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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Il protocollo proposto include linee guida su come evitare la contaminazione con endotossina durante l'isolamento di vescicole extracellulari da supernatanti di coltura cellulare e su come valutarle correttamente.

Abstract

Le vescicole extracellulari (EV) sono una popolazione eterogenea di vescicole di membrana rilasciate dalle cellule in vitro e in vivo. La loro onnipresenza e il ruolo significativo come portatori di informazioni biologiche li rendono oggetti di studio intriganti, che richiedono protocolli affidabili e ripetitivi per il loro isolamento. Tuttavia, realizzare il loro pieno potenziale è difficile in quanto ci sono ancora molti ostacoli tecnici legati alla loro ricerca (come l'acquisizione corretta). Questo studio presenta un protocollo per l'isolamento di piccole EV (secondo la nomenclatura MISEV 2018) dalla coltura surnatante di linee cellulari tumorali basate sulla centrifugazione differenziale. Il protocollo include linee guida su come evitare la contaminazione con endotossine durante l'isolamento delle EV e su come valutarle correttamente. La contaminazione da endotossine delle EV può ostacolare significativamente gli esperimenti successivi o addirittura mascherare i loro veri effetti biologici. D'altra parte, la presenza trascurata di endotossine può portare a conclusioni errate. Ciò è di particolare importanza quando ci si riferisce alle cellule del sistema immunitario, compresi i monociti, perché i monociti costituiscono una popolazione particolarmente sensibile ai residui di endotossine. Pertanto, è altamente raccomandato eseguire lo screening delle EV per la contaminazione da endotossine, specialmente quando si lavora con cellule sensibili all'endotossina come monociti, macrofagi, cellule soppressori derivate da mieloidi o cellule dendritiche.

Introduzione

Le vescicole extracellulari (EV), secondo la nomenclatura MISEV 2018, sono un termine collettivo che descrive vari sottotipi di vescicole membranose secrete da cellule che svolgono ruoli cruciali in numerosi processi fisiologici e patologici 1,2. Inoltre, i veicoli elettrici sono promettenti come nuovi biomarcatori per varie malattie, nonché agenti terapeutici e veicoli di somministrazione di farmaci. Tuttavia, realizzare il loro pieno potenziale è difficile in quanto ci sono ancora molti ostacoli tecnici legati alla loro acquisizione3. Una di queste sfide è l'isolamento delle EV prive di endotossine, che è stato trascurato in molti casi. Una delle endotossine più comuni è il lipopolisaccaride (LPS), che è un componente importante delle pareti cellulari batteriche gram-negative e può causare una risposta infiammatoria acuta, a causa del rilascio di un gran numero di citochine infiammatorie da parte di varie cellule 4,5. LPS induce una risposta legandosi alla proteina legante LPS, seguita dall'interazione con il complesso CD14/TLR4/MD2 sulle cellule mieloidi. Questa interazione porta all'attivazione di vie di segnalazione dipendenti da MyD88 e TRIF, che a loro volta innescano il fattore nucleare kappa B (NFkB). La traslocazione di NFkB nel nucleo avvia la produzione di citochine6. I monociti e i macrofagi sono altamente sensibili agli LPS e la loro esposizione agli LPS provoca un rilascio di citochine infiammatorie e chemochine (ad esempio, IL-6, IL-12, CXCL8 e TNF-α)7,8. La struttura CD14 consente il legame di diverse specie di LPS con affinità simile e funge da co-recettore per altri recettori toll-like (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 e 9)6. Il numero di studi condotti sugli effetti delle EV sui monociti/macrofagi è ancora in aumentodi 9,10,11. Soprattutto dal punto di vista dello studio delle funzioni dei monociti, delle loro sottopopolazioni e di altre cellule immunitarie, la presenza di endotossine e persino la loro presenza mascherata nelle EV è di grande importanza12. La contaminazione trascurata delle EV con endotossine può portare a conclusioni fuorvianti e nascondere la loro vera attività biologica. In altre parole, lavorare con cellule monocitiche richiede fiducia in assenza di contaminazione da endotossine13. Le potenziali fonti di endotossine possono essere acqua, terreni e sieri ottenuti commercialmente, componenti e additivi dei supporti, vetreria da laboratorio e articoli in plastica 5,14,15.

