkumuliert werden. Das MS n (ⁿ ≥ 3) in IT-MS liefert mehr Fragmentinformationen als MS/MS in Q-TOF-MS. Da IT-MS das Zielion und seine Fragmentionen nicht binden kann, ist es ein leistungsfähiges Werkzeug zur Strukturaufklärung unbekannter Verbindungen, einschließlich Isomeren¹. Die^{MSN-Technologie} wird in großem Umfang zur Strukturanalyse unbekannter Proteine, Peptide und Polysaccharide eingesetzt^11,12. Die Häufigkeit von Fragmentionen in MSⁿ liefert mehr molekulare Fragmentinformationen über Zielverbindungen in komplexen Proben als MS/MS in Q-TOF-MS. Daher ist die Anwendung der^{MSN-Technologie} auf die Strukturidentifikation in der TCM unerlässlich.

Die tibetische Medizin ist ein bedeutender Bestandteil der TCM¹³, und diese Arzneimittel werden hauptsächlich aus Tieren, Pflanzen und Mineralien gewonnen, die im Plateaugebiet¹⁴ vorkommen. Die tibetische Medizin Abelmoschus manihot Samen (AMS) ist der Samen von Abelmoschus manihot (linn.) medicus. AMS ist ein traditionelles pflanzliches Arzneimittel, das zur Behandlung von Erkrankungen wie Neurodermitis, Rheuma und Lepra eingesetzt wird. Es enthält Chalkon, das antibakterielle, antimykotische, krebshemmende, antioxidative und entzündungshemmende Wirkungen besitzt¹⁵. In der vorliegenden Arbeit wurden die^{MS-n-Verfahren} verbessert und eine detaillierte Methode zur Identifizierung von Substanzstrukturen in der tibetischen Medizin AMS mittels IT-MS und MSⁿ entwickelt. Bestimmte MS-Parameter, einschließlich des Ionenmodus, der Scanreichweite und des Kollisionsmodus, wurden optimiert, um Probleme bei der Identifizierung von Spurenverbindungen zu überwinden. Ziel dieser Studie ist es, die standardisierte Strukturidentifikation von Spurenstoffen in der TCM zu fördern.

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Protokoll

1. Probenvorbereitung

1. Wiegen Sie 1 g der AMS-Probe genau ab und geben Sie sie in einen Erlenmeyerkolben mit 30 ml 80%igem Methanol. Das Gemisch wird für 30 Minuten bei 25 °C in ein Ultraschallgerät überführt. Zentrifugieren Sie die Probe bei 14.000 x g für 5 Minuten.
   Anmerkungen: Die Frequenz des Ultraschall-Bad-Ultraschallgeräts beträgt 40 KHz.
2. Bereiten Sie eine Injektionsspritze und einen mikroporösen Membranfilter (0,22 μm, nur organisch) vor. Filtern Sie den Überstand in eine 2-ml-Probenflasche.

2. MS-Einstellung

1. Schalten Sie den Schalter der Vakuumpumpe ein. Öffnen Sie das Hauptventil des Argonzylinders und das Partialdruckventil und stellen Sie den Druck auf ca. 0,3 MPa ein. Öffnen Sie das Stickstoffventil.
   Anmerkungen: Warten Sie mindestens 8 Stunden, um ein ausreichendes Vakuum für die Versuchsbedingungen zu gewährleisten. Überprüfen Sie vor der Analyse, ob der Gasdruck von Argon und Stickstoff hoch genug ist.
2. Starten Sie die MS-Steuerungssoftware. Klicken Sie im Software-Panel auf Beheizte SEI-Quelle und geben Sie die MS-Parameter ein, einschließlich der Heizertemperatur (350 °C), der Mantelgasdurchflussrate (35 Arb), der Hilfsgasdurchflussrate (15 Arb), der Sprühspannung (3,8 KV für den positiven Modus, -2,5 KV für den negativen Modus) und der Kapillartemperatur (275 °C). Klicken Sie auf die Schaltfläche Übernehmen , um die Ionenquelle zu aktivieren.

