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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Le protocole proposé comprend des lignes directrices sur la façon d’éviter la contamination par l’endotoxine lors de l’isolement des vésicules extracellulaires à partir de surnageants de culture cellulaire, et sur la façon de les évaluer correctement.

Résumé

Les vésicules extracellulaires (VE) sont une population hétérogène de vésicules membranaires libérées par les cellules in vitro et in vivo. Leur omniprésence et leur rôle important en tant que porteurs d’informations biologiques en font des objets d’étude intrigants, nécessitant des protocoles fiables et répétitifs pour leur isolement. Cependant, il est difficile de réaliser leur plein potentiel car il existe encore de nombreux obstacles techniques liés à leur recherche (comme une acquisition appropriée). Cette étude présente un protocole pour l’isolement de petits VE (selon la nomenclature MISEV 2018) à partir du surnageant de culture de lignées cellulaires tumorales basé sur la centrifugation différentielle. Le protocole comprend des lignes directrices sur la façon d’éviter la contamination par des endotoxines pendant l’isolement des VE et sur la façon de les évaluer correctement. La contamination par les endotoxines des véhicules électriques peut entraver considérablement les expériences ultérieures ou même masquer leurs véritables effets biologiques. D’autre part, la présence négligée d’endotoxines peut conduire à des conclusions incorrectes. Ceci est particulièrement important lorsqu’il s’agit de cellules du système immunitaire, y compris les monocytes, car les monocytes constituent une population particulièrement sensible aux résidus d’endotoxines. Par conséquent, il est fortement recommandé de dépister la contamination par les endotoxines des VE, en particulier lorsque vous travaillez avec des cellules sensibles aux endotoxines telles que les monocytes, les macrophages, les cellules suppressives dérivées de myéloïdes ou les cellules dendritiques.

Introduction

Les vésicules extracellulaires (VE), selon la nomenclature MISEV 2018, sont un terme collectif décrivant divers sous-types de vésicules membraneuses sécrétées par des cellules qui jouent un rôle crucial dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques 1,2. De plus, les véhicules électriques sont prometteurs en tant que nouveaux biomarqueurs pour diverses maladies, ainsi qu’en tant qu’agents thérapeutiques et véhicules d’administration de médicaments. Cependant, la réalisation de leur plein potentiel est difficile car il existe encore de nombreux obstacles techniques liés à leur acquisition3. L’un de ces défis est l’isolement des véhicules électriques exempts d’endotoxines, qui a été négligé dans de nombreux cas. L’une des endotoxines les plus courantes est le lipopolysaccharide (LPS), qui est un composant majeur des parois cellulaires bactériennes à Gram négatif et peut provoquer une réponse inflammatoire aiguë, en raison de la libération d’un grand nombre de cytokines inflammatoires par diverses cellules 4,5. Le LPS induit une réponse en se liant à la protéine de liaison LPS, suivie d’une interaction avec le complexe CD14/TLR4/MD2 sur les cellules myéloïdes. Cette interaction conduit à l’activation des voies de signalisation dépendantes de MyD88 et TRIF, qui à son tour déclenche le facteur nucléaire kappa B (NFkB). La translocation de NFkB vers le noyau initie la production de cytokines6. Les monocytes et les macrophages sont très sensibles au LPS, et leur exposition au LPS entraîne la libération de cytokines et de chimiokines inflammatoires (p. ex. IL-6, IL-12, CXCL8 et TNF-α)7,8. La structure CD14 permet la liaison de différentes espèces de LPS ayant une affinité similaire et sert de corécepteur pour d’autres récepteurs de type Toll (TLR) (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 et 9)6. Le nombre d’études menées sur les effets des VE sur les monocytes/macrophages continue d’augmenter 9,10,11. Surtout du point de vue de l’étude des fonctions des monocytes, de leurs sous-populations et d’autres cellules immunitaires, la présence d’endotoxines et même leur présence masquée dans les VE est d’une grande importance12. La contamination négligée des VE par des endotoxines peut conduire à des conclusions trompeuses et cacher leur véritable activité biologique. En d’autres termes, travailler avec des cellules monocytaires nécessite de faire confiance à l’absence de contamination par les endotoxines13. Les sources potentielles d’endotoxines peuvent être l’eau, les milieux et sérums obtenus commercialement, les composants et additifs de médias, la verrerie de laboratoire et la vaisselle en plastique 5,14,15.

