設計された混合プロセス実験と自己検証アンサンブルモデル(SVEM)を使用した脂質ナノ粒子(LNP)製剤最適化のワークフロー

要約

このプロトコルは、実験計画構成における主観的な選択を最小限に抑える、混合、連続、およびカテゴリカル研究要因に対する定式化最適化へのアプローチを提供します。解析フェーズでは、効果的で使いやすいモデリングフィッティング手順が採用されます。

要約

脂質ナノ粒子(LNP)製剤を最適化するためのクオリティ・バイ・デザイン(QbD)スタイルのアプローチを提示し、科学者にアクセス可能なワークフローを提供することを目指しています。イオン化性脂質、ヘルパー脂質、およびPEG脂質のモル比を合計すると最大100%でなければならないこれらの研究に固有の制限により、この混合物の制約に対応するための特殊な設計および分析方法が必要です。LNP設計の最適化で一般的に使用される脂質とプロセス因子に焦点を当て、空間充填設計を採用し、最近開発された自己検証アンサンブルモデル(SVEM)の統計的フレームワークを利用することにより、混合プロセス実験の設計と分析で従来発生する多くの困難を回避するステップを提供します。ワークフローは、候補となる最適な定式化の作成に加えて、結果の解釈を簡素化する適合統計モデルのグラフィカルな要約も構築します。新たに同定された候補製剤は、確認ランで評価され、オプションで、より包括的な第2相試験のコンテキストで実施することができます。

概要

in vivo遺伝子送達システム用の脂質ナノ粒子(LNP)製剤は、一般に、イオン化性脂質、ヘルパー脂質、およびPEG脂質のカテゴリーからの4つの構成脂質を含む¹、^2、3。これらの脂質が単独で研究されているか、他の非混合因子と同時に研究されているかにかかわらず、これらの製剤の実験では、候補製剤が与えられた場合、脂質のいずれか1つの比率を増減すると、必然的に他の3つの脂質の比率の合計が対応する減少または増加するため、「混合」設計が必要です。

説明のために、ベンチマークとして扱われるセットレシピを現在使用しているLNP製剤を最適化していると想定されています。目標は、LNPの効力を最大化すると同時に、二次的に平均粒子サイズを最小限に抑えることを目指すことです。実験で変化する研究要因は、4つの構成脂質(イオン化可能、コレステロール、DOPE、PEG)のモル比、N:P比、流速、およびイオン化可能な脂質タイプです。イオン化性脂質およびヘルパー脂質(コレステロールを含む)は、PEGよりも広い範囲のモル比、10〜60%にわたって変化することが許容され、この図では1〜5%から変化する。ベンチマーク定式化レシピと他の要因の範囲、およびそれらの丸め粒度は、補足ファイル1で指定されています。この例では、科学者は1日に23回の実行(粒子の一意のバッチ)を実行でき、最小要件を満たしている場合はそれをサンプルサイズとして使用したいと考えています。この実験のシミュレーション結果は、補足ファイル2および補足ファイル3に記載されています。

RampadoとPeer⁴は、ナノ粒子ベースのドラッグデリバリーシステムの最適化のための設計された実験のトピックに関する最近のレビュー論文を発表しました。Kauffmanら⁵は、分数要因と決定的スクリーニング計画を用いたLNP最適化研究を検討しました⁶。ただし、これらのタイプの計画は、非効率的な「スラック変数」⁷の使用に頼らずに混合制約条件に対応することはできず、混合因子が存在する場合は通常使用されません^7,8。その代わりに、混合制約を組み込むことができる「最適設計」が、伝統的に混合プロセス実験⁹に使用される。これらの計画は、ユーザーが指定した分析因子の関数を対象としており、この関数が分析因子と応答の間の真の関係を捉える場合にのみ(考えられる多くの意味の1つで)最適です。本文には「最適設計」と「最適製剤候補」の区別があり、後者は統計モデルによって特定された最良の製剤を指すことに注意してください。最適設計には、混合プロセス実験の3つの主な欠点があります。第一に、科学者がターゲットモデルを指定するときに研究因子の相互作用を予測できない場合、結果として得られるモデルは偏りがあり、劣った候補定式化を生み出す可能性があります。第2に、最適計画では、ほとんどの実行が因子空間の外部境界に配置されます。LNP研究では、脂質またはプロセス設定の極端で粒子が正しく形成されない場合、これにより多数のランが失われる可能性があります。第三に、科学者は、モデルに依存しない応答曲面の感覚を得て、因子空間のこれまで未踏の領域でプロセスを直接観察するために、因子空間の内部で実験を実行することを好むことがよくあります。

別の設計原理は、空間充填計画¹⁰で(混合拘束)因子空間の近似一様被覆をターゲットにすることです。これらの計画は、最適計画⁹ と比較して実験効率をいくらか犠牲にしますが(因子空間全体が有効な定式化につながると仮定します)、このアプリケーションで有用なトレードオフでいくつかの利点を提供します。空間充填計画では、応答曲面の構造について 先験 的に仮定することはありません。これにより、分析因子間の予期しない関係を柔軟に把握できます。これにより、目的のランサイズを調整するときに追加または削除する回帰項を決定する必要がないため、計画生成も合理化されます。一部の計画点(レシピ)が定式化の失敗につながる場合、空間充填計画により、研究因子の破損境界をモデル化すると同時に、成功した因子の組み合わせに対する研究応答の統計モデルもサポートできます。最後に、因子空間の内部カバレッジにより、モデルに依存しない応答曲面のグラフィカルな探索が可能になります。

