JoVE Logo
저자
연락처

로그인

JoVE 비디오를 활용하시려면 도서관을 통한 기관 구독이 필요합니다. 전체 비디오를 보시려면 로그인하거나 무료 트라이얼을 시작하세요.

기사 소개

  • 요약
  • 초록
  • 서문
  • 프로토콜
  • 결과
  • 토론
  • 공개
  • 감사의 말
  • 자료
  • 참고문헌
  • 재인쇄 및 허가

요약

제안된 프로토콜에는 세포 배양 상층액에서 세포외 소포를 분리하는 동안 내독소 오염을 방지하는 방법과 이를 적절하게 평가하는 방법에 대한 지침이 포함되어 있습니다.

초록

세포외 소포(EV)는 시험관 내 및 생체 내 세포에서 방출되는 이질적인 막 소포 집단입니다. 그들의 편재성과 생물학적 정보의 운반자로서의 중요한 역할은 그들을 흥미로운 연구 대상으로 만들고 분리를 위해 신뢰할 수 있고 반복적인 프로토콜이 필요합니다. 그러나 연구와 관련된 많은 기술적 장애물(예: 적절한 획득)이 여전히 많기 때문에 잠재력을 최대한 실현하는 것은 어렵습니다. 이 연구는 차등 원심분리를 기반으로 하는 종양 세포주의 배양 상층액에서 소형 EV(MISEV 2018 명명법에 따름)를 분리하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜에는 EV를 분리하는 동안 내독소 오염을 방지하는 방법과 이를 적절하게 평가하는 방법에 대한 지침이 포함되어 있습니다. EV의 내독소 오염은 후속 실험을 크게 방해하거나 실제 생물학적 효과를 가릴 수도 있습니다. 반면에, 내 독소의 간과 된 존재는 잘못된 결론으로 이어질 수 있습니다. 이것은 단핵구를 포함한 면역계의 세포를 언급 할 때 특히 중요한데, 이는 단핵구가 내 독소 잔기에 특히 민감한 집단을 구성하기 때문입니다. 따라서 특히 단핵구, 대식세포, 골수 유래 억제 세포 또는 수지상 세포와 같은 내독소에 민감한 세포로 작업할 때 EV의 내독소 오염을 스크리닝하는 것이 좋습니다.

서문

MISEV 2018 명명법에 따르면 세포외 소포(EV)는 수많은 생리학적 및 병리학적 과정에서 중요한 역할을 하는 세포 분비 막낭의 다양한 하위 유형을 설명하는 집합적인 용어입니다 1,2. 또한 EV는 다양한 질병에 대한 새로운 바이오마커, 치료제 및 약물 전달 수단으로서의 가능성을 보여줍니다. 그러나 인수와 관련된 기술적 장애물이 여전히 많기 때문에 잠재력을 최대한 실현하는 것은 어렵습니다3. 이러한 과제 중 하나는 많은 경우 무시되어 온 내독소가 없는 EV의 분리입니다. 가장 흔한 내독소 중 하나는 지질다당류(LPS)로, 그람 음성 박테리아 세포벽의 주요 구성 요소이며 다양한 세포에 의한 많은 수의 염증성 사이토카인의 방출로 인해 급성 염증 반응을 일으킬 수 있습니다 4,5. LPS는 LPS 결합 단백질에 결합한 후 골수 세포에서 CD14/TLR4/MD2 복합체와 상호작용하여 반응을 유도합니다. 이 상호 작용은 MyD88 및 TRIF 의존성 신호 전달 경로의 활성화로 이어지며, 이는 차례로 핵 인자 카파 B(NFkB)를 유발합니다. NFkB의 핵으로의 전좌는 사이토카인의 생산을 개시한다6. 단핵구와 대식세포는 LPS에 매우 민감하며 LPS에 노출되면 염증성 사이토카인과 케모카인(예: IL-6, IL-12, CXCL8 및 TNF-α)이 방출됩니다7,8. CD14 구조는 유사한 친화도를 갖는 상이한 LPS 종의 결합을 가능하게 하고, 다른 톨-유사 수용체 (TLRs) (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 및 9)에 대한 공동-수용체로서 작용한다6. 단핵구/대식세포에 대한 EV의 영향에 대한 연구의 수는 여전히 증가하고 있습니다 9,10,11. 특히 단핵구, 그 하위 집단 및 기타 면역 세포의 기능을 연구하는 관점에서 볼 때, 내독소의 존재와 EV에서 가려진 존재는 매우 중요합니다12. 내독소로 인한 EV의 간과된 오염은 오해의 소지가 있는 결론으로 이어지고 진정한 생물학적 활성을 숨길 수 있습니다. 즉, 단핵구 세포로 작업하려면 내독소 오염이 없다는 확신이 필요합니다13. 내독소의 잠재적 공급원은 물, 상업적으로 입수된 배지 및 혈청, 배지 성분 및 첨가제, 실험실 유리 제품 및 플라스틱 제품일 수 있다 5,14,15.

