Identificação Padronizada da Estrutura Composta na Medicina Tibetana Usando Espectrometria de Massa com Armadilha de Íons e Análise de Fragmentação em Múltiplos Estágios

Resumo

Aqui, descrevemos um protocolo geral e um projeto que podem ser aplicados para identificar quantidades residuais e constituintes menores nas formulações complexas de produtos naturais (matrizes) na medicina tibetana.

Resumo

Os medicamentos tibetanos são complexos e contêm numerosos compostos desconhecidos, tornando crucial a pesquisa aprofundada sobre suas estruturas moleculares. Cromatografia líquida-espectrometria de massa por tempo de voo por ionização por eletrospray (LC-ESI-TOF-MS) é comumente usada para extrair medicamentos tibetanos; No entanto, muitos compostos desconhecidos imprevisíveis permanecem após o uso do banco de dados Spectrum. O presente artigo desenvolveu um método universal para identificação de componentes na medicina tibetana usando espectrometria de massas com armadilha iônica (IT-MS). O método inclui protocolos padronizados e programados para preparação de amostras, configuração de EM, pré-execução de LC, estabelecimento de métodos, aquisição de EM, operação de EM em múltiplos estágios e análise manual de dados. Dois compostos representativos na medicina tibetana Abelmoschus manihot sementes foram identificados usando fragmentação de múltiplos estágios, com uma análise detalhada de estruturas compostas típicas. Além disso, o artigo discute aspectos como seleção do modo de íon, ajuste de fase móvel, otimização da faixa de varredura, controle de energia de colisão, comutação do modo de colisão, fatores de fragmentação e limitações do método. O método de análise padronizado desenvolvido é universal e pode ser aplicado a compostos desconhecidos na medicina tibetana.

Introdução

A análise qualitativa de componentes traço na medicina tradicional chinesa (MTC) tornou-se um tópico crucial na pesquisa. Devido ao alto número de compostos na MTC, é difícil isolá-los para análise de espectrômetro de ressonância magnética nuclear (RMN) ou difratômetro de raios X (DRX), tornando cada vez mais populares métodos baseados em espectrometria de massa (MS) que requerem apenas baixos volumes de amostras. Adicionalmente, a cromatografia líquida (CL) acoplada à EM tem sido amplamente utilizada na pesquisa em MTC nos últimos anos para a melhor separação de amostras complexas e análise qualitativa de compostos^químicos1. Um método comum é a cromatografia líquida-espectrometria de massas por tempo de voo por ionização por eletrospray (LC-ESI-TOF-MS), que é amplamente utilizada em pesquisas qualitativas em medicina tibetana². Com este método, componentes complexos são enriquecidos e separados em uma coluna LC, e a relação massa-carga (m/z) dos íons adutos é observada usando um detector MS. A busca em bancos de dados tandem MS (MS/MS ou MS²) é atualmente a abordagem mais rápida para anotações de compostos confiáveis em análises de pequenas moléculas usando o tempo de voo quadrupolo (Q-TOF) MS e o Orbitrap MS³. No entanto, a baixa qualidade dos bancos de dados e a presença de vários isômeros dificultam a identificação de compostos desconhecidos. Além disso, as informações fornecidas pelo banco de dados do MS/MS são limitadas 4,5,6,7. É significativo investigar os compostos químicos em cada MTC usando um protocolo geral que pode ser amplamente aplicado a outros MTC.

