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要約

提案されたプロトコルには、細胞培養上清から細胞外小胞を単離する際にエンドトキシンによる汚染を回避する方法と、それらを適切に評価する方法に関するガイドラインが含まれています。

要約

細胞外小胞(EV)は、 in vitro および in vivoで細胞によって放出される膜小胞の不均一な集団です。それらの遍在と生物学的情報のキャリアとしての重要な役割は、それらを興味深い研究対象にし、それらの分離のために信頼できる反復的なプロトコルを必要とします。しかし、彼らの研究に関連する多くの技術的障害(適切な取得など)がまだあるため、それらの可能性を最大限に引き出すことは困難です。この研究は、差動遠心分離に基づいて腫瘍細胞株の培養上清から小型EVを単離するためのプロトコル(MISEV 2018命名法による)を提示します。このプロトコルには、EVの隔離中にエンドトキシンによる汚染を回避する方法と、それらを適切に評価する方法に関するガイドラインが含まれています。EVのエンドトキシン汚染は、その後の実験を著しく妨げたり、真の生物学的効果を覆い隠したりすることさえあります。一方、見落とされたエンドトキシンの存在は、誤った結論につながる可能性があります。単球はエンドトキシン残基に特に敏感な集団を構成するため、単球を含む免疫系の細胞に言及する場合、これは特に重要です。したがって、特に単球、マクロファージ、骨髄由来サプレッサー細胞、樹状細胞などのエンドトキシン感受性細胞を扱う場合は、エンドトキシン汚染についてEVをスクリーニングすることを強くお勧めします。

概要

MISEV 2018命名法によると、細胞外小胞(EV)は、多くの生理学的および病理学的プロセスにおいて重要な役割を果たす細胞分泌膜小胞のさまざまなサブタイプを表す総称です1,2。さらに、EVは、さまざまな疾患の新規バイオマーカー、治療薬、ドラッグデリバリービークルとして有望視されています。しかし、買収に関連する多くの技術的障害がまだあるため、それらの可能性を最大限に引き出すことは困難です3。そのような課題の1つは、多くの場合無視されてきたエンドトキシンフリーEVの分離です。最も一般的なエンドトキシンの1つはリポ多糖(LPS)であり、これはグラム陰性細菌細胞壁の主成分であり、さまざまな細胞による多数の炎症性サイトカインの放出により急性炎症反応を引き起こす可能性があります4,5。LPSは、LPS結合タンパク質に結合し、続いて骨髄系細胞上のCD14/TLR4/MD2複合体との相互作用によって応答を誘導します。この相互作用は、MyD88およびTRIF依存性シグナル伝達経路の活性化をもたらし、それが次に核因子κB(NFkB)を誘発する。NFkBの核への転座は、サイトカイン6の産生を開始する。単球およびマクロファージはLPSに対して非常に感受性が高く、LPSへの曝露は炎症性サイトカインおよびケモカイン(例えば、IL-6、IL-12、CXCL8、およびTNF-α)の放出をもたらす7,8。CD14構造は、同様の親和性を持つ異なるLPS種の結合を可能にし、他のトール様受容体(TLR)(TLR1、2、3、4、6、7、および9)の共受容体として機能します6。単球/マクロファージに対するEVの効果について実施されている研究の数は、依然として増加しています9,10,11。特に単球、その亜集団、および他の免疫細胞の機能を研究する観点から、エンドトキシンの存在、さらにはEVにおけるそれらのマスクされた存在さえも非常に重要です12。エンドトキシンによるEVの見過ごされた汚染は、誤解を招く結論につながり、それらの真の生物学的活性を隠す可能性があります。言い換えれば、単球細胞を扱うには、エンドトキシン汚染がないことに自信が必要です13。エンドトキシンの潜在的な供給源は、水、商業的に入手した培地および血清、培地成分および添加剤、実験用ガラス器具、およびプラスチック製品であり得る5、14、15。