Par conséquent, cette étude visait à développer un protocole pour l’isolement des VE à faible teneur en endotoxines. Le protocole fournit des conseils simples sur la façon d’éviter la contamination par les endotoxines pendant l’isolement des VE au lieu d’éliminer les endotoxines des VE. Auparavant, de nombreux protocoles ont été présentés sur la façon d’éliminer les endotoxines, par exemple des nanoparticules modifiées utilisées en nanomédecine; cependant, aucun d’entre eux n’est utile pour les structures biologiques telles que les véhicules électriques. La dépyrogénation efficace des nanoparticules peut être réalisée par rinçage à l’éthanol ou à l’acide acétique, chauffage à 175 °C pendant 3 h, irradiation γ ou traitement au triton X-100; cependant, ces procédures conduisent à la destruction des VE16,17.

Le protocole présenté est une étude pionnière axée sur l’évitement des impuretés endotoxines dans les VE, contrairement aux études précédentes sur l’effet des VE sur les monocytes9. L’application des principes proposés à la pratique de laboratoire peut aider à obtenir des résultats de recherche fiables, ce qui peut être crucial lors de l’examen de l’utilisation potentielle des VE comme agents thérapeutiques en clinique12.

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Protocole

1. Préparation des tubes à ultracentrifugation

  1. Utilisez des tubes stériles à usage unique. Si cela n’est pas possible, réutilisez les tubes à ultracentrifugation après les avoir lavés avec un détergent à l’aide d’une pipette Pasteur stérile ou d’autres applicateurs à usage unique. Rappelez-vous que les tubes à ultracentrifugation doivent être dédiés à un type de matériau centrifugé (surnageant de culture cellulaire / sérum / plasma) et à une espèce (homme / souris / etc.).
  2. Après un lavage au détergent, rincer les tubes à ultracentrifugation avec de l’eau désionisée sans LPS 3x.
    REMARQUE : N’utilisez pas d’eau de mauvaise qualité.
  3. Sécher les tubes à ultracentrifugation, puis les remplir d’éthanol à 70%. Laissez les tubes avec de l’éthanol à 70 % pour une désinfection pendant la nuit. Retirez l’éthanol et séchez à nouveau les tubes.
  4. Placez les tubes et les bouchons dans un emballage de stérilisation et fermez-les hermétiquement. Utiliser la méthode de stérilisation au plasma ou au gaz (oxyde d’éthylène)18,19. Conservez les tubes à ultracentrifugeuses enfermés dans l’emballage de stérilisation dans un endroit sec et utilisez-les avant la date de péremption.
    REMARQUE : Effectuer une surveillance mensuelle du niveau de LPS dans la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et de l’eau utilisée pour l’isolement des VE. La surveillance devrait également inclure les tubes (p. ex., en testant l’eau [contrôle du lavage] qui a été stockée dans les tubes à ultracentrifugeuses pendant la nuit à température ambiante [RT]).

2. Préparation de sérum fœtal bovin à faible teneur en endotoxines appauvri en EV (EE-FBS)

  1. S’assurer d’utiliser le FBS à très faible teneur en endotoxines (disponible dans le commerce; voir le tableau des matériaux; <0,1 UE/mL).
  2. Placer un flacon d’endotoxine FBS ultra-faible dans un bain-marie et incuber à 56 °C pendant 30 min. Cette étape est nécessaire pour désactiver le système de complément.
  3. Pipeter le FBS inactivé dans les tubes à ultracentrifugeuses et le centrifuger à 100 000 x g pendant 4 h à 4 °C. Recueillir le surnageant dans des tubes stériles de 50 mL, en veillant à ne pas dépasser 45 mL par tube pour éviter la contamination du bouchon et le mouillage de l’anneau du tube.
  4. Conserver le sérum EE-FBS ainsi préparé à -20 °C. Vérifiez la concentration de LPS dans EE-FBS (étape 6). La concentration de LPS doit être au même niveau qu’avant l’ultracentrifugation.