Pertanto, questo studio mirava a sviluppare un protocollo per l'isolamento di EV contenenti endotossine basse. Il protocollo fornisce semplici suggerimenti su come evitare la contaminazione da endotossine durante l'isolamento delle EV invece di rimuovere le endotossine dalle EV. In precedenza, sono stati presentati molti protocolli su come rimuovere le endotossine, ad esempio, dalle nanoparticelle ingegnerizzate utilizzate in nanomedicina; tuttavia, nessuno di essi è utile per strutture biologiche come i veicoli elettrici. L'efficace depirogenazione delle nanoparticelle può essere effettuata mediante risciacquo con etanolo o acido acetico, riscaldamento a 175 °C per 3 ore, irradiazione γ o trattamento tritone X-100; tuttavia, queste procedure portano alla distruzione dei veicoli elettrici16,17.

Il protocollo presentato è uno studio pionieristico incentrato sull'evitare le impurità delle endotossine nelle EV, a differenza dei precedenti studi sull'effetto delle EV sui monociti9. L'applicazione dei principi proposti alla pratica di laboratorio può aiutare a ottenere risultati di ricerca affidabili, che possono essere cruciali quando si considera il potenziale uso di EV come agenti terapeutici nella clinica12.

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Protocollo

1. Preparazione di tubi per ultracentrifuga

  1. Utilizzare tubi sterili monouso. Se ciò non è possibile, riutilizzare i tubi ultracentrifuga dopo averli lavati con un detergente utilizzando una pipetta sterile Pasteur o altri applicatori monouso. Ricorda che le provette ultracentrifughe dovrebbero essere dedicate a un tipo di materiale centrifugato (coltura cellulare supernatante / siero / plasma) e specie (uomo / topo / ecc.).
  2. Dopo un lavaggio detergente, sciacquare i tubi dell'ultracentrifuga con acqua deionizzata e priva di LPS 3x.
    NOTA: Non utilizzare acqua di bassa qualità.
  3. Asciugare i tubi dell'ultracentrifuga, quindi riempirli con etanolo al 70%. Lasciare i tubi con etanolo al 70% per la disinfezione notturna. Rimuovere l'etanolo e asciugare nuovamente i tubi.
  4. Posizionare i tubi e i tappi nella confezione di sterilizzazione e chiuderli ermeticamente. Utilizzare il metodo di sterilizzazione al plasma o a gas (ossido di etilene)18,19. Conservare i tubi ultracentrifuga racchiusi nella confezione di sterilizzazione in un luogo asciutto e utilizzarli prima della data di scadenza.
    NOTA: Eseguire il monitoraggio mensile del livello di LPS nella soluzione salina tamponata fosfato (PBS) e dell'acqua utilizzata per l'isolamento dei veicoli elettrici. Il monitoraggio dovrebbe includere anche i tubi (ad esempio, testando l'acqua [controllo del lavaggio] che è stata immagazzinata nei tubi dell'ultracentrifuga durante la notte a temperatura ambiente [RT]).

2. Preparazione di siero bovino fetale a bassa endotossina impoverito per EV (EE-FBS)

  1. Assicurarsi di utilizzare FBS a bassissima endotossina (disponibile in commercio; vedere Tabella dei materiali; <0,1 EU/ml).
  2. Mettere un flacone di FBS a bassissima endotossina a bagnomaria e incubare a 56 °C per 30 minuti. Questo passaggio è necessario per disattivare il sistema del complemento.
  3. Pipettare l'FBS inattivato in provette da ultracentrifuga e centrifugarlo a 100.000 x g per 4 ore a 4 °C. Raccogliere il surnatante in provette sterili da 50 ml, assicurandosi di non superare i 45 ml per tubo per evitare la contaminazione del tappo e bagnando l'anello del tubo.
  4. Conservare il siero EE-FBS così preparato a -20 °C. Controllare la concentrazione di LPS in EE-FBS (fase 6). La concentrazione di LPS deve essere allo stesso livello di prima dell'ultracentrifugazione.