따라서 본 연구는 저내독소 함유 EV의 분리를 위한 프로토콜을 개발하는 것을 목표로 하였다. 이 프로토콜은 EV에서 내독소를 제거하는 대신 EV 격리 중에 내독소 오염을 피하는 방법에 대한 간단한 힌트를 제공합니다. 이전에는 예를 들어 나노 의학에 사용되는 조작 된 나노 입자에서 내 독소를 제거하는 방법에 대한 많은 프로토콜이 제시되었습니다. 그러나 이들 중 어느 것도 EV와 같은 생물학적 구조에 유용하지 않습니다. 나노 입자의 효과적인 발열원 제거는 에탄올 또는 아세트산 헹굼, 175 °C에서 3 시간 동안 가열, γ 조사 또는 트리톤 X-100 처리에 의해 수행 될 수 있습니다. 그러나 이러한 절차는 EV16,17의 파괴로 이어집니다.

제시된 프로토콜은 단핵구에 대한 EV의 효과에 대한 이전 연구와 달리 EV의 내독소 불순물을 피하는 데 초점을 맞춘 선구적인 연구입니다9. 제안된 원리를 실험실 실습에 적용하면 신뢰할 수 있는 연구 결과를 얻는 데 도움이 될 수 있으며, 이는 클리닉에서 치료제로서 EV의 잠재적 사용을 고려할 때 중요할 수 있다12.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

프로토콜

1. 초원심분리기 튜브의 제조

  1. 멸균된 일회용 튜브를 사용하십시오. 이것이 가능하지 않은 경우 멸균 파스퇴르 피펫 또는 기타 일회용 애플리케이터를 사용하여 세제로 세척한 후 초원심분리기 튜브를 재사용하십시오. 초원심분리기 튜브는 한 가지 유형의 원심분리 물질(세포 배양 상청액/혈청/혈장)과 종(인간/마우스 등) 전용이어야 합니다.
  2. 세제 세척 후 초원심분리기 튜브를 탈이온화된 LPS가 없는 물로 3회 헹굽니다.
    알림: 저질의 물을 사용하지 마십시오.
  3. 초원심분리기 튜브를 건조시킨 다음 70% 에탄올로 채웁니다. 밤새 소독을 위해 튜브에 70% 에탄올을 그대로 두십시오. 에탄올을 제거하고 튜브를 다시 건조시킵니다.
  4. 튜브와 캡을 멸균 포장에 넣고 단단히 닫으십시오. 플라즈마 또는 기체(에틸렌옥사이드) 멸균법18,19를 사용한다. 멸균 포장에 동봉된 초원심분리기 튜브는 건조한 곳에 보관하고 유통기한이 지난 전에 사용하십시오.
    알림: 인산염 완충 식염수(PBS)의 LPS 수준과 EV 격리에 사용되는 물을 매월 모니터링합니다. 모니터링에는 튜브도 포함되어야 합니다(예: 실온[RT]에서 밤새 초원심분리기 튜브에 저장된 물[세척 제어]을 테스트).