O IT-MS captura uma ampla gama de íons aplicando diferentes tensões de radiofrequência (RF) aos eletrodos do anel⁸. O IT-MS pode realizar varreduras de MS de vários estágios de séries temporais em diversas ordens cronológicas, fornecendo fragmentação de MS de múltiplos estágios (MS n) de ingredientes, ondeⁿ é o número de estágios de íons do produto⁹. O IT-MS linear é considerado o melhor para identificação de estruturas, pois pode ser utilizado para experimentos sequenciais de MS^{n 10}. Íons alvo podem ser isolados e acumulados em IT-MS^{linear 1}. O MS n (ⁿ ≥ 3) em IT-MS fornece mais informações fragmentadas do que MS/MS em Q-TOF-MS. Uma vez que IT-MS não pode bloquear o íon alvo e seus íons fragmentos, é uma ferramenta poderosa para a elucidação da estrutura de compostos desconhecidos, incluindo isômeros¹. A tecnologia MSⁿ tem sido amplamente aplicada na análise estrutural de proteínas, peptídeos e polissacarídeos desconhecidos^11,12. O nível de abundância de íons fragmentos em MSⁿ fornece mais informações de fragmentos moleculares sobre compostos alvo em amostras complexas do que MS/MS em Q-TOF-MS. Assim, a aplicação da tecnologia MSⁿ na identificação estrutural na MTC é essencial.

A medicina tibetana é um componente significativo da MTC¹³, e esses medicamentos são principalmente derivados de animais, plantas e minerais encontrados na área do planalto¹⁴. O medicamento tibetano Abelmoschus manihot seeds (AMS) é a semente de Abelmoschus manihot (linn.) medicus. AMS é um fitoterápico tradicional usado para tratar condições como dermatite atópica, reumatismo e hanseníase. Contém chalcona, que possui efeitos antibacterianos, antifúngicos, anticancerígenos, antioxidantes e anti-inflamatórios¹⁵. No presente estudo, os procedimentos de MS n foram aprimorados, e um método detalhado foi desenvolvido para identificar estruturas compostas na medicina tibetana AMS usando IT-MS e MSⁿ. Certos parâmetros do MS, incluindo o modo de íons, o alcance de varredura e o modo de colisão, foram otimizados para superar problemas na identificação de compostos traços. Este estudo tem como objetivo promover a identificação padronizada da estrutura de compostos traço na MTC.

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Protocolo

1. Preparação da amostra

1. Pesar com precisão 1 g da amostra de AMS e colocá-la num balão cónico com 30 ml de metanol a 80%. Transfira a mistura para um sonicador de banho de ultrassom por 30 min de extração a 25 °C. Centrifugar a amostra a 14.000 x g por 5 min.
   NOTA: A frequência do sonicador de banho de ultrassom é de 40 KHz.
2. Prepare uma seringa de injeção e um filtro de membrana microporosa (0,22 μm, apenas orgânico). Filtrar o sobrenadante num frasco de amostra de 2 ml.

2. Configuração de EM

1. Ligue o interruptor da bomba de vácuo. Abra a válvula principal do cilindro de argônio e a válvula de pressão parcial e ajuste a pressão para aproximadamente 0,3 MPa. Abra a válvula de nitrogênio.
   NOTA: Aguarde pelo menos 8 h para garantir um grau de vácuo suficiente para as condições experimentais. Verifique se a pressão do gás de argônio e nitrogênio é alta o suficiente antes da análise.
2. Inicie o software de controle MS. Clique em Fonte SEI aquecida no painel do software e insira os parâmetros MS, incluindo a temperatura do aquecedor (350 °C), a taxa de fluxo de gás da bainha (35 arb), a taxa de fluxo de gás auxiliar (15 arb), a tensão de pulverização (3,8 KV para o modo positivo, -2,5 KV para o modo negativo) e a temperatura capilar (275 °C). Clique no botão Aplicar para ativar a fonte de íons.