混合プロセス実験の混合因子部分空間を視覚化するために、特殊な三角形の「三角プロット」が使用されます。 図 1 は、3 つの成分がそれぞれ 0 から 1 の範囲に許容される点の立方体で、成分の合計が 1 に等しいという制約を満たす点が赤で強調表示されます。3つの成分に対する混合制約により、実現可能因子空間が三角形に減少します。4つの混合成分を使用するLNPアプリケーションでは、他の脂質の合計を表す「その他」軸に対して一度に2つの脂質をプロットすることにより、因子空間を表す6つの異なる三元プロットを生成します。

図1:三角因子領域。 立方体内の空間充填プロットでは、小さな灰色の点は混合拘束条件と矛盾する定式化を表します。大きな赤い点は、立方体内に内接する三角形上にあり、混合制約が満たされる定式化を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

脂質混合因子に加えて、N:P比、緩衝液濃度、流速などの1つ以上の連続プロセス因子が存在することがよくあります。イオン化可能な脂質タイプ、ヘルパー脂質タイプ、またはバッファータイプなどのカテゴリー的要因が存在し得る。目標は、効力の尺度を最大化し、および/または粒子サイズとPDI(多分散指数)の最小化などの物理化学的特性を改善する製剤(脂質とプロセス要因の設定の混合物)を見つけることです、カプセル化率の最大化、および副作用の最小化- in vivo 研究で体重減少など。妥当なベンチマークレシピから始める場合でも、遺伝的ペイロードの変化を考慮して、またはプロセス因子や脂質タイプの変化を考慮する場合は、再最適化に関心があるかもしれません。

Cornell⁷ は、混合および混合プロセス実験の統計的側面に関する決定的なテキストを提供し、Myersら9は、最適化のための最も関連性の高い混合設計および分析トピックの優れた^{要約を提供します。} ただし、これらの作業は、統計的な詳細と専門用語で科学者を過負荷にする可能性があります。実験の計画と分析のための最新のソフトウェアは、関連する理論に訴えることなく、ほとんどのLNP最適化問題を十分にサポートする堅牢なソリューションを提供します。より複雑で優先度の高い研究は、統計学者とのコラボレーションの恩恵を受け、スペース充填設計ではなく最適な設計を採用する可能性がありますが、私たちの目標は、科学者の快適性レベルを向上させ、非効率的な1ファクターアットアタイム(OFAT)テスト¹¹ に訴えたり、単に仕様を満たす最初の製剤に落ち着くことなく、LNP製剤の最適化を促進することです。

この記事では、統計ソフトウェアを利用して一般的なLNP定式化の問題を最適化し、設計と分析の問題に遭遇する順序で対処するワークフローを紹介します。実際、この方法は一般的な最適化問題に対して機能し、LNPに限定されません。 その過程で、発生するいくつかの一般的な質問に対処し、経験とシミュレーション結果に基づいた推奨事項を提供します¹²。最近開発された自己検証アンサンブルモデル(SVEM)¹³ のフレームワークは、混合プロセス実験の結果を分析するための他の脆弱なアプローチを大幅に改善し、このアプローチを使用して、製剤最適化のための簡素化された戦略を提供します。ワークフローは、他のソフトウェアパッケージを使用しても従うことができる一般的な方法で構築されていますが、JMP 17 Proは、混合プロセス実験の難解な分析を簡素化するために必要であることが判明したグラフィカルな要約ツールとともにSVEMを提供するという点でユニークです。その結果、JMP固有の命令もプロトコルで提供されます。

SVEMは、従来のアプローチと同じ線形回帰モデル基盤を採用していますが、前方選択またはペナルティ付き選択(なげなわ)ベースアプローチのいずれかを使用することで、候補効果の「フルモデル」に適合するために必要な面倒な変更を回避できます。さらに、SVEMは、データに現れるノイズ(工程と分析的分散)を組み込む可能性を最小限に抑える、改善された「縮小モデル」適合を提供します。これは、モデル¹³、14、^15、16、^17、18の各実行の相対的な重要度を繰り返し再重み付けした結果^、予測されたモデルを平均化することによって機能します。SVEMは、従来のシングルショット回帰よりも実装が容易で、より高品質の最適な製剤候補が得られる混合プロセス実験をモデル化するためのフレームワークを提供します^12,13。SVEMの数学的詳細はこのホワイトペーパーの範囲を超えており、関連する文献レビューを超えた大まかな要約でさえ、このアプリケーションの主な利点である、開業医にとってシンプルで堅牢で正確なクリックツーラン手順を可能にします。

提示されたワークフローは、医薬品開発に対するクオリティ・バイ・デザイン(QbD)¹⁹ アプローチと一致しています²⁰。研究の結果、材料属性とプロセスパラメータを臨界品質属性(CQA)²¹にリンクする機能的関係が理解されます。Daniel et ^al.22 は、RNAプラットフォーム生産に特化したQbDフレームワークの使用について議論しています:私たちのワークフローは、このフレームワーク内のツールとして使用できます。

プロトコル

代表的な結果のセクションに記載されている実験は、実験動物の世話と使用のためのガイドに従って実施され、手順は、施設動物管理使用委員会(IACUC)によって確立されたガイドラインに従って実行されました。6〜8週齢の雌Balb/Cマウスを商業的に入手した。動物は、標準的な固形飼料と水を 自由摂取 し、湿度40〜60%、温度65-75°F(~18-23°C)で、12時間の明暗サイクルの標準条件下で飼育した。