2. EV가 고갈된 저내독소 소태아혈청(EE-FBS)의 제조

  1. 초저 내독소 FBS(시판, 재료 표 참조, <0.1 EU/mL)를 사용하십시오.
  2. 초저내독소 FBS 병을 수조에 넣고 56°C에서 30분 동안 배양합니다. 이 단계는 보완 시스템을 비활성화하는 데 필요합니다.
  3. 비활성화된 FBS를 초원심분리기 튜브에 피펫팅하고 4°C에서 4시간 동안 100,000 x g 에서 원심분리합니다. 상청액을 멸균된 50mL 튜브에 모으고 튜브당 45mL를 초과하지 않도록 하여 캡 오염을 방지하고 튜브 링을 적시십시오.
  4. 이와 같이 제조된 EE-FBS 혈청을 -20°C에서 보관한다. EE-FBS에서 LPS의 농도를 확인하십시오(6단계). LPS 농도는 초원심분리 전과 같은 수준이어야 합니다.

3. 세포 배양

  1. 이 연구를 위해 SW480 및 SW620 세포주를 4.5g/L 포도당, L-글루타민, 피루브산나트륨 및 겐타마이신(50μL/mL)이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)에서 무균 기술을 사용하여 75cm2 배양 플라스크에서 배양했습니다. SW480 및 SW620에 대해 각각 플라스크당 거의 4.5 x 10 6 셀 및 6.5 x 106 셀을 시드합니다.
  2. 세포가 완전한 밀도(SW480 및 SW620의 경우 각각 플라스크당 ~13.5 x 106 및 20 x 10 6 세포)에 도달하면 일주일에 두 번(플라스크당 ~10mL) 상층액을 수집하고 분할합니다. 세포의 생존율이 99% 이상인지 확인하고 세포가 5%CO2 분위기에서 37°C에서 배양되는지 확인한다.
  3. 세포 배양에서 상층액을 적절하게 표지된 15mL 튜브에 수집합니다. 수집된 상층액을 RT에서 5분 동안 500 x g 에서 원심분리하여 세포 파편을 제거합니다.
  4. 상층액을 조심스럽게 수집하고, 파편을 흡입하지 않도록 하고, 라벨이 붙은 튜브에 넣고, 4°C에서 12분 동안 3,200 x g 에서 다시 원심분리합니다.
  5. 두 번째 원심분리 단계에서 얻은 상층액을 라벨이 붙은 멸균된 50mL 튜브에 수집합니다. 튜브의 가장자리가 젖지 않도록 하십시오. 상청액의 부피가 45mL를 초과하지 않고 튜브가 수직으로 유지되는지 확인하십시오.
  6. 튜브의 캡을 멸균 투명 필름으로 감싸고 상층액을 -80°C의 수직 위치에 보관합니다.
    참고: Mycoplasma spp.의 월간 제어를 수행합니다. 및 신선한 배양 상청액에서의 LPS 오염 (단계 6). 상층액의 내독소 수준이 0.05 EU/mL를 초과하는 경우 오염이 발생했을 수 있는 단계를 확인하고 처음부터 공정을 다시 시작하십시오. Mycoplasma spp.에 의한 세포 배양물의 오염 감지되면 이러한 상청액으로부터 EV의 분리를 중단해야 합니다.