3. Pré-execução de LC, estabelecimento do método e aquisição de MS

1. Preparar a fase A móvel e a fase B móvel usando solução aquosa de ácido fórmico a 0,1% e acetonitrila pura, respectivamente. Desgaseifique-os em um sonicador de banho de ultrassom por pelo menos 15 min. Conecte as soluções às passagens de fluido A e B, respectivamente (Figura 1A). Prepare uma solução de metanol-água (1:9 v/v) e, em seguida, encha-a nos frascos de fluido de limpeza da bomba e do injetor manualmente.
   NOTA: A frequência do sonicador de banho de ultrassom é de 40 KHz.
2. Inicie o software de controle LC-MS.
   1. Clique no botão Controle direto para abrir o painel de controle LC. Abra a válvula de purga no sentido anti-horário no módulo da bomba (Figura 1B).
   2. Clique no botão Mais opção para abrir a configuração da bomba e defina os parâmetros de purga em 5 mLmin⁻¹ por 3 min. Clique no botão Purge para iniciar a remoção da bolha. Em seguida, feche a válvula de purga.
3. Clique nos botões Seringa Prime, Wash Buffer Loop e Wash Needle Externamente para enxaguar a seringa por três ciclos, o laço por um ciclo e a agulha por um ciclo, respectivamente. Coloque o frasco de amostra no amostrador (Figura 1C).
4. Clique no botão Configuração do instrumento para abrir a janela de edição de método. Clique no botão Novo para criar um novo método de instrumento LC-MS.
5. Estabeleça um tempo de execução total para o método LC. Em seguida, insira valores para definir o limite de pressão, a taxa de fluxo total, o gradiente de fluxo, a temperatura da amostra, a temperatura da coluna e o delta de temperatura pronto na janela de edição do método.
   NOTA: O caudal total predefinido da fase móvel é constante a 0,3 ml/min com 50% A e 50% B e sem temperatura da coluna na ausência de uma coluna cromatográfica. Os valores padrão de temperatura da amostra e delta de temperatura pronta são 15 °C e 0,1 °C, respectivamente. Outras configurações dependem do tipo de coluna de cromatografia líquida utilizada.
6. Selecione o tipo de experimento MS geral ou MS ⁿ para o método MS. Insira valores para configurar o tempo de aquisição, a polaridade, o intervalo de massa, o número do valor de desvio e a duração do valor de desvio. Clique no botão Salvar para definir as configurações como um método de instrumento.
   NOTA: As configurações padrão sem uma coluna de cromatografia são as seguintes: tempo de aquisição, 2 min; polaridade, positiva ou negativa; faixa de massa, 100 a 1.200; número do valor de desvio, 2; e duração do valor de desvio, 1,99 min.

4. Operação de espectrometria de massas de múltiplos estágios

1. Clique no botão Sequence Setup para abrir a tabela de sequência.
   1. Na tabela, insira as seguintes informações: tipo de amostra, nome do arquivo, caminho, ID da amostra, método do instrumento, posição e volume de injeção.
   2. Clique no botão Salvar para gravar a tabela de sequência e, em seguida, clique no botão Iniciar análise para implementar as configurações e iniciar a aquisição de MS.
      Observação : O tipo de exemplo padrão é selecionado como desconhecido. O método do instrumento é o método salvo na etapa 3.6. O frasco de amostra é colocado em seu local exclusivo na sala de amostras. Por exemplo, RA1 é o primeiro local na primeira linha da área vermelha na sala de amostra. O volume de injeção padrão é geralmente de 2 μL, que depende da concentração da amostra.
2. Clique duas vezes no arquivo raw no explorer para carregar os dados do MS no software de processamento de dados. No cromatograma de pico de base (BPI), selecione a área com a área máxima sob a curva (AUC) clicando e arrastando o mouse. Os espectros MS correspondentes serão exibidos na mesma janela.
3. Selecione um íon direcionado para a próxima análise do MS/MS.
   1. Reabra a janela de edição de método. Na tabela MSⁿ Setting , defina o m/z do íon de destino com uma casa decimal na coluna Massa pai .
   2. Selecione Modo de colisão e insira o valor de energia de colisão (CE). Defina o intervalo de varredura do MS/MS. Clique no botão Salvar para registrar o método MS e insira um novo nome de arquivo na tabela de sequência. Clique no botão Iniciar para iniciar a aquisição do MS/MS.
      Observação : O intervalo de varredura MS/MS foi 40%-130% do íon pai de destino. O valor CE padrão no modo de dissociação induzida por colisão (CID) é 35%.
4. Clique duas vezes no arquivo raw no explorer para carregar o arquivo raw do MS/MS no software de processamento de dados.
   1. Identifique o íon de fragmento mais forte no espectro MS/MS e insira seu valor m/z na lista de métodos MSⁿ. Na tabela MS ⁿ Setting, defina os parâmetros do MS³, incluindo modo de colisão, valor CE e intervalo de varredura.
   2. Clique no botão Salvar para registrar o método MS e insira um novo nome de arquivo na tabela de sequência. Clique no botão Iniciar para iniciar a aquisição do MS³ .
5. Clique duas vezes no arquivo raw no explorer para carregar o arquivo raw do MS³ no software de processamento de dados. Repita a etapa 4.4 para obter o espectro MS⁴ .
6. Completar o experimento MSⁿ quando nenhum íon fragmento estável for observado no espectro.