3. LC-Vorlauf, Methodenetablierung und MS-Erwerb

1. Bereiten Sie die mobile Phase A und die mobile Phase B unter Verwendung einer wässrigen 0,1%igen Ameisensäurelösung bzw. reinem Acetonitril vor. Entgasen Sie sie mindestens 15 Minuten lang in einem Ultraschallbad-Ultraschallgerät. Verbinden Sie die Lösungen mit den Flüssigkeitskanälen A bzw. B (Abbildung 1A). Bereiten Sie eine Methanol-Wasser-Lösung (1:9 v/v) vor und füllen Sie sie dann von Hand in die Reinigungsflüssigkeitsflaschen der Pumpe und des Injektors.
   Anmerkungen: Die Frequenz des Ultraschall-Bad-Ultraschallgeräts beträgt 40 KHz.
2. Starten Sie die LC-MS-Steuerungssoftware.
   1. Klicken Sie auf die Schaltfläche Direct Control , um das LC-Bedienfeld zu öffnen. Öffnen Sie das Spülventil gegen den Uhrzeigersinn am Pumpenmodul (Abbildung 1B).
   2. Klicken Sie auf die Schaltfläche Weitere Optionen , um die Pumpeneinstellung zu öffnen, und stellen Sie die Spülparameter für 3 Minuten auf 5 ^mlmin−1 ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Löschen , um die Entfernung der Blase zu starten. Schließen Sie anschließend das Spülventil.
3. Klicken Sie auf die Schaltflächen Spritze anzünden, Pufferschlaufe waschen und Nadel extern waschen, um die Spritze für drei Zyklen, die Schlaufe für einen Zyklus bzw. die Nadel für einen Zyklus zu spülen. Stellen Sie die Probenflasche in den Probenehmer (Abbildung 1C).
4. Klicken Sie auf die Schaltfläche Instrument Setup , um das Fenster zur Methodenbearbeitung zu öffnen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Neu , um eine neue LC-MS-Gerätemethode zu erstellen.
5. Legen Sie eine Gesamtlaufzeit für die LC-Methode fest. Geben Sie als Nächstes Werte ein, um die Druckgrenze, die Gesamtdurchflussrate, den Durchflussgradienten, die Probentemperatur, die Säulentemperatur und das Bereitschaftstemperaturdelta im Methodenbearbeitungsfenster festzulegen.
   HINWEIS: Die standardmäßige Gesamtflussrate der mobilen Phase ist konstant bei 0,3 ml/min mit 50 % A und 50 % B und ohne Säulentemperatur in Abwesenheit einer chromatographischen Säule. Die Standardwerte für die Probentemperatur und das Bereitschaftstemperaturdelta sind 15 °C bzw. 0,1 °C. Andere Einstellungen hängen von der Art der verwendeten Flüssigkeitschromatographiesäule ab.
6. Wählen Sie den Experimenttyp Allgemeines MS oder MSⁿ für die MS-Methode aus. Geben Sie Werte ein, um die Erfassungszeit, die Polarität, den Massenbereich, die Anzahl der Umlenkwerte und die Dauer des Umlenkwerts zu konfigurieren. Klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern , um die Einstellungen als Gerätemethode zu konfigurieren.
   HINWEIS: Die Standardeinstellungen ohne Chromatographiesäule lauten wie folgt: Erfassungszeit, 2 min; Polarität, positiv oder negativ; Massenbereich, 100 bis 1.200; Wert umleiten Nummer, 2; und Umlenkwertdauer, 1.99 min.

4. Betrieb der mehrstufigen Massenspektrometrie

1. Klicken Sie auf die Schaltfläche Sequenz einrichten , um die Sequenztabelle zu öffnen.
   1. Geben Sie in der Tabelle die folgenden Informationen ein: Probentyp, Dateiname, Pfad, Proben-ID, Gerätemethode, Position und Injektionsvolumen.
   2. Klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern , um die Sequenztabelle aufzuzeichnen, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Analyse starten, um die Einstellungen zu implementieren und die MS-Erfassung zu starten .
      HINWEIS: Der Standard-Sample-Typ ist als unbekannt ausgewählt. Die Instrumentenmethode ist die Methode, die in Schritt 3.6 gespeichert wurde. Die Probenflasche wird an ihrem einzigartigen Platz im Probenraum platziert. RA1 ist z. B. die erste Position in der ersten Zeile des roten Bereichs im Probenraum. Das Standard-Injektionsvolumen beträgt in der Regel 2 μl, was von der Konzentration der Probe abhängt.
2. Doppelklicken Sie im Explorer auf die Rohdatei, um die MS-Daten in die Datenverarbeitungssoftware zu laden. Wählen Sie im Basis-Peak-Chromatogramm (BPI) den Bereich mit der maximalen Fläche unter der Kurve (AUC) aus, indem Sie mit der Maus klicken und ziehen. Die entsprechenden MS-Spektren werden im selben Fenster angezeigt.
3. Wählen Sie ein Zielion für die nächste MS/MS-Analyse aus.
   1. Öffnen Sie das Fenster zum Bearbeiten der Methode erneut. Legen Sie in der Tabelle MS n Setting (^{MS-n-Einstellung}) das m/z des Zielions auf eine Dezimalstelle in der Spalte "Übergeordnete Masse" fest.
   2. Wählen Sie Kollisionsmodus und geben Sie den Wert für die Kollisionsenergie (CE) ein. Stellen Sie den MS/MS-Scanbereich ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern , um die MS-Methode aufzuzeichnen, und geben Sie einen neuen Dateinamen in die Sequenztabelle ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start , um die MS/MS-Erfassung zu starten.
      HINWEIS: Der MS/MS-Scanbereich betrug 40 % bis 130 % des Ziel-Elternions. Der Standard-CE-Wert im CID-Modus (Collision Induced Dissociation) beträgt 35 %.
4. Doppelklicken Sie im Explorer auf die RAW-Datei, um die MS/MS-RAW-Datei in die Datenverarbeitungssoftware zu laden.
   1. Identifizieren Sie das stärkste Fragmention im MS/MS-Spektrum und geben Sie seinen m/z-Wert in die MS-n-Methodenliste ein. Stellen Sie in der MS ^{n-Einstellungstabelle} die MS^3-Parameter ein, einschließlich Kollisionsmodus, CE-Wert und Scanbereich.
   2. Klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern , um die MS-Methode aufzuzeichnen, und geben Sie einen neuen Dateinamen in die Sequenztabelle ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start , um die MS^3-Erfassung zu starten.
5. Doppelklicken Sie im Explorer auf die Rohdatei, um die MS^3-Rohdatei in die Datenverarbeitungssoftware zu laden. Wiederholen Sie Schritt 4.4, um das MS^4-Spektrum zu erhalten.
6. Beenden Sie das MS^n-Experiment , wenn keine stabilen Fragmentionen im Spektrum beobachtet werden.

