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Resumo

O protocolo proposto inclui diretrizes sobre como evitar a contaminação com endotoxina durante o isolamento de vesículas extracelulares de sobrenadantes de cultura celular e como avaliá-las adequadamente.

Resumo

Vesículas extracelulares (EVs) são uma população heterogênea de vesículas de membrana liberadas por células in vitro e in vivo. Sua onipresença e seu significativo papel como portadores de informações biológicas os tornam objetos de estudo intrigantes, exigindo protocolos confiáveis e repetitivos para seu isolamento. No entanto, realizar todo o seu potencial é difícil, pois ainda existem muitos obstáculos técnicos relacionados à sua pesquisa (como a aquisição adequada). Este estudo apresenta um protocolo para o isolamento de pequenos EVs (de acordo com a nomenclatura MISEV 2018) a partir do sobrenadante de cultura de linhagens de células tumorais baseado em centrifugação diferencial. O protocolo inclui orientações sobre como evitar a contaminação por endotoxinas durante o isolamento de EVs e como avaliá-los adequadamente. A contaminação por endotoxinas de EVs pode dificultar significativamente experimentos subsequentes ou mesmo mascarar seus verdadeiros efeitos biológicos. Por outro lado, a presença negligenciada de endotoxinas pode levar a conclusões incorretas. Isso é de particular importância quando se refere a células do sistema imunológico, incluindo monócitos, porque os monócitos constituem uma população especialmente sensível a resíduos de endotoxinas. Portanto, é altamente recomendável rastrear EVs para contaminação por endotoxinas, especialmente quando se trabalha com células sensíveis à endotoxina, como monócitos, macrófagos, células supressoras derivadas do mielóide ou células dendríticas.

Introdução

Vesículas extracelulares (EVs), de acordo com a nomenclatura MISEV 2018, são um termo coletivo que descreve vários subtipos de vesículas membranosas secretadas por células que desempenham papéis cruciais em inúmeros processos fisiológicos e patológicos 1,2. Além disso, os EVs mostram-se promissores como novos biomarcadores para várias doenças, bem como agentes terapêuticos e veículos de liberação de medicamentos. No entanto, realizar todo o seu potencial é difícil, pois ainda existem muitos obstáculos técnicos relacionados à sua aquisição3. Um desses desafios é o isolamento de EVs livres de endotoxinas, que tem sido negligenciado em muitos casos. Uma das endotoxinas mais comuns é o lipopolissacarídeo (LPS), que é um dos principais componentes da parede celular de bactérias gram-negativas e pode causar uma resposta inflamatória aguda, devido à liberação de um grande número de citocinas inflamatórias por várias células 4,5. O LPS induz uma resposta por ligação à proteína ligadora do LPS, seguida de interação com o complexo CD14/TLR4/MD2 em células mieloides. Essa interação leva à ativação das vias de sinalização dependentes de MyD88 e TRIF, que por sua vez desencadeiam o fator nuclear kappa B (NFkB). A translocação do NFkB para o núcleo inicia a produção de citocinas6. Monócitos e macrófagos são altamente sensíveis ao LPS, e sua exposição ao LPS resulta em uma liberação de citocinas inflamatórias e quimiocinas (por exemplo, IL-6, IL-12, CXCL8 e TNF-α)7,8. A estrutura CD14 permite a ligação de diferentes espécies de LPS com afinidade semelhante e serve como co-receptor para outros receptores toll-like (TLRs) (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 e 9)6. O número de estudos sendo conduzidos sobre os efeitos dos EVs em monócitos/macrófagos ainda está aumentando 9,10,11. Especialmente do ponto de vista do estudo das funções dos monócitos, suas subpopulações e outras células imunes, a presença de endotoxina e mesmo sua presença mascarada em EVs é de grande importância12. A contaminação negligenciada de EVs com endotoxinas pode levar a conclusões enganosas e ocultar sua verdadeira atividade biológica. Em outras palavras, trabalhar com células monocíticas requer confiança na ausência de contaminação por endotoxinas13. Fontes potenciais de endotoxinas podem ser água, meios e soros obtidos comercialmente, componentes e aditivos de meios, vidraria de laboratório e plasticware 5,14,15.