5. Manual MSⁿ análise de dados

1. Clique duas vezes nos arquivos raw para abrir todos os espectros de massa de MS para MSⁿ. Calcule manualmente os valores de diferença m/z entre o íon e os íons de fragmento correspondentes.
   NOTA: Por exemplo, o valor da diferença m/z entre o íon (m/z 617,25) e os íons fragmentos correspondentes (m/z 571,28) foi de 45,97 em MS/MS, o valor da diferença m/z entre o íon (m/z 571,28) e os íons fragmentos correspondentes (m/z 525,38) foi de 45,90 em MS³, e os valores de diferença m/z entre o íon (m/z 525,38) e os íons fragmentos correspondentes (m/z 344,93 e 273,16) foram 180,45 e 252,22 no MS⁴, respectivamente.
2. Desenhe manualmente a estrutura "core" de acordo com os resultados do MS⁴ (o último nível do MSⁿ). Derive manualmente a estrutura original usando grupos funcionais ou segmentos moleculares com base no valor da diferença m/z. Desenhar manualmente os caminhos de clivagem molecular de acordo com cada estrutura molecular em MSⁿ. Exemplos de derivação molecular manual são detalhados na seção de resultados representativos.

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Resultados

A celobiose foi utilizada como modelo para verificar a viabilidade doⁿ MS no modo iônico positivo. Como mostrado na Figura 2A, o ESI-MS (modo iônico positivo) da celobiose [C 12 H₂₂O₁₁]+ produziu a molécula protonada [M+H]⁺ em m/z 365. A varredura de íons do produto (CID-MS/MS) de [M+H]⁺ em m/z 365 resultou no segundo íon fragmento em m/z 305 (Figura 2B), que foi posteriormente analisado usando as análises MS<...

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Discussão

IT-MS e sua tecnologia MSⁿ oferecem uma nova abordagem para identificar a estrutura de compostos TCM traço. Ao contrário do Q-TOF-MS, que não conseguiu identificar profundamente os íons fragmentados, o IT-MS com tecnologia MSⁿ se destaca devido à sua capacidade de isolar e acumular íons. Este artigo descreve um método para identificar compostos traço na medicina tibetana usando a técnica IT-MS e MSⁿ . O método utiliza o valor de n em MSⁿ para determinar a quantidade d...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Thermo Scientific	CAS 75-05-8	LC-MS grade
Formic Acid	Knowles	CAS 64-18-6	HPLC grade
Linear ion trap mass spectrometer	Thermo Scientific	LTQ XL
liquid chromatograph	Thermo Scientific	U3000
LTQ Tune	Thermo Scientific	version 2.8.0	MS control software
Methanol	Thermo Scientific	CAS 67-56-1	LC-MS grade
Pure water	Thermo Scientific	CAS 7732-18-5	LC-MS grade
Xcalibur	Thermo Scientific	version 2.0	LC-IT-MS operational software