3. Culture cellulaire

  1. Pour cette étude, culture de lignées cellulaires SW480 et SW620 dans le milieu Eagle’s de Dulbecco modifié (DMEM) avec 4,5 g/L de glucose, de L-glutamine, de pyruvate de sodium et de gentamicine (50 μL/mL) complétées avec 10 % d’EE-FBS en conséquence dans des flacons de culture de 75 cm2 en utilisant une technique aseptique. Ensemencer près de 4,5 x 10 6 cellules et 6,5 x 106 cellules par fiole pour SW480 et SW620, respectivement.
  2. Prélever les surnageants deux fois par semaine (~10 mL par fiole) lorsque les cellules atteignent leur pleine confluence (~13,5 x 10 6 et 20 x 106 cellules par fiole pour SW480 et SW620, respectivement) et les diviser. S’assurer que la viabilité des cellules n’est pas inférieure à 99 % et que les cellules sont cultivées à 37 °C dans une atmosphère de CO2 à 5 %.
  3. Recueillir les surnageants de la culture cellulaire dans des tubes de 15 ml étiquetés de manière appropriée. Centrifuger les surnageants collectés à 500 x g pendant 5 min à TA pour éliminer les débris cellulaires.
  4. Recueillir soigneusement les surnageants, éviter d’aspirer les débris, placer dans des tubes étiquetés et centrifuger à nouveau à 3 200 x g pendant 12 min à 4 °C.
  5. Recueillir les surnageants de la deuxième étape de centrifugation dans des tubes stériles étiquetés de 50 mL. Évitez de mouiller les bords des tubes. S’assurer que le volume de surnageant ne dépasse pas 45 mL et que les tubes sont maintenus verticalement.
  6. Envelopper le capuchon du tube avec un film transparent stérile et conserver les surnageants en position verticale à -80 °C.
    REMARQUE: Effectuer un contrôle mensuel de Mycoplasma spp. et la contamination par le LPS dans les surnageants de culture fraîche (étape 6). Si le niveau d’endotoxine dans les surnageants dépasse 0,05 EU/mL, vérifier à quel stade la contamination a pu se produire et recommencer le processus depuis le début. Si la contamination de la culture cellulaire par Mycoplasma spp. est détecté, l’isolement des VE de ces surnageants doit être interrompu.

4. Isolement des VE à partir de surnageants de culture cellulaire

  1. Préparer des filtres à seringues de 0,22 μm et des seringues de volume approprié. Préparer deux tubes avec des surnageants de culture (90 mL).
  2. Remplissez la seringue avec le surnageant et fixez le filtre à l’adaptateur d’aiguille. Placez la seringue remplie avec le filtre sur un tube de 50 mL. Poussez sur la bride du piston et recueillez ~90 ml de filtrat.
  3. Pipeter le filtrat (7 mL) dans les tubes à ultracentrifugation (en veillant à ce que le même volume soit pipeté à chaque tube pour un bon équilibre) et centrifuger à 100 000 x g pendant 2 h à 4 °C.
    REMARQUE: L’efficacité de l’enrobage des VE dépend de nombreux facteurs (par exemple, le type de rotor, son facteur k, la longueur du chemin de migration, la viscosité du fluide, etc.), qui doivent être optimisés pour une meilleure récupération des VE20.
  4. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette Pasteur stérile. Recueillir les granulés restants à l’aide de longues pointes de pipettes filtrées et les regrouper dans deux tubes à ultracentrifugeuses. Remplissez-les jusqu’à 7 ml de PBS filtré sans endotoxines pour rincer les VE.
  5. Centrifuger les pastilles remises en suspension par PBS à 100 000 x g pendant 2 h à 4 °C. Retirez complètement le surnageant à l’aide d’une pipette Pasteur stérile et ajoutez 200 μL de PBS filtré et exempt d’endotoxines aux deux tubes pour remettre les VE en suspension. Pipeter doucement les granulés de VE pour recueillir tous les VE.
  6. Transférer la suspension de VE dans un tube à essai stérile de 1,5 mL (si possible, utiliser un tube de liaison à faible teneur en protéines). Conserver 10 μL de la suspension EV pour préparer une dilution pour l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA) et à d’autres fins (p. ex. mesure de la concentration en protéines).
  7. Diluer les véhicules électriques avec du PBS filtré (1:1 000) pour les mesures par NTA, conformément aux instructions du fabricant. Fixez les tubes EV en enveloppant le bouchon avec un film transparent stérile. Entreposer les véhicules électriques à -80 °C.