4. 세포 배양 상층액에서 EV의 분리

  1. 0.22μm 주사기 필터와 적절한 부피의 주사기를 준비합니다. 배양 상청액(90mL)이 담긴 두 개의 튜브를 준비합니다.
  2. 주사기에 상층액을 채우고 필터를 바늘 어댑터에 부착하십시오. 필터가 있는 채워진 주사기를 50mL 튜브 위에 놓습니다. 플런저 플랜지를 누르고 ~90mL의 여과액을 수집합니다.
  3. 여과액(7 mL)을 초원심분리기 튜브에 피펫팅하고(적절한 균형을 위해 동일한 부피가 각 튜브에 피펫팅되도록 보장) 4°C에서 2시간 동안 100,000 x g 로 원심분리합니다.
    참고: EV 펠릿화의 효율은 EV의 더 나은 회수를 위해 최적화되어야 하는 많은 요인(예: 로터 유형, k-factor, 이동 경로 길이, 매체의 점도 등)에 따라 달라집니다(20).
  4. 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 버립니다. 여과된 긴 피펫 팁을 사용하여 나머지 펠릿을 수집하고 두 개의 초원심분리기 튜브에 풀링합니다. 여과된 내독소가 없는 PBS로 최대 7mL를 채워 EV를 헹굽니다.
  5. PBS 재현탁 펠릿을 4°C에서 2시간 동안 100,000 x g 로 원심분리합니다. 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 완전히 제거하고 여과된 내독소가 없는 PBS 200μL를 두 튜브에 추가하여 EV를 재현탁합니다. EV 펠릿을 부드럽게 피펫팅하여 모든 EV를 수집합니다.
  6. EV 현탁액을 멸균된 1.5mL 시험관으로 옮깁니다(가능하면 저단백질 결합 튜브 사용). 나노입자 추적 분석(NTA) 및 기타 목적(예: 단백질 농도 측정)을 위한 희석액을 준비하기 위해 EV 현탁액 10μL를 유지합니다.
  7. 제조업체의 지침에 따라 NTA로 측정하기 위해 여과된 PBS(1:1,000)로 EV를 희석합니다. 캡을 멸균 투명 필름으로 감싸 EV 튜브를 고정합니다. EV를 -80 °C에서 보관하십시오.

5. 웨스턴 블로팅에 의한 특정 마커 검출

  1. 샘플에서 단백질 수준을 결정하고(예를 들어, 브래드포드 분석에 의해), 로딩 완충액으로 샘플(20 μg)을 준비한다. 5 μL의 샘플 버퍼(4x)와 2 μL의 샘플 환원제(10x)를 총 부피 20 μL로 혼합하여 로딩 버퍼를 준비합니다. 샘플을 70°C에서 10분 동안 배양합니다.
  2. SDS(10%-14%)로 폴리아크릴아미드 겔을 준비하고 20μg의 EV를 각 웰에 로드합니다.
  3. 150V에서 45분 동안 러닝 버퍼(트리스 30g, 글리신 144g, 1L당 10% SDS)로 전기영동을 실행합니다.
  4. Towbin 버퍼(트리스 1.51g, 글리신 7.2g, 0.5L당 10% 메탄올)를 사용하여 이송 기계에서 겔에서 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인으로 단백질을 25V에서 1시간 동안 반건식으로 전달합니다.
  5. 멤브레인을 TBST 완충액 중의 1% 소 혈청 알부민(BSA)으로 블로킹하기 위해 TBST 완충액(1 L 당 1 mL의 Tween, 100 mL의 Tris-완충 식염수(TBS 10x))에 넣고, RT에서 로커 상에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
  6. 희석된(1:1,000) 항체, 항-CD9 1(클론#D8O1A) 또는 항-알릭스 1(클론#3A9)을1% BSA에 넣고 로커에서 4°C에서 밤새 멤브레인과 함께 배양합니다. 항체를 제거하고 멤브레인을 10mL의 1x TBST로 10분 동안 3배 세척합니다.
  7. 멤브레인의 1차 항체에 따라 염소 항토끼 또는 염소 항-마우스(희석: 1:2,000) 2차 항체를 양고추냉이 과산화효소와 접합하고 RT의 로커에서 1시간 동안 배양합니다. 항체를 제거하고 멤브레인을 10mL의 1x TBST로 10분 동안 3배 세척합니다.
  8. 기질과 루미놀을 1:1 비율로 혼합하여 1mL 용액을 얻습니다. 멤브레인에 용액을 붓습니다. 멤브레인을 이미징 시스템의 측정 챔버에 즉시 배치하고, 화학발광 모듈을 선택하고, 화면에서 단백질 밴드를 시각화합니다.