Portanto, este estudo teve como objetivo desenvolver um protocolo para o isolamento de EVs com baixo teor de endotoxinas. O protocolo fornece dicas simples sobre como evitar a contaminação por endotoxinas durante o isolamento de EVs em vez de remover endotoxinas de EVs. Anteriormente, muitos protocolos foram apresentados sobre como remover endotoxinas de, por exemplo, nanopartículas projetadas usadas em nanomedicina; no entanto, nenhum deles é útil para estruturas biológicas como EVs. A despirogenação efetiva das nanopartículas pode ser realizada por enxágue com etanol ou ácido acético, aquecimento a 175 °C por 3 h, irradiação γ ou tratamento com triton X-100; entretanto, esses procedimentos levam à destruição dos EVs16,17.

O protocolo apresentado é um estudo pioneiro focado em evitar impurezas de endotoxinas em EVs, ao contrário de estudos anteriores sobre o efeito de EVs em monócitos9. A aplicação dos princípios propostos à prática laboratorial pode auxiliar na obtenção de resultados confiáveis de pesquisa, o que pode ser crucial quando se considera o potencial uso dos EVs como agentes terapêuticos na clínica12.

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Protocolo

1. Preparação de tubos de ultracentrífuga

  1. Use tubos estéreis de uso único. Se isso não for possível, reutilize os tubos ultracentrífugos depois de lavá-los com detergente usando uma pipeta Pasteur estéril ou outros aplicadores de uso único. Lembre-se que os tubos de ultracentrífuga devem ser dedicados a um tipo de material centrifugado (sobrenadante de cultura celular/soro/plasma) e espécie (humano/camundongo/etc.).
  2. Após uma lavagem com detergente, enxágue os tubos ultracentrífugos com água deionizada e livre de LPS 3x.
    NOTA: Não utilize água de baixa qualidade.
  3. Seque os tubos de ultracentrífuga e depois preencha-os com etanol 70%. Deixe os tubos com etanol 70% para desinfecção durante a noite. Retire o etanol e seque os tubos novamente.
  4. Coloque os tubos e tampas em embalagens de esterilização e feche-os bem. Utilizar o método de esterilização por plasma ou gás (óxido de etileno)18,19. Conservar os tubos de ultracentrífuga incluídos na embalagem de esterilização em local seco e utilizá-los antes do prazo de validade.
    OBS: Realizar monitoramento mensal do nível de LPS em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e da água utilizada para isolamento de EVs. O monitoramento também deve incluir os tubos (por exemplo, testando a água [controle de lavagem] que foi armazenada nos tubos ultracentrífugos durante a noite à temperatura ambiente [RT]).

2. Preparação de soro fetal bovino de baixa endotoxina com baixa endotoxina EV (EE-FBS)

  1. Certifique-se de usar FBS de endotoxina ultrabaixa (comercialmente disponível; ver Tabela de Materiais; <0,1 EU/mL).
  2. Coloque um frasco de ultra-baixo endotoxina FBS em banho-maria e incube a 56 °C por 30 min. Esta etapa é necessária para desativar o sistema complemento.
  3. Pipetar o FBS inativado para tubos de ultracentrifugação e centrifugar a 100.000 x g por 4 h a 4 °C. Recolher o sobrenadante em tubos estéreis de 50 ml, garantindo que não exceda 45 ml por tubo para evitar a contaminação da tampa e molhar o anel do tubo.
  4. Conservar o soro EE-FBS preparado desta forma a -20 °C. Verificar a concentração de LPS em EE-FBS (etapa 6). A concentração de LPS deve estar no mesmo nível de antes da ultracentrifugação.