したがって、この研究は、低エンドトキシン含有EVの分離のためのプロトコルを開発することを目的としていました。このプロトコルは、EVからエンドトキシンを除去する代わりに、EVの分離中にエンドトキシン汚染を回避する方法に関する簡単なヒントを提供します。これまで、ナノメディシンで使用される操作されたナノ粒子などからエンドトキシンを除去する方法について多くのプロトコルが提示されてきました。しかし、それらのどれもEVのような生物学的構造には有用ではありません。ナノ粒子の効果的な脱パイロジェン化は、エタノールまたは酢酸のすすぎ、175°Cでの3時間の加熱、γ照射、またはトリトンX-100処理によって行うことができます。ただし、これらの手順はEV16,17の破壊につながります。

提示されたプロトコルは、単球に対するEVの影響に関する以前の研究とは異なり、EV中のエンドトキシン不純物の回避に焦点を当てた先駆的な研究です9。 提案された原則を実験室診療に適用することは、信頼できる研究結果を得るのに役立つ可能性があり、これは、診療所での治療薬としてのEVの潜在的な使用を検討する際に重要になる可能性があります12。

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プロトコル

1.超遠心チューブの準備

  1. 滅菌済みの使い捨てチューブを使用してください。これが不可能な場合は、滅菌パスツールピペットまたは他の使い捨てアプリケーターを使用して洗剤で洗浄した後、超遠心チューブを再利用してください。超遠心チューブは、1種類の遠心分離材料(細胞培養上清/血清/血漿)と種(ヒト/マウスなど)専用にする必要があることを忘れないでください。
  2. 洗剤洗浄後、超遠心チューブを脱イオンされたLPSフリーの水で3回すすぎます。
    注意: 低品質の水は使用しないでください。
  3. 超遠心チューブを乾燥させてから、70%エタノールで満たします。一晩消毒するためにチューブを70%エタノールで残します。エタノールを取り除き、チューブを再度乾燥させます。
  4. チューブとキャップを滅菌パッケージに入れ、しっかりと閉じます。プラズマまたはガス(エチレンオキシド)滅菌方法18、19を使用する。滅菌包装に封入された超遠心チューブは乾燥した場所に保管し、使用期限前に使用してください。
    注意: リン酸緩衝生理食塩水(PBS)およびEVの分離に使用される水のLPSレベルの毎月のモニタリングを実行します。モニタリングには、チューブも含める必要があります(たとえば、超遠心チューブに室温[RT]で一晩保管されている水[洗浄制御]をテストすることによって)。

2. EV枯渇型低エンドトキシンウシ胎児血清(EE-FBS)の調製

  1. 超低エンドトキシンFBS(市販; 材料表を参照;<0.1 EU / mL)を必ず使用してください。
  2. 超低エンドトキシンFBSのボトルを水浴に入れ、56°Cで30分間インキュベートします。この手順は、補体系を無効にするために必要です。
  3. 不活化したFBSを超遠心チューブにピペットで移し、100,000 x g で4°Cで4時間遠心分離します。 上清を滅菌済みの50 mLチューブに集め、キャップの汚染やチューブのリングの濡れを防ぐために、チューブあたり45 mLを超えないようにします。
  4. このようにして調製したEE-FBS血清を-20°Cで保存する。 EE-FBS中のLPSの濃度を確認してください(ステップ6)。LPS濃度は、超遠心前と同じレベルである必要があります。