6. Limulus Amebocyte Lysate test(LAL)에 의한 내독소 수준 측정

  1. 제조업체의 권장 사항에 따라 내독소 수준의 발색 LAL 측정을 수행합니다. 간단히 말해서, 내 독소와 limulus amebocyte lysate (LAL)의 상호 작용에 기초한 방법을 사용하십시오. 이 방법의 검출 한계는 0.005 EU/mL입니다.
    참고: LAL 분석은 한계에도 불구하고 현재 과학 또는 의학에서 사용되는 다양한 종류의 용액 및 기타 제품에서 내독소 오염을 검출하고 정량화하는 표준 방법으로 남아 있습니다8. 이 키트의 제한 요소는 재구성 직후 동결된 경우 -20°C에서 1주일 동안만 안정한 재구성된 아메보사이트 용해물 용액의 안정성입니다.
  2. EV 및 기타 샘플의 10배 희석과 혈청의 50배 희석을 사용하십시오. 추가 실험을 위해 EE-FBS, DMEM, PBS, RPMI(<0.005 EU/mL) 및 LPS가 없는 배양 상층액과 같은 저내독소 시약만 사용하십시오.

7. EV 샘플에서 원핵 16S rRNA 유전자 검출

  1. EV 샘플에서 DNA를 분리합니다. 시약과 격리 부위를 무균 상태로 유지하십시오. DNA 농도 및 품질을 측정합니다(예: 분광 광도계 사용).
  2. 앞서 설명한 바와 같이 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 수행한다21. 에티듐 브로마이드 또는 SYBR 녹색으로 1.5% 아가로스 겔을 준비하여 PCR 산물을 자외선(UV)으로 시각화합니다.
  3. TRIS-아세테이트-EDTA 버퍼를 사용하여 45분 동안 75V에서 샘플 및 중량 마커의 전기영동을 실행합니다. 이미징 시스템을 사용하여 DNA 밴드를 시각화합니다.

8. 인간 단핵구 모델에서 자극을 위한 효과적인 LPS 농도의 결정

  1. L-글루타민, 포도당 및 2% EE-FBS가 보충된 RPMI 1640에 2 x 106 단핵구/mL의 단핵구 현탁액을 준비합니다. 96-웰 조직 배양 플레이트22의 웰 당 50 μL의 현탁액을 첨가한다.
  2. 적절한 부피의 LPS 또는 배양 배지를 추가하여 0 pg/mL(대조군), 10 pg/mL, 50 pg/mL, 100 pg/mL, 1 ng/mL 및 100 ng/mL, 100 μL 총 부피의 세포 현탁액. 각 LPS 농도를 세 번 만듭니다.
  3. 세포를 37°C, 5%CO2에서 18시간 동안 배양하였다. 상청액을 수집합니다.
  4. 상층액을 2,000 x g에서 5분 동안 회전시킵니다. 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 수집된 상층액에서 TNF 8,23 및 IL-10 23 농도를 유세포 분석기로 제조업체의 절차에 따라 세포측정 비드 어레이(CBA) 인간 사이토카인 키트로 측정합니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

결과

이 프로토콜의 전제 조건 또는 필수 단계는 시약에서 가능한 내독소 오염을 배제하는 것입니다. FBS, DMEM, RPMI, PBS 및 초원심분리기 튜브와 같이 사용되는 모든 시약은 내독소가 없어야 합니다(<0.005 EU/mL). 예를 들어, 세포 배양을 위한 일반/표준 혈청이 풍부한 공급원이 될 수 있기 때문에 내독소 오염이 없는 체계를 유지하는 것은 쉽지 않습니다(0.364 EU/mL, 표 1 참조).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

토론

지난 몇 년 동안, 적절한 전기차 분리를 위한 방법들이 점점 더 중요해졌으며, 예를 들어, 신뢰할 수 있는 오믹스 및 기능 데이터를 얻는 맥락에서 더욱 신뢰할 수 있는 분석이 가능해졌다24. 이전 연구 경험에 비추어 볼 때, 격리 방법의 유형뿐만 아니라이 절차 중 다른 조건도 중요 할 수 있습니다. EV-고갈 FBS의 사용은 필요성으로 널리 인식되고 있다25,26

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

공개

저자는 잠재적인 이해 상충으로 구성될 수 있는 상업적 또는 재정적 관계가 없는 상태에서 연구가 수행되었다고 선언합니다.