3. Cultura celular

  1. Para este estudo, as culturas SW480 e SW620 em meio de Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco com 4,5 g/L de glicose, L-glutamina, piruvato de sódio e gentamicina (50 μL/mL) foram suplementadas com EE-FBS a 10% em frascos de cultura de 75cm2 usando técnica asséptica. Semeando cerca de 4,5 x 10 6 células e6,5 x 106 células por frasco para SW480 e SW620, respectivamente.
  2. Coletar os sobrenadantes duas vezes por semana (~10 mL por frasco) quando as células atingirem confluência total (~13,5 x 10 6 e 20 x 106 células por frasco para SW480 e SW620, respectivamente) e dividir. Assegurar que a viabilidade das células não seja inferior a 99% e que as células sejam cultivadas a 37 °C numa atmosfera de 5% de CO2.
  3. Coletar sobrenadantes da cultura celular em tubos de 15 mL adequadamente marcados. Centrifugar os sobrenadantes coletados a 500 x g por 5 min no RT para remover restos celulares.
  4. Recolher cuidadosamente os sobrenadantes, evitar aspirar detritos, colocar em tubos marcados e centrifugar novamente a 3.200 x g durante 12 minutos a 4 °C.
  5. Coletar sobrenadantes da segunda etapa de centrifugação em tubos estéreis marcados com 50 mL. Evite molhar as bordas dos tubos. Certifique-se de que o volume de sobrenadante não exceda 45 mL e que os tubos sejam mantidos verticalmente.
  6. Embrulhe a tampa do tubo com uma película transparente estéril e guarde os sobrenadantes na posição vertical a -80 °C.
    OBS: Realizar controle mensal de Mycoplasma spp. e contaminação por LPS em sobrenadantes de culturas frescas (etapa 6). Se o nível de endotoxina nos sobrenadantes exceder 0,05 EU/mL, verifique em que estágio a contaminação pode ter ocorrido e reinicie o processo desde o início. Se contaminação da cultura celular por Mycoplasma spp. é detectado, o isolamento dos EVs de tais sobrenadantes deve ser descontinuado.

4. Isolamento de EVs a partir de sobrenadantes de cultura celular

  1. Preparar filtros de seringas de 0,22 μm e seringas de volume adequado. Preparar dois tubos com sobrenadantes de cultura (90 mL).
  2. Encha a seringa com o sobrenadante e prenda o filtro ao adaptador da agulha. Coloque a seringa cheia com o filtro sobre um tubo de 50 ml. Empurre o êmbolo flange e colete ~90 mL de filtrado.
  3. Pipetar o filtrado (7 mL) para os tubos de ultracentrífuga (garantindo que o mesmo volume seja pipetado para cada tubo para equilíbrio adequado) e centrifugar a 100.000 x g por 2 h a 4 °C.
    NOTA: A eficiência da peletização de EVs depende de muitos fatores (por exemplo, tipo de rotor, seu fator k, comprimento do caminho de migração, viscosidade do meio, etc.), que precisam ser otimizados para uma melhor recuperação de EVs20.
  4. Descarte o sobrenadante usando uma pipeta Pasteur estéril. Colete os pellets restantes usando pontas de pipeta longas e filtradas e junte-os em dois tubos de ultracentrífuga. Preenchê-los até 7 mL com PBS livre de endotoxinas filtradas para enxaguar os EVs.
  5. Centrifugar os pellets ressuspensos de PBS a 100.000 x g por 2 h a 4 °C. Remova completamente o sobrenadante usando uma pipeta Pasteur estéril e adicione 200 μL de PBS filtrado e livre de endotoxinas a ambos os tubos para ressuspender os EVs. Pipetar suavemente a pelota de EVs para coletar todos os EVs.
  6. Transfira a suspensão de EVs para um tubo de ensaio estéril de 1,5 mL (se possível, use um tubo de baixa ligação de proteínas). Reter 10 μL da suspensão de EV para preparar uma diluição para análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) e para outros fins (por exemplo, medição da concentração de proteínas).
  7. Diluir os EVs com PBS filtrado (1:1.000) para medições por NTA, de acordo com as instruções do fabricante. Fixe os tubos EV envolvendo a tampa com uma película transparente estéril. Conservar os veículos elétricos a -80 °C.