3. Coltura cellulare

  1. Per questo studio, colture di linee cellulari SW480 e SW620 nel terreno di Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco con 4,5 g/L di glucosio, L-glutammina, piruvato di sodio e gentamicina (50 μL/ml) integrate con EE-FBS al 10% di conseguenza in flaconi di coltura da 75 cm2 utilizzando tecnica asettica. Seminare quasi 4,5 x 10 6 cellule e6,5 x 106 cellule per pallone rispettivamente per SW480 e SW620.
  2. Raccogliere i surnatanti due volte alla settimana (~10 ml per pallone) quando le cellule raggiungono la piena confluenza (~13,5 x 10 6 e 20 x 106 cellule per pallone rispettivamente per SW480 e SW620) e dividere. Assicurarsi che la vitalità delle cellule non sia inferiore al 99% e che le cellule siano coltivate a 37 °C in un'atmosfera di CO2 al 5%.
  3. Raccogliere i surnatanti dalla coltura cellulare in tubi da 15 ml opportunamente etichettati. Centrifugare i surnatanti raccolti a 500 x g per 5 minuti a RT per rimuovere i detriti cellulari.
  4. Raccogliere i surnatanti con cura, evitare di aspirare detriti, metterli in provette etichettate e centrifugare nuovamente a 3.200 x g per 12 minuti a 4 °C.
  5. Raccogliere i surnatanti dalla seconda fase di centrifugazione in provette sterili marcate da 50 ml. Evitare di bagnare i bordi dei tubi. Assicurarsi che il volume del surnatante non superi i 45 ml e che i tubi siano mantenuti verticalmente.
  6. Avvolgere il cappuccio del tubo con una pellicola trasparente sterile e conservare i surnatanti in posizione verticale a -80 °C.
    NOTA: Eseguire il controllo mensile di Mycoplasma spp. e la contaminazione da LPS nei supernatanti di coltura fresca (fase 6). Se il livello di endotossina nei surnatanti supera 0,05 EU/ml, verificare in quale fase potrebbe essersi verificata la contaminazione e riavviare il processo dall'inizio. Se la contaminazione della coltura cellulare da Mycoplasma spp. viene rilevato, l'isolamento dei veicoli elettrici da tali surnatanti deve essere interrotto.

4. Isolamento di EV da supernatanti di coltura cellulare

  1. Preparare filtri per siringhe da 0,22 μm e siringhe di volume adeguato. Preparare due provette con surnatanti di coltura (90 ml).
  2. Riempire la siringa con il surnatante e collegare il filtro all'adattatore dell'ago. Posizionare la siringa riempita con il filtro su un tubo da 50 ml. Spingere sulla flangia dello stantuffo e raccogliere ~90 ml di filtrato.
  3. Pipettare il filtrato (7 ml) alle provette dell'ultracentrifuga (assicurandosi che lo stesso volume sia pipettato su ciascun tubo per il corretto bilanciamento) e centrifugare a 100.000 x g per 2 ore a 4 °C.
    NOTA: L'efficienza del pelletting dei veicoli elettrici dipende da molti fattori (ad esempio, il tipo di rotore, il suo fattore k, la lunghezza del percorso di migrazione, la viscosità del fluido, ecc.), che devono essere ottimizzati per un migliore recupero dei veicoli elettrici20.
  4. Eliminare il surnatante con una pipetta sterile Pasteur. Raccogliere i pellet rimanenti utilizzando lunghe punte filtrate per pipette e raggrupparle in due provette per ultracentrifuga. Riempirli fino a 7 ml con PBS filtrato privo di endotossine per risciacquare gli EV.
  5. Centrifugare i pellet risospesi con PBS a 100.000 x g per 2 ore a 4 °C. Rimuovere completamente il surnatante utilizzando una pipetta Pasteur sterile e aggiungere 200 μL di PBS filtrato privo di endotossine a entrambi i tubi per risospendere gli EV. Pipettare delicatamente il pellet EV per raccogliere tutti i veicoli elettrici.
  6. Trasferire la sospensione EV in una provetta sterile da 1,5 ml (se possibile, utilizzare una provetta a basso legame proteico). Conservare 10 μL della sospensione EV per preparare una diluizione per l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) e per altri scopi (ad esempio, misurazione della concentrazione proteica).
  7. Diluire i veicoli elettrici con PBS filtrato (1:1.000) per le misurazioni mediante NTA, secondo le istruzioni del produttore. Fissare i tubi EV avvolgendo il cappuccio con una pellicola trasparente sterile. Conservare i veicoli elettrici a -80 °C.