5. Détection de marqueurs spécifiques par Western blot

  1. Déterminer le niveau de protéines dans les échantillons (p. ex., par le test de Bradford) et préparer les échantillons (20 μg) avec un tampon de charge. Préparer le tampon de chargement en mélangeant 5 μL de tampon échantillon (4x) et 2 μL d’agent réducteur d’échantillon (10x) jusqu’à un volume total de 20 μL. Incuber les échantillons à 70 °C pendant 10 min.
  2. Préparez des gels de polyacrylamide avec des FDS (10%-14%) et chargez les 20 μg de VE dans chaque puits.
  3. Faire fonctionner l’électrophorèse avec un tampon courant (30 g de Tris, 144 g de glycine, 10% de SDS pour 1 L) pendant 45 min à 150 V.
  4. Effectuer un transfert semi-sec des protéines du gel sur la membrane de difluorure de polyvinylidène (PVDF) dans une machine de transfert avec tampon Towbin (1,51 g de Tris, 7,2 g de glycine, 10% de méthanol par 0,5 L) à 25 V pendant 1 h.
  5. Placer la membrane dans un tampon TBST (1 mL de Tween, 100 mL de solution saline tamponnée Tris (TBS 10x) par 1 L) pour bloquer avec 1% d’albumine sérique bovine (BSA) dans le tampon TBST, et incuber pendant 1 h sur la bascule à TA.
  6. Ajouter des anticorps dilués (1:1 000), anti-CD9 1 (clone#D8O1A) ou anti-Alix 1 (clone#3A9), dans1% BSA et incuber avec la membrane pendant une nuit à 4 °C sur la bascule. Retirer les anticorps et laver la membrane 3x avec 10 mL de 1x TBST pendant 10 minutes.
  7. Ajouter un anticorps secondaire anti-lapin ou chèvre anti-souris (dilution : 1:2 000) conjugué à la peroxydase de raifort, selon l’anticorps primaire sur la membrane, et incuber pendant 1 h sur la bascule à TA. Retirer les anticorps et laver la membrane 3x avec 10 ml de 1x TBST pendant 10 minutes.
  8. Mélanger le substrat et le luminol dans un rapport de 1:1 pour obtenir une solution de 1 mL. Versez la solution sur la membrane. Placez immédiatement la membrane dans la chambre de mesure du système d’imagerie, choisissez le module de chimiluminescence et visualisez les bandes de protéines sur l’écran.

6. Mesure du niveau d’endotoxines par test de lysat d’amébocyte Limulus (LAL)

  1. Effectuer une mesure LAL chromogène du niveau d’endotoxine, conformément aux recommandations du fabricant. En bref, utilisez la méthode basée sur l’interaction de l’endotoxine avec le lysat d’amébocyte de limulus (LAL). La limite de détection de cette méthode est de 0,005 EU/mL.
    NOTE: Le test LAL, malgré ses limites, reste actuellement la méthode standard pour détecter et quantifier la contamination par les endotoxines dans différents types de solutions et d’autres produits utilisés en science ou en médecine8. Le facteur limitant de ce kit est la stabilité de la solution de lysat d’amébocyte reconstituée, qui n’est stable que pendant 1 semaine à -20 °C si elle est congelée immédiatement après reconstitution.
  2. Utiliser une dilution décuplée des VE et autres échantillons et une dilution de 50 fois du sérum. Pour d’autres expériences, utilisez uniquement des réactifs à faible teneur en endotoxines tels que EE-FBS, DMEM, PBS, RPMI (<0,005 EU/mL) et des surnageants de culture sans LPS.

7. Détection du gène de l’ARNr procaryote 16S dans les échantillons EV

  1. Isolez l’ADN des échantillons de VE. Essayez de garder les réactifs et le site d’isolement aseptiques. Mesurer la concentration et la qualité de l’ADN (p. ex., à l’aide d’un spectrophotomètre).
  2. Effectuer une réaction en chaîne par polymérase (PCR), comme décrit précédemment21. Préparer du gel d’agarose à 1,5% avec du bromure d’éthidium ou du vert SYBR pour visualiser les produits de PCR en lumière ultraviolette (UV).
  3. Exécutez l’électrophorèse de l’échantillon et du marqueur de poids avec un tampon TRIS-acétate-EDTA à 75 V pendant 45 min. Visualisez les bandes d’ADN à l’aide du système d’imagerie.