5. Detecção de marcadores específicos por western blotting

  1. Determinar o nível de proteína nas amostras (por exemplo, pelo ensaio de Bradford) e preparar as amostras (20 μg) com tampão de carga. Preparar o tampão de carga misturando 5 μL de tampão de amostra (4x) e 2 μL de agente redutor de amostra (10x) para um volume total de 20 μL. Incubar as amostras a 70 °C durante 10 min.
  2. Prepare géis de poliacrilamida com SDS (10%-14%) e carregue os 20 μg de EVs em cada poço.
  3. Executar a eletroforese com tampão de corrida (30 g de Tris, 144 g de glicina, 10% SDS por 1 L) por 45 min a 150 V.
  4. Realizar a transferência semi-seca de proteínas do gel para a membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) em uma máquina de transferência com tampão Towbin (1,51 g de Tris, 7,2 g de glicina, 10% de metanol por 0,5 L) a 25 V por 1 h.
  5. Colocar a membrana em tampão TBST (1 mL de Tween, 100 mL de solução salina tamponada com Tris (TBS 10x) por 1 L) para bloqueio com albumina de soro bovino (BSA) a 1% em tampão TBST e incubar por 1 h no balancim em TR.
  6. Adicionar anticorpos diluídos (1:1.000), anti-CD9 1 (clone#D8O1A) ou anti-Alix 1 (clone#3A9), em BSA a1% e incubar com a membrana durante a noite a 4 °C no balancim. Remover anticorpos e lavar a membrana 3x com 10 mL de 1x TBST por 10 minutos.
  7. Adicionar o anticorpo secundário de cabra anticoelho ou cabra anti-rato (diluição: 1:2.000) conjugado com peroxidase de raiz forte, dependendo do anticorpo primário na membrana, e incubar por 1 h no balancim em RT. Remover anticorpos e lavar a membrana 3x com 10 mL de 1x TBST por 10 minutos.
  8. Misturar o substrato e o luminol na proporção de 1:1 para obter 1 mL de solução. Despeje a solução sobre a membrana. Coloque a membrana imediatamente na câmara de medição do sistema de imagem, escolha o módulo de quimioluminescência e visualize as bandas de proteínas na tela.

6. Medição do nível de endotoxina pelo teste Limulus Amebocyte Lysate (LAL)

  1. Realizar a dosagem cromogênica do LAL do nível de endotoxina, de acordo com a recomendação do fabricante. Resumidamente, utilizar o método baseado na interação da endotoxina com o lisado de amebócito de límulo (LAL). O limite de detecção deste método é de 0,005 EU/mL.
    NOTA: O ensaio LAL, apesar de suas limitações, continua sendo atualmente o método padrão para detectar e quantificar a contaminação por endotoxinas em diferentes tipos de soluções e outros produtos utilizados na ciência ou na medicina8. O fator limitante deste kit é a estabilidade da solução de lisado de amebócito reconstituída, que é estável por apenas 1 semana a -20 °C se congelada imediatamente após a reconstituição.
  2. Use uma diluição dez vezes maior de EVs e outras amostras e uma diluição de 50 vezes de soro. Para experimentos posteriores, use apenas reagentes de baixa endotoxina, como EE-FBS, DMEM, PBS, RPMI (<0,005 EU/mL) e sobrenadantes de cultura livres de LPS.

7. Detecção do gene procariótico 16S rRNA em amostras de EV

  1. Isolar o DNA das amostras de EV. Procure manter assépticos os reagentes e o local de isolamento. Medir a concentração e a qualidade do DNA (por exemplo, usando um espectrofotômetro).
  2. Realizar reação em cadeia da polimerase (PCR), conforme descrito anteriormente21. Preparar gel de agarose a 1,5% com brometo de etídio ou verde SYBR para visualizar os produtos de PCR em luz ultravioleta (UV).
  3. Executar a eletroforese da amostra e do marcador de peso com tampão TRIS-acetato-EDTA a 75 V por 45 min. Visualize bandas de DNA usando o sistema de imagem.

8. Determinação da concentração efetiva de LPS para estimulação em modelo de monócitos humanos

  1. Preparar 2 x 106 monócitos/mL de suspensão de monócitos em RPMI 1640 suplementado com L-glutamina, glicose e EE-FBS a 2%. Adicionar 50 μL da suspensão por poço de uma placa de cultura de tecidos de 96poços 22.
  2. Adicionar um volume adequado de LPS ou meio de cultura para obter as seguintes concentrações finais: 0 pg/mL (controle), 10 pg/mL, 50 pg/mL, 100 pg/mL, 1 ng/mL e 100 ng/mL, em 100 μL de volume total de suspensão celular. Faça triplicatas de cada concentração de LPS.
  3. Cultivar as células por 18 h a 37 °C, 5% CO2. Colete o sobrenadante.
  4. Gire o sobrenadante a 2.000 x g por 5 min. Transfira os sobrenadantes para novos tubos. Medir as concentrações de TNF8,23 e IL-1023 no sobrenadante coletado com o kit de citocinas humanas cytometric beads array (CBA), de acordo com o procedimento do fabricante, com citômetro de fluxo.