1.研究の目的、回答、および要因を記録する

注:このプロトコルでは、JMP 17 Proを使用して実験を計画および分析します。同等のソフトウェアは、同様の手順に従って使用できます。セクション1で実行されるすべての手順の例と詳細な手順については、 補足ファイル1を参照してください。

1. 実験の目的を日付スタンプ付きのドキュメントにまとめます。
2. 実験中に測定される一次応答(CQA)をリストします。
3. 測定される可能性のある二次応答(物理化学的特性に対する下流の制限など)をリストします。
4. 調査の目的に最も関連するものを含め、回答に関連する可能性のあるプロセスパラメータをリストします。
5. 調査が複数日にわたって実行される場合は、日カテゴリカル「ブロッキング」因子を含めます。
   注: これにより、工程平均の日レベルのシフトが分析因子と交絡するのを防ぐために、日数にわたって因子設定のバランスが取れます。
6. 分析中に変動させる因子と一定に保つ因子を選択します。
   注:故障モード影響分析²⁰ などのリスク優先順位付けツールを使用して、最も関連性の高い要因のサブセットを選択します(図2)。通常、すべての脂質は変化させる必要があります。予算に制約のあるケースでは、PEGを固定比率でロックするのが合理的です。
7. さまざまな要因の範囲と、それぞれに関連する 10 進数の精度を確立します。
8. 最小ヒューリスティックと最大ヒューリスティックを使用して、スタディデザインのサイズ(パーティクルの一意のバッチの数)を決定します。手動で含めた制御ベンチマークの実行は、ヒューリスティックで推奨される実行サイズにはカウントされません。
   注: 以下のヒューリスティックは、応答が連続的であることを前提としています。最小ヒューリスティックは、候補の最適な製剤の確認実行を実行することに加えて、必要に応じてフォローアップ研究を実行できることを前提としています。確認実行の実行のみが可能な場合は、最大ヒューリスティックから取得される実行数の予算を立てることをお勧めします。2値一次応答の場合は、統計学者に助けを求めて、適切な実行回数を決定します。
   1. 最小ヒューリスティック: 混合因子ごとに3回、連続工程因子ごとに2回、各カテゴリ因子の水準ごとに1回の実行を割り当てます。
      注: 4つの脂質因子、2つの連続変数、および1つの3元カテゴリ過程変数を含む研究の場合、これは(3 x 4)+(2 x 2)+ 3 = 19のスペース充填実行の提案につながります。定式化または測定の問題が原因で失敗する可能性がある場合は、実行を追加します。
   2. 最大ヒューリスティック: 最適な計画を構築するためのソフトウェアを起動し、2次に必要なパラメータ(主効果、すべての効果間の二元交互作用、連続工程因子の2次効果を含む)を入力します。ソフトウェアのアルゴリズムに従って最小実行サイズを計算します。ソフトウェアから取得した結果に 1 を加算して、最大ヒューリスティックを定義します。
      メモ: これらの手順を実行するための詳細な手順については、 補足ファイル 1 を参照してください。4つの脂質因子(2つの連続変数と1つの3元カテゴリプロセス変数)を持つサンプルケースでは、推奨実行サイズは34(ソフトウェア推奨から33 + 1)になります。これを超える実行は、確認またはフォローアップ研究に使用する方が適切である可能性があります。

図2:原因と結果の図。この図は、LNP定式化最適化問題の一般的な要因を示しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