8. Détermination de la concentration efficace de LPS pour la stimulation dans un modèle monocytaire humain

  1. Préparer 2 x 106 monocytes/mL de suspension monocytaire dans RPMI 1640 supplémentée en L-glutamine, glucose et 2% EE-FBS. Ajouter 50 μL de la suspension par puits d’une plaque de culture tissulaire de 96 puits22.
  2. Ajouter un volume approprié de LPS ou de milieu de culture pour obtenir les concentrations finales suivantes : 0 pg/mL (témoin), 10 pg/mL, 50 pg/mL, 100 pg/mL, 1 ng/mL et 100 ng/mL, dans 100 μL de volume total de suspension cellulaire. Faire des triples de chaque concentration de LPS.
  3. Culture des cellules pendant 18 h à 37 °C, 5% CO2. Récupérez le surnageant.
  4. Faire tourner le surnageant à 2 000 x g pendant 5 min. Transférer les surnageants dans de nouveaux tubes. Mesurer la concentration de TNF8,23 et IL-1023 dans les surnageants collectés avec le kit de cytokines humaines à réseau de billes cytométriques (CBA), selon la procédure du fabricant, avec un cytomètre en flux.

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Résultats

Une étape préalable ou obligatoire pour ce protocole est l’exclusion d’une éventuelle contamination par les endotoxines par les réactifs. Tous les réactifs utilisés, tels que les tubes FBS, DMEM, RPMI, PBS et même les tubes à ultracentrifugeuses, doivent être exempts d’endotoxines (<0,005 EU/mL). Il n’est pas facile de maintenir le régime d’absence de contamination par les endotoxines car, par exemple, le sérum régulier/standard pour la culture cellulaire peut être sa riche source (0,364 EU/ml ; vo...

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Discussion

Au cours des dernières années, les méthodes d’isolation correcte des véhicules électriques sont devenues de plus en plus importantes, permettant leurs analyses plus fiables, par exemple dans le contexte de l’obtention de données omiques et fonctionnelles fiables24. Sur la base de l’expérience de recherche antérieure, il semble que non seulement le type de méthode d’isolement, mais aussi d’autres conditions au cours de cette procédure peuvent être importants. L’utilisation de...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être construite comme un conflit d’intérêts potentiel.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le Centre national des sciences, Pologne, numéro de subvention 2019/33/B/NZ5/00647. Nous tenons à remercier le professeur Tomasz Gosiewski et Agnieszka Krawczyk du département de microbiologie médicale moléculaire du Collège médical de l’Université Jagellonne pour leur aide inestimable dans la détection de l’ADN bactérien dans les véhicules électriques.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
 Alix (3A9) Mouse mAb Cell Signaling Technology2171
1250ul Filter Universal Pipette Tips, Clear, Polypropylene, Non-PyrogenicGoogLab ScientificGBFT1250-R-NS
BD FACSCanto II Flow CytometrBD Biosciences
CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit IIBD Biosciences551809
CD9 (D8O1A) Rabbit mAbCell Signaling Technology13174
ChemiDoc Imaging SystemBio-Rad Laboratories, Inc. 17001401
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) Corning10-013-CV
ELX800NB, Universal Microplate ReaderBIO-TEK INSTRUMENTS, INC
Fetal Bovine SerumGibco16000044
Fetal Bovine Serum South America Ultra Low Endotoxin Biowest S1860-500
Gentamicin, 50 mg/mL PAN – BiotechP06-13100
Goat anti-Mouse IgG- HRPSanta Cruz Biotechnologysc-2004
Goat anti-Rabbit IgG- HRPSanta Cruz Biotechnologysc-2005
Immun-Blot PVDF MembraneBio-Rad Laboratories, Inc. 1620177
LPS from Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE) Enzo Life Sciences, Inc.ALX-581-009-L002
Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer CellBio-Rad Laboratories, Inc. 1703930
Nanoparticle Tracking Analysis Malvern Instruments Ltd
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) Invitrogen NP0007
NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) InvitrogenNP0004
ParafilmSigma AldrichP7793transparent film
Perfect 100-1000 bp DNA LadderEURxE3141-01 
PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant KitThermo ScientificA39552
PP Oak Ridge Tube with sealing capsThermo Scientific3929, 03613
RPMI 1640RPMI-1640 (Gibco)11875093
SimpliAmp Thermal CyclerApplied BiosystemA24811
Sorvall wX+ ULTRA SERIES Centrifuge with T-1270 rotorThermo Scientific75000100
Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis SystemBio-Rad Laboratories, Inc. 1704401
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent SubstrateThermo Scientific34577
SW480 cell lineAmerican Type Culture Collection(ATCC)
SW480 cell lineAmerican Type Culture Collection (ATCC)
Syringe filter 0.22 umTPP99722
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer CellBio-Rad Laboratories, Inc. 1703940Transfer machine
Transfer pipette, 3.5 mLSARSTEDT86.1171.001

Références

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Réimpressions et Autorisations

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