3. 細胞培養

  1. この研究では、4.5 g / Lグルコース、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、およびゲンタマイシン(50 μL / mL)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)でSW480およびSW620細胞株を、それに応じて10%EE-FBSを添加し、無菌技術を使用して75 cm2培養フラスコで培養しました。フラスコあたり約4.5 x 10 6セルと6.5 x 106セルをSW480とSW620にそれぞれ播種します。
  2. 細胞が完全なコンフルエントに達したら、週に2回(フラスコあたり~10 mL)、上清を収集し(SW480およびSW620の場合はフラスコあたりそれぞれ~13.5 x 10 6および20 x 106細胞)、分割します。細胞の生存率が99%以上であり、細胞が5%CO2雰囲気中で37°Cで培養されていることを確認してください。
  3. 細胞培養液の上清を、適切に標識された15 mLチューブに回収します。採取した上清を500 x g でRTで5分間遠心分離し、細胞残渣を除去します。
  4. 上清を注意深く回収し、破片を吸引しないようにし、ラベル付きチューブに入れ、3,200 x g で4°Cで12分間遠心分離します。
  5. 2番目の遠心分離ステップから上清を滅菌済みの標識された50 mLチューブに収集します。チューブの端を濡らさないでください。上清の量が45mLを超えないこと、およびチューブが垂直に保たれていることを確認してください。
  6. チューブのキャップを滅菌透明フィルムで包み、上清を-80°Cの垂直位置に保管します。
    注: マイコプラズマ属の毎月の制御を実行します。新鮮な培養上清中のLPS汚染(ステップ6)。上清中のエンドトキシン濃度が0.05EU/mLを超える場合は、どの段階で汚染が発生した可能性があるかを確認し、最初から処理をやり直してください。 マイコプラズマ属菌による培養細胞の汚染の場合。が検出された場合、そのような上清からのEVの分離を中止する必要があります。

4. 細胞培養上清からのEVの単離

  1. 0.22 μmのシリンジフィルターと適切な容量のシリンジを準備します。培養上清(90 mL)を入れたチューブを2本用意します。
  2. シリンジに上清を入れ、フィルターをニードルアダプターに取り付けます。フィルター付きの充填シリンジを50 mLチューブの上に置きます。プランジャーフランジを押して、~90mLのろ液を採取します。
  3. ろ液(7 mL)を超遠心チューブにピペットで移し(適切なバランスのために各チューブに同じ容量をピペットで移します)、100,000 x g で4°Cで2時間遠心分離します。
    注:EVペレット化の効率は、EV20の回収を改善するために最適化する必要がある多くの要因(ロータータイプ、そのkファクター、移動経路の長さ、媒体の粘度など)に依存します。
  4. 滅菌パスツールピペットを使用して上清を廃棄します。ろ過された長いピペットチップを使用して残りのペレットを収集し、2つの超遠心チューブにプールします。ろ過されたエンドトキシンフリーのPBSで最大7mLまで満たして、EVをすすぎます。
  5. PBS再懸濁ペレットを100,000 x g で4°Cで2時間遠心分離します。 滅菌パスツールピペットを使用して上清を完全に除去し、200 μLのろ過されたエンドトキシンフリーPBSを両方のチューブに加えて、EVを再懸濁します。EVペレットをそっとピペットでピペットで留めて、すべてのEVを回収します。
  6. EV懸濁液を滅菌済みの1.5 mL試験管に移します(可能であれば、低タンパク質結合チューブを使用してください)。ナノ粒子追跡分析(NTA)およびその他の目的(タンパク質濃度測定など)用の希釈液を調製するために、10 μLのEV懸濁液を保持します。
  7. メーカーの指示に従って、NTAによる測定のために、フィルタリングされたPBS(1:1,000)でEVを希釈します。キャップを滅菌透明フィルムで包んでEVチューブを固定します。EVは-80°Cで保管してください。