2. 空間充填設計による設計テーブルの作成

1. JMPを開き、メニューバーをDOE>特殊目的>空間充填計画に移動します。
2. 試験の回答を入力します( 補足ファイル1を参照)。
3. オプション: 「応答の追加」をクリックして、それぞれを最大化、最小化、またはターゲットにするかどうかを示す追加の 応答の列を追加します。
   メモ : これらの設定は後で変更でき、デザインには影響しません。同様に、設計テーブルの作成後に、追加の応答用の列を追加できます。
4. 分析因子と対応する範囲を入力します。 混合 因子を追加するには混合ボタン、 連続 因子を追加するには連続ボタン、カテゴリ 因子を追加するにはカテゴリカル ボタンを使用します。
   注:この例の研究では、 イオン化可能なモル比(0.1〜0.6の範囲)、ヘルパーモル比(これも0.1〜0.6)、コレステロールモル比(0.1〜0.6)、PEGモル比(0.01〜0.05)、およびイオン化可能な脂質タイプ(H101、 H102、またはH103)。
5. 計画の所定の実行数を 実行数 フィールドに入力します。
6. オプション: [ 平均クラスタ サイズ ]をデフォルトの 50 から 2000 に増やすには、[ 空間充填設計] ヘッダーの横にある赤い三角形のメニューと[ 詳細オプション ]サブメニューを使用します。
   注: これは、スペース充填アルゴリズムの設定であり、追加の計算時間を犠牲にして、設計構築をわずかに改善することができます。
7. 選択した因子と実行サイズの空間充填計画表を生成します。「 高速フレキシブル充填」をクリックし、「 表を作成」をクリックします。
   メモ : サンプル デザインの最初の 2 つの実行を 図 4 に示します。
8. 手動で作成した実行に注釈を付けるための [メモ ] 列をテーブルに追加します。最初の空の列ヘッダーをダブルクリックして列を追加し、新しい列ヘッダーをダブルクリックして名前を編集します。
9. 該当する場合は、ベンチマーク制御の実行を設計テーブルに手動で組み込みます。コントロールベンチマークの1つの複製を含めます。 [メモ ] 列にベンチマーク名をマークし、グラフを簡単に識別できるようにベンチマークレプリケート行を色分けします。
   1. 最初の空の行ヘッダーをダブルクリックして新しい行を追加し、ベンチマーク係数の設定を入力します。この行を複製して、ベンチマークのレプリケートを作成します。両方の行を強調表示し 、[行] > [色] に移動して、グラフ作成用の色を割り当てます。
      注記: 反復は、モデルに依存しない工程の推定値と分析的分散を提供し、追加のグラフィカルな洞察を提供します。
10. ベンチマークコントロールの実行が調査因子の範囲を超える場合は、将来の分析から除外するために、「メモ」列にその旨を記載してください。
11. 混合因子を適切な粒度に丸めます。そのためには、
    1. 混合因子の列ヘッダーをハイライト表示し、列ヘッダーの 1 つを右クリックして、[ 新しい数式列>変換>丸め...] に移動し、正しい丸め間隔を入力して、[ OK] をクリックします。
    2. 行ヘッダーと列ヘッダーの交点にある下部の三角形をクリックして、行が選択されていないことを確認します。
    3. 新しく作成した丸められた列から値をコピーし (Ctrl + C)、元の混合列に貼り付けます (Ctrl + V)。最後に、一時的な丸められた値の列を削除します。
12. 脂質比を丸めた後、混合因子の列ヘッダーを選択し、1つを右クリックして、[ 新しい数式列]>[合計>結合]に移動して、合計が100%に等しいことを確認します。いずれかの行の合計が1に等しくない場合は、混合因子の1つを手動で調整して、因子設定が因子範囲内に収まるようにします。調整が完了したら、合計列を削除します。
13. 混合因子の丸めに使用したのと同じ手順に従って、工程因子をそれぞれの粒度に丸めます。
14. 必要な小数点以下の桁数のパーセンテージで表示されるように脂質列をフォーマットします:列ヘッダーを選択して右クリックし、「 属性の標準化...」を選択します。次のウィンドウで、[ フォーマット ]を [パーセント ]に設定し、必要に応じて小数点以下の桁数を調整します。
15. ベンチマークなどの手動実行が追加された場合は、テーブルの行の順序を再ランダム化します:ランダムな値を持つ新しい列を追加します(最後の列ヘッダーを右クリックして、[ランダム]>[ランダム正規] >[新しい数式列]を選択します)。列ヘッダーを右クリックしてこの列を昇順に並べ替え、列を削除します。
16. 省略可能: [実行 ID ] 列を追加します。表の現在の日付、実験名、行番号を入力します。
    メモ:例については、(図5)を参照してください。
17. 三元プロットを生成して、脂質因子上の計画点を視覚化します(図6)。また、工程因子(図7)に対する実行分布を調べます: グラフ>三角プロットを選択します。 X、プロットの混合因子のみを選択します。
18. 工程因子の分布を調べるには、 >分布の分析 を選択し 、Y、列に工程因子を入力します。
    注:製剤科学者は、すべての実行の実現可能性を確認する必要があります。実行不可能な実行が存在する場合は、新しく検出された制約を考慮してデザインをリスタートします。

図3:因子と範囲を調べます。 実験ソフトウェア内の設定のスクリーンショットは、試験セットアップを再現するのに役立ちます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:空間充填計画の初期出力。 表の最初の2行を示すように、脂質量の合計が1になるようにしながら、設定を目的の精度に丸める必要があります。ベンチマークは手動でテーブルに追加されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:フォーマットされたスタディテーブル。 因子水準が丸められて書式設定され、実行ID列が追加されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:三角プロット上の計画点 23の製剤は、対応するイオン化可能、ヘルパー、および「その他」(コレステロール+ PEG)比の関数として示されています。中央の緑色の点は、イオン化可能(H101):コレステロール:ヘルパー(DOPE):P EGのベンチマーク33:33:33:1モル比を表しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図7:実験における非混合工程因子の分布。 ヒストグラムは、イオン化可能な脂質タイプ、N:P比、および流量にわたって実験の実行がどのように間隔を空けているかを示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

3. 実験の実行

1. 計画表で指定された順序で実験を実行します。実験テーブルに組み込まれたカラムに読み出しを記録します。
2. 同一の製剤バッチで同じ応答に対して複数のアッセイを実施する場合は、各バッチ内のこれらの結果の平均を計算します。各アッセイ測定の列をテーブルに追加します。
   1. 平均を取得するには、関連するすべての列を選択し、選択した列ヘッダーの1つを右クリックして、[ 新しい数式列]>[平均>結合]を選択します。この 平均 列は、将来の応答分析に使用します。
      注:レシピを新たに開始しない限り、反復アッセイ測定はアッセイの分散のみを検出し、独立した反復を構成するものではありません。
3. 製剤の沈殿または in vivo 忍容性の問題(重度の体重減少や死亡など)の発生を、問題の種類ごとに新しい列にバイナリ(0/1)インジケーターを使用して文書化します。

