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要約

ここでは、油中水型エマルジョン(プラグ)でコンビナトリアルライブラリを産生するためのポリジメチルシロキサン(PDMS)ベースの二重層デバイスの作製について説明します。プラグ製造の自動化に必要なハードウェアとソフトウェアがプロトコルに詳述されており、蛍光プラグの定量的ライブラリの製造も実証されています。

要約

液滴マイクロ流体工学は、化学的に異なるナノリットルコンパートメントで多数の反応を実行することを可能にする汎用性の高いツールです。このようなシステムは、単一細胞のインキュベーションからPCR反応の実施、ゲノミクスから化学合成まで、さまざまな生化学反応をカプセル化するために使用されてきました。マイクロ流体チャネルと制御バルブを結合することで、その開閉を制御することができ、それによって、ユニークな組成の液滴の集団からなる大規模なコンビナトリアルライブラリの迅速な生産が可能になります。この論文では、プラグと呼ばれる油中水型エマルジョンのコンビナトリアルライブラリを生成するために利用できる、圧力駆動のPDMSベースの二層マイクロ流体デバイスの製造と操作のためのプロトコルが提示されます。ソフトウェアプログラムとマイクロ流体ハードウェアを組み込むことにより、デバイス内の所望の流体の流れを制御および操作して、コンビナトリアルプラグライブラリを生成し、構成プラグ集団の組成と量を制御することができます。これらのプロトコルは、特に癌患者の生検からの細胞における薬物反応を研究するために、組み合わせスクリーニングを生成するプロセスを迅速化します。

概要

マイクロ流体工学は、マイクロチャネル内の少量の流体の操作を可能にします1。一般的なマイクロ流体デバイスの動作規模は数十から数百マイクロメートルであり、化学反応や生体反応を小型化できるため、比較的少量の試薬で反応を行うことができます。当初、マイクロ流体デバイスは、シリコン2やガラス3などの材料で製造されていました。それらはまだ使用されていますが 4、溶剤の適合性、製造コストの高さ、流体の流れの制御の統合の難しさなど、特定の問題を引き起こします 5,6。ソフトリソグラフィーと呼ばれるPDMSベースの製造方法は、デバイスのラピッドプロトタイピング7のための安価な代替手段を提供し、複雑な多層デバイス8を製造する手段を提供します。PDMS装置にバルブとポンプを追加することで、装置9,10内の流体の経路と速度を制御することができます。可逆的または不可逆的な方法でマイクロバルブを設計し作動させるいくつかの方法が開発されている - 例えば、熱作動するシリコンとアルミニウムから作られたバイメタルバルブ11、または電気化学反応から生成されたガスを使用して窒化ケイ素膜12を偏向させる。Guらは、点字ディスプレイの機械的ピンを使用してマイクロチャネルに圧力を加え、流れを調整することを実証しています13。人気を博しているマイクロバルブの1セットは、Stephen Quake14のグループによって開拓された空気圧PDMSベースのバルブです。通常、このようなバルブは、流路と制御路の2つの直交するマイクロチャネルで構成されています。制御チャネルを加圧すると、薄いPDMS膜が流路上で偏向し、流路を閉じて流体の流れを遮断します。減圧されると、膜が弛緩し、流路が開き、流体の流れを再開できます。PDMSバルブは、制御チャネルを複数回加圧および減圧できるため、堅牢で可逆的な方法で流量調整を可能にします15。さらに、このようなバルブは圧力を加えることによって作動させることができるので、デジタル制御と自動化16への道を開く。さらに、それらは同じ材料であるため、ソフトリソグラフィー技術8、17、18を使用してPDMSベースのデバイスの製造にシームレスに統合することができる。これらの機能により、PDMSバルブはマイクロ流体デバイスの流量調整に魅力的な選択肢となっています。Thorsenらは、このようなバルブの原理を使用して、流体マルチプレクサ(空気圧バルブの組み合わせアレイ)を設計し、20の制御チャネル19で約1000の入力流路に対処しました。この原理は、流体を選択的にインチップマイクロ流体ケモスタットに経路指定するように拡張され、各反応器20、21、22、23において固有の反応を同時に行うことができる。しかし、このようなマイクロリアクターは、限られた試薬の使用を最適化するのには有用ですが、複数の反応を並列化することはできず、ハイスループット研究には十分ではありません。