5. ウェスタンブロッティングによる特異的マーカーの検出

  1. サンプル中のタンパク質レベルを決定し(例えば、ブラッドフォードアッセイによって)、ローディングバッファーでサンプル(20 μg)を調製します。5 μLのサンプルバッファー(4x)と2 μLのサンプル還元剤(10x)を総容量20 μLに混合して、ローディングバッファーを調製します。 サンプルを70°Cで10分間インキュベートします。
  2. SDS(10%〜14%)でポリアクリルアミドゲルを調製し、20μgのEVを各ウェルにロードします。
  3. ランニングバッファー(トリス30 g、グリシン144 g、1 Lあたり10% SDS)を使用して、150 Vで45分間電気泳動を実行します。
  4. トウビンバッファー(トリス1.51 g、グリシン7.2 g、0.5 Lあたり10%メタノール)を25 Vで1時間使用したトランスファーマシンで、ゲルからポリビニリデンジフルオライド(PVDF)膜へのタンパク質のセミドライ転写を実行します。
  5. TBSTバッファー中の1%ウシ血清アルブミン(BSA)でブロッキングするために、メンブレンをTBSTバッファー(1 mLのトゥイーン、100 mLのトリス緩衝生理食塩水(TBS 10x)/1 L)に入れ、RTのロッカーで1時間インキュベートします。
  6. 希釈(1:1,000)抗体、抗CD91 (クローン#D8O1A)または抗Alix 1(クローン#3A9)を1 %BSAで加え、ロッカー上でメンブレンと4°Cで一晩インキュベートします。抗体を除去し、メンブレンを10 mLの1x TBSTで10分間洗浄します。
  7. メンブレン上の一次抗体に応じて、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合したヤギ抗ウサギまたはヤギ抗マウス(希釈:1:2,000)二次抗体を加え、RTのロッカー上で1時間インキュベートします。 抗体を除去し、メンブレンを10 mLの1x TBSTで10分間洗浄します。
  8. 基質とルミノールを1:1の比率で混合し、1mL溶液を得た。メンブレンに溶液を注ぎます。メンブレンをイメージングシステムの測定チャンバーにすぐに置き、化学発光モジュールを選択して、スクリーン上でタンパク質バンドを視覚化します。

6. リムルスアメーバ細胞溶解物試験(LAL)によるエンドトキシンレベルの測定

  1. メーカーの推奨に従って、エンドトキシンレベルの発色LAL測定を実行します。簡単に説明すると、エンドトキシンとリムルスアメーバ細胞溶解物(LAL)との相互作用に基づく方法を使用してください。この方法の検出限界は0.005 EU/mLです。
    注:LALアッセイは、その制限にもかかわらず、現在、科学または医学で使用されるさまざまな種類の溶液やその他の製品中のエンドトキシン汚染を検出および定量するための標準的な方法です8。このキットの制限要因は、再構成されたアメーバ細胞ライセート溶液の安定性であり、再構成直後に凍結した場合、-20°Cで1週間のみ安定です。
  2. EVやその他のサンプルの10倍希釈と血清の50倍希釈を使用してください。さらなる実験には、EE-FBS、DMEM、PBS、RPMI (<0.005 EU/mL)、LPSフリーの培養上清などの低エンドトキシン試薬のみを使用してください。

7. EVサンプル中の原核生物16S rRNA遺伝子の検出

  1. EVサンプルからDNAを分離します。試薬と分離部位を無菌に保つようにしてください。DNAの濃度と品質を測定します(例えば、分光光度計を使用)。
  2. 前述のようにポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行う21.エチジウムブロマイドまたはSYBRグリーンを含む1.5%アガロースゲルを調製し、PCR産物を紫外線(UV)で可視化します。
  3. サンプルと重量マーカーの電気泳動をTRIS-アセテート-EDTAバッファーで75 Vで45分間実行します。イメージングシステムを使用してDNAバンドを視覚化します。

8. ヒト単球モデルにおける刺激有効LPS濃度の決定

  1. L-グルタミン、グルコース、および2%EE-FBSを添加したRPMI 1640で2 x 106 単球/mLの単球懸濁液を調製します。96ウェル組織培養プレート22のウェルあたり50μLの懸濁液を加える。
  2. 適切な量のLPSまたは培地を添加して、細胞懸濁液の総容量100 μL中に0 pg/mL(対照)、10 pg/mL、50 pg/mL、100 pg/mL、1 ng/mL、および100 ng/mLの最終濃度を得ます。各LPS濃度を3倍にします。
  3. 細胞を37°C、5%CO2で18時間培養した。上清を集める。
  4. 上清を2,000 x gで5分間スピンダウンします。上清を新しいチューブに移します。採取した上清中のTNF 8,23およびIL-10 23濃度をサイトメトリービーズアレイ(CBA)ヒトサイトカインキットを用いて測定し、製造元の手順に従って、フローサイトメーターを用いて測定する。