4. 実験結果の解析

1. 測定値をプロットし、応答の分布を調べる: グラフビルダー>グラフを開き、 各応答を個々のプロットの Y 領域にドラッグします。すべての応答に対してこれを繰り返します。
2. 色分けされたレプリケート実行間の相対距離を調べます (含まれている場合)。これにより、因子空間全体にわたる因子設定の変化による変動性と比較して、ベンチマークでの合計(工程および分析)変動を理解できます(図8)。
3. 生の応答をモデル化するか、代わりに変換を使用するかを決定します。正に制限されているが、上記で制限されていない応答(効力など)については、正規分布と対数正規分布の両方を実験結果に適合させます。対数正規分布が低いAICc(赤池の情報量基準を修正)によりよく適合する場合は、その応答の対数変換を行います。
   1. >分布の分析に移動し、Y、列の応答を選択します。結果の分布レポートで、応答名の横にある赤い三角形をクリックし、ドロップダウンメニューから連続適合>正規適合および連続適合>対数正規適合を選択します。後続の分布の比較レポートで、AICc値をチェックして、どの分布が応答によりよく適合するかを確認します。
   2. ログ変換を実行するには、応答列ヘッダーを右クリックし、[ 新しい数式列] > [ログ>ログ] を選択します。モデルが構築され、対数スケールの予測列が保存されたら、 新しい数式列>対数>経験を選択して、応答を元のスケールに戻します。
   3. 0と1の間に制限された比率応答について、正規分布とベータ分布の適合度を比較します。ベータ分布のAICcが低い場合は、ロジット変換を実行します。応答の分布レポートで、 連続適合>標準適合 および 連続適合>ベータ適合を選択します。
      1. ロジット変換の場合は、データテーブルの応答列ヘッダーを右クリックし、 専門分野>ロジット>新しい式列を選択します。モデル構築後、予測列を保存します。元のスケールに戻すには、[ 新しい数式列] > [専門分野] > [ロジスティック] を使用します。
         注: 回帰ベースのSVEM分析は、応答分布の正規性からの逸脱に対して頑健です。ただし、これらの変換により、結果の解釈が容易になり、モデルの適合度が向上します。
4. 三角プロットで実行をグラフ化します。応答(または変換が適用された場合は変換された応答)に従ってポイントに色を付けます: 三角プロット>グラフを開きます。 X、プロットの混合因子のみを選択します。結果のグラフのいずれかを右クリックし、[ 行の凡例 ] を選択してから、(変換された) 応答列を選択します。
   注: 応答に従って点を色分けすると、混合因子に関連する挙動のモデルに依存しない視覚的な視点が得られます。
5. 空間充填設計によって生成されたモデルスクリプトを削除します。
6. 分析因子の関数として各応答について独立したモデルを構築し、応答ごとに次の手順を繰り返します。
   注:二次バイナリ応答(製剤の失敗やマウスの死など)の場合は、この応答もモデル化します。目標分布の設定を「 正規 」から 「二項」に変更します。
7. すべての候補効果を含む「完全な」モデルを構築します。このモデルには、各因子の主効果、二元交互作用と三元交互作用、工程因子の2次および部分3次項、混合因子のScheffé三次項を含める必要があります^23,24。
   注: 各応答に同じ候補効果のセットを使用します。SVEMモデル選択手法は、各応答のモデルを個別に絞り込み、各応答に対して一意のモデルを削減する可能性があります。 図9 は、これらの候補効果のいくつかを示す。次のサブステップでは、このプロセスについて詳しく説明します。
   1. [モデルの当てはめ>]を選択します。
   2. ブロック要因(Dayなど)が他の研究要因と相互作用することを許可されていないことを確認します。ブロック要因を選択し、[ 追加]をクリックします。これらの要因は、後続のサブステップに含めないでください。
      注: ブロック因子はモデルで考慮することが重要ですが、ブロック因子が他のスタディ因子と相互作用することは許されません。ブロック因子の主な目的は、実験の変動性を制御し、実験の感度を向上させることです。
   3. すべての研究要因を強調表示します。 [度 ] フィールドの値を 3 に変更します (デフォルトでは 2 に設定されています)。 階乗から次数をクリックします。
      注: このアクションには、主効果と、モデル内の二元交互作用と三元交互作用が含まれます。
   4. 選択ウィンドウで非混合因子のみを選択します。[ マクロ] > [部分 3 次] をクリックします。
      注: この操作により、連続工程因子とモデル内の他の非混合因子との交互作用に2次効果が導入されます。
   5. 選択リストから混合因子のみを選択します。[ マクロ] > [シェフ キュービック] をクリックします。デフォルトの [インターセプトなし ] オプションを無効にします ( 図 9 を参照)。
      注: モデルに切片を含めることは、なげなわ法を使用する場合に不可欠な手順であり、前方選択のコンテキストでも役立ちます。SVEMアプローチなどの変更なしに、すべての混合主効果と同時に切片をフィッティングすることは、通常の最小二乗回帰手順¹²では実行できないため、従来のデフォルト設定である切片なしは通常使用されます。
   6. 応答列を指定する:応答列を強調表示して Yをクリックします。
   7. パーソナリティ設定を一般化回帰に変更します。[配布] を [通常] に設定したままにします。
   8. このモデル設定をデータテーブルに保存して、追加の応答で使用するには、[ モデル仕様 ]の横にある赤い三角形のメニューをクリックし、[ データテーブルに保存]を選択します。
8. SVEM前方選択法を適用して、混合因子の主効果を必須に含めることなく、縮小モデルを適合させ、予測式列をデータテーブルに格納します。
   1. [モデルの適合]ダイアログで、[実行]をクリックします。
   2. [ 推定方法]で、[ SVEM前方選択]を選択します。
   3. 「詳細コントロール」メニュー>「項を強制」メニューを展開し、混合の主効果に関連付けられているボックスの選択を解除します。[インターセプト用語] ボックスのみをオンのままにしておく必要があります。図 10 は、主な効果が強制される既定の設定を示しています。このステップでは、これらのチェックボックスをオフにして、前方選択手順に基づいてモデルがこれらの効果を含めたり除外したりできるようにする必要があります。
   4. [ 実行 ] をクリックして、SVEM 前方選択プロシージャを実行します。
9. SVEMモデルからの予測応答によって実際の応答をプロットし、合理的な予測能力を検証します。(図11)。 SVEM前方選択 の横にある赤い三角形をクリックし 、診断プロット>予測による実測プロットを選択します。