5. Manuelle MS^{n-Datenanalyse}

1. Doppelklicken Sie auf die Rohdateien, um alle Massenspektren von MS bis MSⁿ zu öffnen. Berechnen Sie manuell die m/z-Differenzwerte zwischen dem Ion und den entsprechenden Fragmentionen.
   HINWEIS: Zum Beispiel betrug der m/z-Differenzwert zwischen dem Ion (m/z 617,25) und den entsprechenden Fragmentionen (m/z 571,28) 45,97 in MS/MS, der m/z-Differenzwert zwischen dem Ion (m/z 571,28) und den entsprechenden Fragmentionen (m/z 525,38) betrug 45,90 in MS³ und die m/z-Differenzwerte zwischen dem Ion (m/z 525,38) und den entsprechenden Fragmentionen (m/z 344,93 und 273,16) betrug 180,45 und 252.22 in MS⁴.
2. Zeichnen Sie manuell die "Kern"-Struktur gemäß den Ergebnissen von MS⁴ (der letzten Ebene von MSⁿ). Leiten Sie die ursprüngliche Struktur manuell ab, indem Sie funktionelle Gruppen oder Molekülsegmente basierend auf dem m/z-Differenzwert verwenden. Zeichnen Sie die molekularen Spaltpfade manuell entsprechend jeder Molekülstruktur in MSⁿ. Beispiele für die manuelle molekulare Ableitung sind im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" aufgeführt.

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Ergebnisse

Cellobiose wurde als Modell verwendet, um die Machbarkeit von MSⁿ im positiven Ionenmodus zu überprüfen. Wie in Abbildung 2A gezeigt, erzeugte die ESI-MS (positiver Ionenmodus) der Cellobiose [C 12 H₂₂O₁₁]+ das protonierte Molekül [M+H]⁺ bei m/z 365. Der Produktionenscan (CID-MS/MS) von [M+H]⁺ bei m/z 365 ergab das zweite Fragmention bei m/z 305 (Abbildung 2B), das mit MS³ und MS⁴ Analysen w...

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Diskussion

IT-MS und seine^{MS-n-Technologie} bieten einen neuen Ansatz zur Identifizierung der Struktur von TCM-Spurenverbindungen. Im Gegensatz zu Q-TOF-MS, das die Fragmentionen nicht tief identifizieren konnte, zeichnet sich die IT-MS mit MS^{n-Technologie} durch ihre Fähigkeit aus, Ionen zu isolieren und zu akkumulieren. Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Identifizierung von Spurenstoffen in der tibetischen Medizin mit Hilfe der IT-MS- und^MS-n-Technik . Die Methode verwendet den n-Wert in MS...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Thermo Scientific	CAS 75-05-8	LC-MS grade
Formic Acid	Knowles	CAS 64-18-6	HPLC grade
Linear ion trap mass spectrometer	Thermo Scientific	LTQ XL
liquid chromatograph	Thermo Scientific	U3000
LTQ Tune	Thermo Scientific	version 2.8.0	MS control software
Methanol	Thermo Scientific	CAS 67-56-1	LC-MS grade
Pure water	Thermo Scientific	CAS 7732-18-5	LC-MS grade
Xcalibur	Thermo Scientific	version 2.0	LC-IT-MS operational software