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Resultados

Um pré-requisito ou etapa obrigatória para este protocolo é a exclusão de possível contaminação por endotoxinas de reagentes. Todos os reagentes utilizados, como FBS, DMEM, RPMI, PBS e até mesmo tubos de ultracentrífuga, devem ser isentos de endotoxinas (<0,005 EU/mL). Manter o regime de ausência de contaminação por endotoxinas não é fácil, pois, por exemplo, o soro regular/padrão para cultura celular pode ser sua rica fonte (0,364 EU/mL; ver Tabela 1).

Embora ...

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Discussão

Nos últimos anos, métodos para o isolamento adequado dos EVs têm se tornado cada vez mais importantes, possibilitando suas análises mais confiáveis, por exemplo, no contexto da obtenção de dados ômicos e funcionais confiáveis24. Com base na experiência de pesquisa prévia, parece que não só o tipo de método de isolamento, mas também outras condições durante este procedimento podem ser importantes. O uso de SFB com DEPLEÇÃO de EV é amplamente reconhecido como uma necessidade

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Divulgações

Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de relações comerciais ou financeiras que pudessem ser construídas como um potencial conflito de interesses.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Centro Nacional de Ciência, Polônia, número de bolsa 2019/33/B/NZ5/00647. Gostaríamos de agradecer ao Professor Tomasz Gosiewski e Agnieszka Krawczyk do Departamento de Microbiologia Médica Molecular, Faculdade de Medicina da Universidade Jaguelônica por sua inestimável ajuda na detecção de DNA bacteriano em EVs.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
 Alix (3A9) Mouse mAb Cell Signaling Technology2171
1250ul Filter Universal Pipette Tips, Clear, Polypropylene, Non-PyrogenicGoogLab ScientificGBFT1250-R-NS
BD FACSCanto II Flow CytometrBD Biosciences
CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit IIBD Biosciences551809
CD9 (D8O1A) Rabbit mAbCell Signaling Technology13174
ChemiDoc Imaging SystemBio-Rad Laboratories, Inc. 17001401
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) Corning10-013-CV
ELX800NB, Universal Microplate ReaderBIO-TEK INSTRUMENTS, INC
Fetal Bovine SerumGibco16000044
Fetal Bovine Serum South America Ultra Low Endotoxin Biowest S1860-500
Gentamicin, 50 mg/mL PAN – BiotechP06-13100
Goat anti-Mouse IgG- HRPSanta Cruz Biotechnologysc-2004
Goat anti-Rabbit IgG- HRPSanta Cruz Biotechnologysc-2005
Immun-Blot PVDF MembraneBio-Rad Laboratories, Inc. 1620177
LPS from Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE) Enzo Life Sciences, Inc.ALX-581-009-L002
Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer CellBio-Rad Laboratories, Inc. 1703930
Nanoparticle Tracking Analysis Malvern Instruments Ltd
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) Invitrogen NP0007
NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) InvitrogenNP0004
ParafilmSigma AldrichP7793transparent film
Perfect 100-1000 bp DNA LadderEURxE3141-01 
PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant KitThermo ScientificA39552
PP Oak Ridge Tube with sealing capsThermo Scientific3929, 03613
RPMI 1640RPMI-1640 (Gibco)11875093
SimpliAmp Thermal CyclerApplied BiosystemA24811
Sorvall wX+ ULTRA SERIES Centrifuge with T-1270 rotorThermo Scientific75000100
Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis SystemBio-Rad Laboratories, Inc. 1704401
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent SubstrateThermo Scientific34577
SW480 cell lineAmerican Type Culture Collection(ATCC)
SW480 cell lineAmerican Type Culture Collection (ATCC)
Syringe filter 0.22 umTPP99722
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer CellBio-Rad Laboratories, Inc. 1703940Transfer machine
Transfer pipette, 3.5 mLSARSTEDT86.1171.001

Referências

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