10. [SVEM 前方選択] の横にある赤い三角形をクリックし、[列を保存] > [予測式を保存] を選択して、データテーブルに予測式を含む新しい列を作成します。
11. オプション: 推定方法として SVEM Lasso を使用して上記の手順を繰り返し、後続の手順の実行後に別の最適レシピが提案されるかどうかを判断します。その場合は、両方のレシピを確認実行 (セクション 5 で説明) として実行し、プラクティス¹² でどちらが最適かを確認します。
12. 応答ごとにモデル構築手順を繰り返します。
13. すべての応答の予測列がデータ テーブルに保存されたら、プロファイラー プラットフォームを使用して、すべての予測応答列の応答トレースをグラフ化します。 [ グラフ > プロファイラー] を選択し 、前の手順で [Y]、[予測式] で作成したすべての予測列を選択し、[ OK ] をクリックします (図 12)。
14. 候補となる最適な処方を特定します。
    1. 各応答の「望ましさ関数」を定義し、応答を最大化、最小化、またはターゲットに一致させるかどうかを指定します。プライマリ応答は重要度の重み 1.0 を使用し、セカンダリ応答は重要度の重み 0.2 を使用するように設定します。 予測プロファイラー の赤い三角ボタンメニューから、[ 最適化と満足度] > [満足度関数] を選択し、[ 最適化と満足度] > [満足度の設定] を選択します。 後続のウィンドウに設定を入力します。
       注:重要な重みは相対的で主観的であるため、妥当な範囲内(たとえば、等しい重み付けから1:5の重み付けまで)の変化に対する組み合わせた最適の感度を確認する価値があります。
    2. プロファイラーに命令して、満足度関数を最大化する最適な因子設定を見つけます(図12):プロファイラーから、[ 最適化と満足度]>[満足度の最大化]を選択します。
       注: 最適な候補での応答の予測値は、効力などの右歪んだ応答の値を過大評価する可能性があります。ただし、確認の実行により、これらの候補製剤のより正確な観察が提供されます。主な目的は、最適な処方(最適なレシピの設定)を見つけることです。
    3. 最適な因子設定を記録し、各応答に使用される重要な重み付けを書き留めます: 予測プロファイラー メニューから、 因子設定>設定を記憶を選択します。
15. オプション: イオン化可能な脂質タイプなどのカテゴリ因子については、各因子水準に対して条件付きで最適な製剤を見つけます。
    1. 最初にプロファイラーで因子の目的のレベルを設定し、次にCtrlキーを押しながらその因子のグラフ内を左クリックして、因子設定のロックを選択します。最適化と満足度>望ましさの最大化を選択して、この係数を現在の設定にロックした条件付き最適値を見つけます。
    2. 続行する前に、因子設定のロックに使用したのと同じメニューを使用して、因子設定のロックを解除します。
16. (最適化 と望ましさ>望ましさの設定を使用して)応答の重要度の重みを調整した後、最適化プロセスを繰り返します。おそらく、一次応答のみを最適化するか、二次応答の一部を重要度の重み付けが多かれ少なかれ持つように設定するか、二次応答の目標を なし に設定します(図13)。
17. 新しい最適な候補を記録します (予測プロファイラーメニューから 因子設定 > 設定を記憶 を選択します)。
18. 因子空間の最適領域のグラフ要約を生成する: 許容因子空間内でランダムに生成された因子設定が50,000行のデータテーブルと、各応答および共同望ましさ関数の縮約モデルからの対応する予測値とともに生成されます。
    1. プロファイラーで、「 ランダムテーブルを出力」を選択します。シミュレート する実行回数を 50,000 に設定し、「OK」をクリックします。
       注: これにより、50,000 個の各定式化における応答の予測値を含む新しいテーブルが生成されます。 望ましさ列は、 ランダム表の出力 オプションが選択されたときに設定される応答の重要度の重みによって異なります。
    2. 新しく作成したテーブルに、Desirable Ability 列のパーセンタイルを計算する新しい列を追加します。この百分位数列を三角プロットで生の望ましさ列の代わりに使用します。[望ましさ] 列ヘッダーを右クリックし、[新しい数式列] > [分布>累積確率] を選択して、新しい累積確率 [望ましさ] 列を作成します。
    3. 次の手順で説明するグラフィックスを生成します。各応答と 累積確率[望ましさ] 列の予測を表示するために、グラフィックの配色を繰り返し変更します。
    4. 4つの脂質因子の三元プロットを作成します。表で、グラフ>三角プロットに移動し、X、プロットの混合因子を選択して、OKをクリックします。結果のグラフの 1 つを右クリックし、[行の凡例] を選択して、予測応答列を選択します。[色] ドロップダウンを [Jet] に変更します。
       注:これは、脂質因子に関して最高および最低のパフォーマンスの領域を表示します。 図14 は、 効力 の最大化(重要度=1)と サイズ の最小化(重要度=0.2)を考慮した場合の共同望ましさの百分位数を示し、三角プロット軸に示されていない因子を平均化しています。 図 15 は、生の予測サイズを示しています。また、これらのグラフを、ローカルデータフィルター(三 角プロットの横にある赤い三角形のメニューから利用可能)を使用してイオン化可能な脂質タイプごとに異なる三元プロットのセットを作成するなど、他の要因で条件付きで分類することも合理的です。
    5. 同様に、 グラフビルダー> を使用して、非混合工程因子に対して50,000個の色分けされた点(一意の定式化を表す)を個別にまたは共同でプロットし、応答と因子の間の関係を検索します。最も高い望ましさをもたらす因子設定を探します。グラフィック内の因子のさまざまな組み合わせを調べます。
       注: グラフに色を付ける場合は累積 確率[ 望ましさ]を使用しますが、工程因子に対して縦軸に望ましさをプロットする場合は、生の 望ましさ 列を使用します。 [望ましさ ] 列は、多変量探索用の他の 2 つのプロセス因子とともに、 グラフ>散布図の 3D ビジュアライゼーションの軸に配置することもできます。 図16 は、3つのイオン化可能な脂質タイプの各々で形成することができる全ての製剤の共同望ましさを示す。最も望ましい製剤はH102を使用し、H101はいくつかの潜在的に競争力のある代替品を提供します。
    6. プロファイラーとその記憶された設定をデータ テーブルに保存します。 「プロファイラー 」の横にある赤い三角ボタンをクリックし 、「スクリプト>データを表に保存...」を選択します。