5. Rilevamento di marcatori specifici mediante western blotting

  1. Determinare il livello di proteine nei campioni (ad esempio, mediante il saggio di Bradford) e preparare i campioni (20 μg) con tampone di carico. Preparare il tampone di carico miscelando 5 μL di tampone campione (4x) e 2 μL di agente riducente del campione (10x) per un volume totale di 20 μL. Incubare i campioni a 70 °C per 10 minuti.
  2. Preparare gel di poliacrilammide con SDS (10% -14%) e caricare i 20 μg di EV in ciascun pozzetto.
  3. Eseguire l'elettroforesi con tampone di corsa (30 g di Tris, 144 g di glicina, 10% SDS per 1 L) per 45 minuti a 150 V.
  4. Eseguire il trasferimento semisecco di proteine dal gel sulla membrana di polivinilidendifluoruro (PVDF) in una macchina transfer con tampone Towbin (1,51 g di Tris, 7,2 g di glicina, 10% di metanolo per 0,5 L) a 25 V per 1 ora.
  5. Posizionare la membrana in tampone TBST (1 mL di Tween, 100 mL di soluzione salina Tris-buffered (TBS 10x) per 1 L) per bloccare con albumina sierica bovina all'1% (BSA) in tampone TBST e incubare per 1 ora sul bilanciere a RT.
  6. Aggiungere anticorpi diluiti (1:1.000), anti-CD9 1 (clone#D8O1A) o anti-Alix 1 (clone#3A9), in1% BSA e incubare con la membrana per una notte a 4 °C sul bilanciere. Rimuovere gli anticorpi e lavare la membrana 3x con 10 mL di 1x TBST per 10 minuti.
  7. Aggiungere anticorpo secondario anti-coniglio di capra o anti-topo di capra (diluizione: 1:2.000) coniugato con perossidasi di rafano, a seconda dell'anticorpo primario sulla membrana, e incubare per 1 ora sul rocker a RT. Rimuovere gli anticorpi e lavare la membrana 3x con 10 ml di 1x TBST per 10 minuti.
  8. Mescolare il substrato e il luminolo in rapporto 1:1 per ottenere una soluzione da 1 ml. Versare la soluzione sulla membrana. Posizionare immediatamente la membrana nella camera di misurazione del sistema di imaging, scegliere il modulo di chemiluminescenza e visualizzare le bande proteiche sullo schermo.

6. Misurazione del livello di endotossine mediante test del lisato di Amebociti Limulus (LAL)

  1. Eseguire la misurazione cromogenica LAL del livello di endotossina, secondo la raccomandazione del produttore. In breve, utilizzare il metodo basato sull'interazione dell'endotossina con il lisato di amebociti limulus (LAL). Il limite di rilevazione di questo metodo è 0,005 EU/mL.
    NOTA: Il test LAL, nonostante i suoi limiti, rimane attualmente il metodo standard per rilevare e quantificare la contaminazione da endotossine in diversi tipi di soluzioni e altri prodotti utilizzati nella scienza o nella medicina8. Il fattore limitante di questo kit è la stabilità della soluzione ricostituita di lisato amebocitario, che è stabile solo per 1 settimana a -20 °C se congelata immediatamente dopo la ricostituzione.
  2. Utilizzare una diluizione di dieci volte di EV e altri campioni e una diluizione di 50 volte di siero. Per ulteriori esperimenti, utilizzare solo reagenti a bassa endotossina come EE-FBS, DMEM, PBS, RPMI (<0,005 EU/mL) e supernatanti di coltura privi di LPS.

7. Identificazione del gene rRNA procariotico 16S in campioni di EV

  1. Isolare il DNA dai campioni EV. Cerca di mantenere i reagenti e il sito di isolamento asettico. Misurare la concentrazione e la qualità del DNA (ad esempio, utilizzando uno spettrofotometro).
  2. Eseguire la reazione a catena della polimerasi (PCR), come descritto in precedenza21. Preparare gel di agarosio all'1,5% con bromuro di etidio o verde SYBR per visualizzare i prodotti PCR in luce ultravioletta (UV).
  3. Eseguire l'elettroforesi del campione e del marcatore di peso con tampone TRIS-acetato-EDTA a 75 V per 45 minuti. Visualizza le bande del DNA utilizzando il sistema di imaging.

8. Determinazione della concentrazione effettiva di LPS per la stimolazione in modello monocitario umano

  1. Preparare 2 x 106 monociti/ml di sospensione monocitaria in RPMI 1640 integrata con L-glutammina, glucosio e 2% EE-FBS. Aggiungere 50 μL della sospensione per pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 96 pozzetti22.
  2. Aggiungere un volume adeguato di LPS o terreno di coltura per ottenere le seguenti concentrazioni finali: 0 pg/mL (controllo), 10 pg/mL, 50 pg/mL, 100 pg/mL, 1 ng/mL e 100 ng/mL, in 100 μL di volume totale di sospensione cellulare. Triplicare ogni concentrazione di LPS.
  3. Coltura delle cellule per 18 ore a 37 °C, 5% CO2. Raccogli il surnatante.
  4. Ruotare il surnatante a 2.000 x g per 5 minuti. Trasferire i surnatanti in nuovi tubi. Misurare la concentrazione di TNF8,23 e IL-1023 nei surnatanti raccolti con il kit di citochine umane CBA (cytometric beads array), secondo la procedura del produttore, con un citometro a flusso.