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結果

このプロトコルの前提条件または必須のステップは、試薬からエンドトキシン汚染の可能性を排除することです。FBS、DMEM、RPMI、PBS、さらには超遠心チューブなど、使用するすべての試薬は、エンドトキシンフリー(<0.005 EU/mL)でなければなりません。エンドトキシン汚染のない体制を維持することは容易ではなく、例えば、細胞培養用の通常/標準血清がその豊富な供給源(0.364 EU/mL; 表1

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ディスカッション

ここ数年、EVを適切に分離する方法がますます重要になり、たとえば、信頼性の高いオミクスおよび機能データを取得するという文脈で、EVのさらなる信頼性の高い分析が可能になりました24。これまでの研究経験から、分離方法の種類だけでなく、この手順中の他の条件も重要かもしれないようです。EV枯渇FBSの使用は、必要性として広く認識されています25,26...

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開示事項

著者らは、この研究は、潜在的な利益相反として構築できる商業的または金銭的関係がない状態で実施されたと宣言しています。

謝辞

この研究は、ポーランド国立科学センター、助成金番号2019/33 / B / NZ5 / 00647によってサポートされました。ヤギェウォ大学医科大学分子医学微生物学部のTomasz Gosiewski教授とAgnieszka Krawczyk教授が、EVの細菌DNAの検出に貴重な支援をしてくださったことに感謝します。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
 Alix (3A9) Mouse mAb Cell Signaling Technology2171
1250ul Filter Universal Pipette Tips, Clear, Polypropylene, Non-PyrogenicGoogLab ScientificGBFT1250-R-NS
BD FACSCanto II Flow CytometrBD Biosciences
CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit IIBD Biosciences551809
CD9 (D8O1A) Rabbit mAbCell Signaling Technology13174
ChemiDoc Imaging SystemBio-Rad Laboratories, Inc. 17001401
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) Corning10-013-CV
ELX800NB, Universal Microplate ReaderBIO-TEK INSTRUMENTS, INC
Fetal Bovine SerumGibco16000044
Fetal Bovine Serum South America Ultra Low Endotoxin Biowest S1860-500
Gentamicin, 50 mg/mL PAN – BiotechP06-13100
Goat anti-Mouse IgG- HRPSanta Cruz Biotechnologysc-2004
Goat anti-Rabbit IgG- HRPSanta Cruz Biotechnologysc-2005
Immun-Blot PVDF MembraneBio-Rad Laboratories, Inc. 1620177
LPS from Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE) Enzo Life Sciences, Inc.ALX-581-009-L002
Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer CellBio-Rad Laboratories, Inc. 1703930
Nanoparticle Tracking Analysis Malvern Instruments Ltd
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) Invitrogen NP0007
NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) InvitrogenNP0004
ParafilmSigma AldrichP7793transparent film
Perfect 100-1000 bp DNA LadderEURxE3141-01 
PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant KitThermo ScientificA39552
PP Oak Ridge Tube with sealing capsThermo Scientific3929, 03613
RPMI 1640RPMI-1640 (Gibco)11875093
SimpliAmp Thermal CyclerApplied BiosystemA24811
Sorvall wX+ ULTRA SERIES Centrifuge with T-1270 rotorThermo Scientific75000100
Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis SystemBio-Rad Laboratories, Inc. 1704401
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent SubstrateThermo Scientific34577
SW480 cell lineAmerican Type Culture Collection(ATCC)
SW480 cell lineAmerican Type Culture Collection (ATCC)
Syringe filter 0.22 umTPP99722
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer CellBio-Rad Laboratories, Inc. 1703940Transfer machine
Transfer pipette, 3.5 mLSARSTEDT86.1171.001

参考文献

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  3. van Niel, G., et al. Challenges and directions in studying cell-cell communication by extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (5), 369-382 (2022).
  4. Ngkelo, A., Meja, K., Yeadon, M., Adcock, I., Kirkham, P. A. LPS induced inflammatory responses in human peripheral blood mononuclear cells is mediated through NOX4 and Giα dependent PI-3 kinase signalling. Journal of Inflammation. 9 (1), (2012).
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