図8:実験から観察された効力の読み取り値。 ポイントは、23回の実行から観察されたポテンシー値を示しています。複製されたベンチマークの実行は緑色で表示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図9:分析を開始するためのソフトウェアダイアログ。 候補効果がターゲットポテンシー応答とともに入力され、切片なしオプションがオフになっています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 10.SVEM オプションを指定するための追加のダイアログ。 デフォルトでは、脂質の主効果がモデルに強制されます。切片が含まれているため、効果を強制しないように、これらのチェックボックスをオフにすることをお勧めします。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図11:予測プロットによる実際の結果。 この図は、SVEMモデルによって各製剤について予測された値に対して観測された効力をプロットする。相関はこの例ほど強くする必要はありませんが、少なくとも中程度の相関関係を確認し、外れ値をチェックすることが期待されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 12: 予測プロファイラー。 グラフの上の2行は、最適な定式化(SVEMアプローチによって識別される)での予測応答関数のスライスを示しています。グラフの一番下の行は、定式化の重み付けされた「望ましさ」を示しており、これはグラフの最後の列の関数であり、効力を最大化し、サイズを最小化する必要があることを示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図13:SVEM-フォワードセレクションからの3つの最適な処方候補。 応答の相対重要度の重み付けを変更すると、さまざまな最適な定式化につながる可能性があります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図14:望ましさの百分位数の三項プロット。 プロットは、望ましさの百分位数によって色分けされた50,000の製剤を示し、ここで、望ましさは、効力を最大化するために1.0、サイズを最小化するために0.2の重要度重みで設定され、これらのプロットは、 製剤の最適領域がイオン化可能な脂質のより低いパーセンテージおよびより高いPEGパーセンテージからなることを示している。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図15:予測サイズの三角プロット。 プロットは、50,000の処方のそれぞれについてのSVEMモデルからのサイズ予測を示しています。サイズは、ヘルパー脂質の割合が高いほど最小化され、ヘルパーの割合が低いほど最大化されます。他の因子は50,000のプロットされた製剤間で自由に異なるため、これはこの関係が他の因子(PEG、流量など)の範囲にわたって成り立つことを意味します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図16:3つの異なるイオン化可能な脂質タイプを含む製剤の望ましさについてのバイオリンプロット。 50,000 個の各ポイントは、許容因子空間全体からの一意の定式化を表します。これらの分布のピークは、予測プロファイラーで分析的に計算される望ましさの最大値です。H102は最大のピークを有し、したがって最適な製剤を生成する。この出力を生成するモデルを構築するSVEMアプローチは、統計的に有意でない因子を自動的に除外します:このグラフの目的は、因子水準全体で実質的な有意性を考慮することです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

5. 確認実行

1. 以前に特定された最適な候補をリストした表を準備します(図17)。
   注:図17の真の効力と真のサイズの値は、シミュレートされた生成関数を使用して入力されます:実際には、これらはこれらのレシピのパフォーマンスを定式化してから測定することによって得られます。
   1. ベンチマーク コントロールを、定式化および測定される候補の実行のセットに含めます。
   2. 実験からの製剤のいずれかが望ましい結果をもたらすことがわかった場合、おそらくベンチマークを上回ることによって、候補表に追加する最良のものを選択し、新しい製剤とともに再テストします。
      注: 目的の実行を候補テーブルに手動で追加するか、プロファイラー ウィンドウの [記憶された設定 ] を使用します (これらの実行が前の実験からのものである場合)。実行の行番号を特定し、[ 予測プロファイル] > [因子の設定] > [行のデータ] に設定に移動して、行番号を入力します。次に、[ 予測プロファイラー] > [因子の設定] > [設定を記憶 ] を選択し、適切にラベル付けします ("ベンチマーク" や "前の実験のベスト ラン" など)。
   3. プロファイラーの [記憶された設定 ] テーブルを右クリックし、[ データ テーブルに作成] を選択します。
      注: 試験の優先度と予算に応じて、特にベンチマークを置き換える場合は、確認の実行ごとに反復を実行することを検討してください。各定式化を 2 回作成して分析し、平均結果をランク付けします。2回の反復で応答範囲が広い候補は、工程分散が大きいことを示している可能性があるため、注意してください。
   4. 予算の制約により必要に応じて、実験予算に一致するように、または冗長な候補を排除するために、特定された候補からダウンセレクトします。
2. 確認実行を実行します。定式化を構築し、読み出しを収集します。
3. 元のテストの結果と、ベンチマークやその他の繰り返しレシピの確認バッチの結果との整合性を確認します。大規模で予期しないシフトがある場合は、シフトの原因となった可能性があるものと、確認バッチからのすべての実行が影響を受けた可能性があるかどうかを検討します。
4. 候補の最適製剤の性能を比較します。新しい候補がベンチマークを上回ったかどうかを調べます。
5. オプション: 確認実行の結果を実験表に追加し、セクション4の分析を再実行します。
   注: ワークフローの次のステップでは、必要に応じて、これらの実行とともにフォローアップ スタディを構築するための手順を提供します。