감사의 말

이 작업은 폴란드 국립 과학 센터(National Science Centre)의 보조금 번호 2019/33/B/NZ5/00647의 지원을 받았습니다. EV에서 박테리아 DNA를 검출하는 데 귀중한 도움을 주신 Jagiellonian University Medical College의 분자 의료 미생물학과의 Tomasz Gosiewski 교수와 Agnieszka Krawczyk 교수에게 감사드립니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
 Alix (3A9) Mouse mAb Cell Signaling Technology2171
1250ul Filter Universal Pipette Tips, Clear, Polypropylene, Non-PyrogenicGoogLab ScientificGBFT1250-R-NS
BD FACSCanto II Flow CytometrBD Biosciences
CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit IIBD Biosciences551809
CD9 (D8O1A) Rabbit mAbCell Signaling Technology13174
ChemiDoc Imaging SystemBio-Rad Laboratories, Inc. 17001401
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) Corning10-013-CV
ELX800NB, Universal Microplate ReaderBIO-TEK INSTRUMENTS, INC
Fetal Bovine SerumGibco16000044
Fetal Bovine Serum South America Ultra Low Endotoxin Biowest S1860-500
Gentamicin, 50 mg/mL PAN – BiotechP06-13100
Goat anti-Mouse IgG- HRPSanta Cruz Biotechnologysc-2004
Goat anti-Rabbit IgG- HRPSanta Cruz Biotechnologysc-2005
Immun-Blot PVDF MembraneBio-Rad Laboratories, Inc. 1620177
LPS from Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE) Enzo Life Sciences, Inc.ALX-581-009-L002
Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer CellBio-Rad Laboratories, Inc. 1703930
Nanoparticle Tracking Analysis Malvern Instruments Ltd
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) Invitrogen NP0007
NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) InvitrogenNP0004
ParafilmSigma AldrichP7793transparent film
Perfect 100-1000 bp DNA LadderEURxE3141-01 
PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant KitThermo ScientificA39552
PP Oak Ridge Tube with sealing capsThermo Scientific3929, 03613
RPMI 1640RPMI-1640 (Gibco)11875093
SimpliAmp Thermal CyclerApplied BiosystemA24811
Sorvall wX+ ULTRA SERIES Centrifuge with T-1270 rotorThermo Scientific75000100
Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis SystemBio-Rad Laboratories, Inc. 1704401
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent SubstrateThermo Scientific34577
SW480 cell lineAmerican Type Culture Collection(ATCC)
SW480 cell lineAmerican Type Culture Collection (ATCC)
Syringe filter 0.22 umTPP99722
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer CellBio-Rad Laboratories, Inc. 1703940Transfer machine
Transfer pipette, 3.5 mLSARSTEDT86.1171.001