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Risultati

Un prerequisito o un passo obbligatorio per questo protocollo è l'esclusione di possibili contaminazioni da endotossine dai reagenti. Tutti i reagenti utilizzati, come FBS, DMEM, RPMI, PBS e persino provette da ultracentrifuga, devono essere privi di endotossine (<0,005 EU/mL). Mantenere il regime di non contaminazione da endotossine non è facile in quanto, ad esempio, il siero normale/standard per la coltura cellulare può essere la sua ricca fonte (0,364 EU/ml; vedi Tabella 1).

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Discussione

Negli ultimi anni, i metodi per un corretto isolamento dei veicoli elettrici sono diventati sempre più importanti, consentendo loro ulteriori analisi affidabili, ad esempio, nel contesto dell'ottenimento di omiche affidabili e dati funzionali24. Sulla base di precedenti esperienze di ricerca, sembra che non solo il tipo di metodo di isolamento, ma anche altre condizioni durante questa procedura possano essere importanti. L'uso di FBS impoveriti di EV è ampiamente riconosciuto come una necessità...

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Divulgazioni

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di relazioni commerciali o finanziarie che potrebbero essere costruite come un potenziale conflitto di interessi.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Science Centre, Polonia, numero di sovvenzione 2019/33/B/NZ5/00647. Vorremmo ringraziare il professor Tomasz Gosiewski e Agnieszka Krawczyk del Dipartimento di Microbiologia Medica Molecolare, Jagiellonian University Medical College per il loro inestimabile aiuto nella rilevazione del DNA batterico nelle EV.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
 Alix (3A9) Mouse mAb Cell Signaling Technology2171
1250ul Filter Universal Pipette Tips, Clear, Polypropylene, Non-PyrogenicGoogLab ScientificGBFT1250-R-NS
BD FACSCanto II Flow CytometrBD Biosciences
CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit IIBD Biosciences551809
CD9 (D8O1A) Rabbit mAbCell Signaling Technology13174
ChemiDoc Imaging SystemBio-Rad Laboratories, Inc. 17001401
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) Corning10-013-CV
ELX800NB, Universal Microplate ReaderBIO-TEK INSTRUMENTS, INC
Fetal Bovine SerumGibco16000044
Fetal Bovine Serum South America Ultra Low Endotoxin Biowest S1860-500
Gentamicin, 50 mg/mL PAN – BiotechP06-13100
Goat anti-Mouse IgG- HRPSanta Cruz Biotechnologysc-2004
Goat anti-Rabbit IgG- HRPSanta Cruz Biotechnologysc-2005
Immun-Blot PVDF MembraneBio-Rad Laboratories, Inc. 1620177
LPS from Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE) Enzo Life Sciences, Inc.ALX-581-009-L002
Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer CellBio-Rad Laboratories, Inc. 1703930
Nanoparticle Tracking Analysis Malvern Instruments Ltd
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) Invitrogen NP0007
NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) InvitrogenNP0004
ParafilmSigma AldrichP7793transparent film
Perfect 100-1000 bp DNA LadderEURxE3141-01 
PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant KitThermo ScientificA39552
PP Oak Ridge Tube with sealing capsThermo Scientific3929, 03613
RPMI 1640RPMI-1640 (Gibco)11875093
SimpliAmp Thermal CyclerApplied BiosystemA24811
Sorvall wX+ ULTRA SERIES Centrifuge with T-1270 rotorThermo Scientific75000100
Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis SystemBio-Rad Laboratories, Inc. 1704401
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent SubstrateThermo Scientific34577
SW480 cell lineAmerican Type Culture Collection(ATCC)
SW480 cell lineAmerican Type Culture Collection (ATCC)
Syringe filter 0.22 umTPP99722
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer CellBio-Rad Laboratories, Inc. 1703940Transfer machine
Transfer pipette, 3.5 mLSARSTEDT86.1171.001

Riferimenti

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