図17:確認実行として実行される10の最適な候補の表。 真の効力と真のサイズは、シミュレーション生成関数から入力されています(プロセスや分析のバリエーションは追加されません)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

6. オプション: 確認実行と同時に実行されるフォローアップ調査の設計

1. 以下の基準を考慮して追跡調査の必要性を評価します。
   1. 最適な定式化が因子境界の1つに沿っているかどうか、および因子範囲の少なくとも1つを拡張するために2番目の実験が必要かどうかを判断します。
   2. 最初の実験で比較的小さいランサイズまたは比較的大きな因子範囲が使用されているかどうか、および追加の実行と更新された分析を使用して、特定された最適領域を「ズームイン」する必要があるかどうかを評価します。
   3. 追加の要素が導入されているかどうかを確認します。これは、追加のイオン化可能な脂質などのカテゴリー因子のレベル、または最初の研究で一定であった因子、例えば緩衝液濃度であり得る。
   4. 上記の条件のいずれも満たされない場合は、手順7に進みます。
2. 確認実行と同時に実行される追加の実験実行の準備をします。
   1. 因子限界を定義して、最初の分析の領域と部分的に重複するようにします。重複が存在しない場合は、新しいスタディを設計する必要があります。
   2. スペース充填設計で新しい実験ランを開発します。 [DOE >特殊目的>空間充填設計]を選択します。
      注記: 上級ユーザーの場合は、 DOE>カスタムデザインによるD-最適設計を検討してください。
   3. 空間充填の実行が生成されたら、新しい因子空間内にある元の実験から2つまたは3つの実行を手動で組み込みます。セクション 2 で説明されている手順を使用して実験テーブル内でこれらの実行をランダムに分散し、行を追加し、行の順序をランダム化します。
      注:これらは、ブロック間の応答平均のシフトを推定するために使用されます。
   4. 確認の実行と新しいスペース入力の実行を 1 つのテーブルに連結し、実行順序をランダム化します。 テーブルを使用して連結し> 、セクション 2 で説明されているように、新しいランダム列を作成して並べ替え、実行順序をランダム化します。
3. 新しいレシピを作成し、結果を収集します。
4. 新しい実験の実行と結果を元の実験データ表に連結し、各結果のソースを示す実験 ID 列を導入します。 [テーブル>連結 ] を使用し、[ ソース列の作成] オプションを選択します。
5. 各因子の列プロパティに両方のスタディで結合された範囲が表示されていることを確認します:各因子の列ヘッダーを右クリックし、 コーディング プロパティと 混合 プロパティの範囲(存在する場合)を調べます。
6. 新しい実験の結果の分析を開始します。
   1. 実験 ID 列をモデル内の用語として含めて、ブロック要因として機能します。この項が研究要因と相互作用しないようにしてください。セクション4の表に保存された モデルの適合 ダイアログスクリプトを実行し、実験ID列 を選択して追加をクリックし 、候補効果のリストに含めます。
   2. 連結されたデータテーブルでこの モデルの適合 ダイアログを実行して、新しい実験と最初のスタディの結果を共同で分析します。以前の手順に従って、更新された最適な製剤候補とグラフィカルな要約を生成します。
   3. 検証のために、最初の実験の結果を除いて、新しい実験の結果を個別に分析します。すなわち、新しい実験テーブルに対してセクション4で説明した手順を実行する。
   4. これらのモデルによって特定された最適な定式化が、共同分析によって認識されたものと密接に一致していることを確認します。
   5. グラフの要約をレビューして、新しい実験結果の共同分析と個別分析の両方が類似した応答曲面挙動を示すことを確認します(つまり、応答と因子の間に同様の関係があることを意味します)。
   6. 一貫性を保つために、新しい結果の組み合わせ分析と個々の分析を最初の実験と比較します。比較に同様のグラフ構造を使用し、違いについて特定された最適なレシピを調べます。

7.研究の最終的な科学的結論を文書化する

1. 試験によりベンチマークコントロールが新たに同定されたレシピに変更された場合は、新しい設定をログに記録し、その原点を記録する設計ファイルと解析ファイルを指定します。
2. 将来の参照のために、すべての実験表と分析サマリーを、できれば日付スタンプ付きのファイル名で維持します。

結果

このアプローチは、MC3様古典脂質とリピドイド(C12-200など)の両方に広く分類され、一般的にコンビナトリアルケミストリーに由来します。One Factor at a Time(OFAT)法を使用して開発されたベンチマークLNP製剤と比較して、当社のワークフローを通じて生成された候補製剤は、 図18のマウス肝ルシフェラーゼ測定値に示すように、対数スケールで4〜5倍の効力向上を示すことが...

ディスカッション

混合プロセス実験の設計と分析のための最新のソフトウェアにより、科学者は非効率的なOFAT実験を回避する構造化されたワークフローで脂質ナノ粒子製剤を改善できます。最近開発されたSVEMモデリングアプローチは、以前は無関係な統計的考察で科学者の注意をそらしていた可能性のある難解な回帰変更とモデル削減戦略の多くを排除します。結果が収集されると、SVEM分析フレームワーク?...

資料

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