참고문헌

  1. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  2. Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066(2015).
  3. van Niel, G., et al. Challenges and directions in studying cell-cell communication by extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (5), 369-382 (2022).
  4. Ngkelo, A., Meja, K., Yeadon, M., Adcock, I., Kirkham, P. A. LPS induced inflammatory responses in human peripheral blood mononuclear cells is mediated through NOX4 and Giα dependent PI-3 kinase signalling. Journal of Inflammation. 9 (1), (2012).
  5. Schwarz, H., Schmittner, M., Duschl, A., Horejs-Hoeck, J. Residual endotoxin contaminations in recombinant proteins are sufficient to activate human CD1c+ dendritic cells. PLOS ONE. 9 (12), 113840(2014).
  6. Zanoni, I., Granucci, F. Role of CD14 in host protection against infections and in metabolism regulation. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 32(2013).
  7. Takashiba, S., et al. Differentiation of monocytes to macrophages primes cells for lipopolysaccharide stimulation via accumulation of cytoplasmic nuclear factor kB. Infection and Immunity. 67 (11), 5573-5578 (1999).
  8. Schwarz, H., et al. Biological activity of masked endotoxin. Scientific Reports. 7, 44750(2017).
  9. Danesh, A., et al. Granulocyte-derived extracellular vesicles activate monocytes and are associated with mortality in intensive care unit patients. Frontiers in Immunology. 9, 956(2018).
  10. Barry, O. P., Pratico, D., Savani, R. C., FitzGerald, G. A. Modulation of monocyte-endothelial cell interactions by platelet microparticles. The Journal of Clinical Investigation. 102 (1), 136-144 (1998).
  11. Sadallah, S., Eken, C., Martin, P. J., Schifferli, J. A. Microparticles (ectosomes) shed by stored human platelets downregulate macrophages and modify the development of dendritic cells. Journal of Immunology. 186 (11), 6543-6552 (2011).
  12. Soekmadji, C., et al. The future of Extracellular Vesicles as Theranostics - an ISEV meeting report. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1809766(2020).
  13. Gioannini, T. L., et al. Isolation of an endotoxin-MD-2 complex that produces Toll-like receptor 4-dependent cell activation at picomolar concentrations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (12), 4186-4191 (2004).
  14. Roslansky, P. F., Dawson, M. E., Novitsky, T. J. Plastics, endotoxins, and the Limulus amebocyte lysate test. Journal of Parenteral Science and Technology. 45 (2), 83-87 (1991).
  15. Fishel, S., Jackson, P., Webster, J., Faratian, B. Endotoxins in culture medium for human in vitro fertilization. Fertility and Sterility. 49 (1), 108-111 (1988).
  16. Schulz, E., Karagianni, A., Koch, M., Fuhrmann, G. Hot EVs - How temperature affects extracellular vesicles. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 5 (146), 55-63 (2020).
  17. Osteikoetxea, X., et al. Differential detergent sensitivity of extracellular vesicle subpopulations. Organic & Biomolecular Chemistry. 13 (38), 9775-9782 (2015).
  18. Sakudo, A., Yagyu, Y., Onodera, T. Disinfection and sterilization using plasma technology: fundamentals and future perspectives for biological applications. International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 5216(2019).
  19. Shintani, H. Ethylene oxide gas sterilization of medical devices. Biocontrol Science. 22 (1), 1-16 (2017).
  20. Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
  21. Salamon, D., et al. Comparison of iSeq and MiSeq as the two platforms for 16S rRNA sequencing in the study of the gut of rat microbiome. Applied Microbiology and Biotechnology. 106 (22), 7671-7681 (2022).
  22. Baj-Krzyworzeka, M., Szatanek, R., Weglarczyk, K., Baran, J., Zembala, M. Tumour-derived microvesicles modulate biological activity of human monocytes. Immunology Letters. 113 (2), 76-82 (2007).
  23. Chaiwut, R., Kasinrerk, W. Very low concentration of lipopolysaccharide can induce the production of various cytokines and chemokines in human primary monocytes. BMC Research Notes. 15 (1), 42(2022).
  24. Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24858(2014).
  25. Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061(2021).
  26. Pham, C. V., et al. Bovine extracellular vesicles contaminate human extracellular vesicles produced in cell culture conditioned medium when 'exosome-depleted serum' is utilised. Archives of Biochemistry and Biophysics. 708, 108963(2021).
  27. Li, Y., Boraschi, D. Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies. Nanomedicine. 11 (3), 269-287 (2016).
  28. Álvarez, E., et al. A system dynamics model to predict the human monocyte response to endotoxins. Frontiers in Immunology. 8, 915(2017).
  29. Busatto, S., et al. Tangential flow filtration for highly efficient concentration of extracellular vesicles from large volumes of fluid. Cells. 7 (12), 273(2018).
  30. Gałuszka, A., et al. Transition metal containing particulate matter promotes Th1 and Th17 inflammatory response by monocyte activation in organic and inorganic compounds dependent manner. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (4), 1227(2020).
  31. Falagas, M. E., Kasiakou, S. K. Toxicity of polymyxins: a systematic review of the evidence from old and recent studies. Critical Care. 10 (1), 27(2006).
  32. Petsch, D., Anspach, F. B. Endotoxin removal from protein solutions. Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

재인쇄 및 허가

JoVE'article의 텍스트 или 그림을 다시 사용하시려면 허가 살펴보기

허가 살펴보기

더 많은 기사 탐색

192

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

개인 정보 보호

이용 약관

정책

연락처

사서에게 추천하기

JoVE 뉴스레터

연구

교육

저자

사서

JoVE 소개

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. 판권 소유