液滴マイクロ流体工学は、マイクロ流体デバイス24における非混和性の多相液体流の操作による液滴の生成を含むマイクロ流体工学のサブカテゴリである。液滴形成は、非混和性流体の導入による連続流体の分解を含み、界面エネルギーの不安定性およびエマルジョンの形成によるピンチオフをもたらす25。界面活性剤は、界面エネルギーを安定化させることにより、エマルジョンがマイクロチャネルを離れるときに丸みを帯びた液滴の形成を助ける26。プラグと呼ばれる大きな液滴は安定性が低く、1つ以上の非混和性液体27によって両側に間隔を空けた水性コンパートメントの配列として保持コンパートメント(チューブの長さなど)に収集することができる。小型化および区画化に加えて、液滴マイクロ流体工学は、多数の単分散液滴を生成することができるので、生物学的反応のスループットも向上させる - それぞれがナノリアクターとして機能する28。液滴は、いったん生成されると、分割29,30、融合31,32、選別33,34、および高次構造35,36への集合などのさらなる操作を受けることもできる。液滴マイクロ流体工学は、PCR37からシングルセルトランスクリプトミクス38、創薬39,40からウイルス学41、次世代シーケンシング42から化学合成43まで、いくつかの科学分野と技術に革命をもたらしました。

PDMSベースのソフトリソグラフィーとマイクロバルブを液滴技術と統合することは、マイクロチャネル内の流体の流れを調整し、その後の液滴含有量の制御を可能にする強力な組み合わせです。チャネルの開閉に応じて、それぞれが特定の組成を持つ液滴の異なる集団を生成することが可能です。このようなプラットフォームは、生化学反応を小型化し、区画化し、並列化することができ、したがって、組合せスクリーニング44に有用な技術となる。コンビナトリアルスクリーニングは、選択された試薬の何万もの組み合わせを生成して、既知の組成の個々の集団で構成されるライブラリを生成するハイスループットな方法です。コンビナトリアルスクリーニングは、細菌増殖阻害のための薬物と抗生物質の間の相乗効果を発見するために使用されてきました45。がん治療の分野では、コンビナトリアルスクリーニングを使用して、特定の患者に対する抗がん剤の組み合わせをテストし、それによって個別化治療を進歩させてきました46,47。Mathurらは、ハイスループット薬物スクリーニングにおけるトランスクリプトームの変化を評価するために、コンビナトリアルDNAバーコーディングアプローチを統合することにより、この技術を構築しました48。このように、コンビナトリアルスクリーニングは強力でありながら初期段階の技術であり、このようなスクリーニング手順を実行および容易にするために、多様なマイクロ流体技術の開発が必要である。

この原稿の目的は、油中水型プラグの組み合わせライブラリを生成できる二層マイクロ流体デバイスを製造するためのプロトコルの完全なセットを提示し、そのようなデバイスの操作に必要なハードウェアとソフトウェアを説明することです。流体の流れは、圧力制御されたPDMSベースの空気圧バルブを使用して調整され、カスタムLabVIEWプログラムによって制御されます。装置内の試薬の流れは、市販の圧力ポンプを使用して達成されます。プラグが3つの入口の内容物によって形成され、それぞれが水性試薬を含む8つの入口プロトタイプが提示される。水相は連続油相と出会い、プラグは周波数0.33HzのT字型接合部で製造されます。システムの機能は、蛍光プラグの3つの異なる集団を含む定量的ライブラリを作成することによって実証されます。この技術と一連のプロトコルは、ハイスループットスクリーニングを目的としたコンビナトリアルライブラリの迅速な作成に役立ちます。

プロトコル

1. ソフトリソグラフィ

注:マイクロ流体デバイスは、フロー層と制御層の2層で構成されており(図1A)、各層は、それぞれポジ型フォトレジストとネガ型フォトレジストを使用して、個別にパターン化されたウェーハから成形されます(フォトレジストと現像液の詳細については、 材料表 を参照)。

  1. フロー層のウェーハ作製は、以下のように行います。
    1. シリコンウェーハ(直径100 mm、<1-0-0>配向、525)を250°Cで一晩(12〜16時間)脱水します。
    2. スピンコーティングに進む前に、ウェーハを冷ましてください。ポジ型フォトレジストをウェーハの中心に3〜4mL塗布します。
    3. 1400rpm(344rpm/s)で40秒間回転し、45μmの特徴高さを得る。
    4. 温度上昇器を使用してホットプレートでソフトベークし、450°C/hの速度で35°Cから105°Cに上昇させます。 このステップは、マイクロファイバー組織に対しても実行して、直接接触を防ぎ、フォトレジストのバブリングを最小限に抑えることができます。ホットプレートからウェーハを取り外し、マイクロファイバー組織で冷まします。
    5. フロー層(エマルジョン面を下にして)に対応するフォトマスク(市販)をレジスト塗布したシリコンウェーハに置き、UVランプの下、10mW/cm2で、合計200mJ/cm2 になるまで露光します。
    6. 2つのホットプレート(1つは65°C、もう1つは95°C)を使用して、プレート上で露光後ベークをそれぞれ1分間と7分間行います。
    7. ポジ型フォトレジストの現像液を充填したシャーレにウェーハを移し替えて現像します。ウェーハを完全に沈めた状態でベンチトップシェーカーでペトリ皿を振って攪拌し、ウェーハが完全に現像され、特徴がはっきりと見えるまで、現像液を定期的に更新します。
    8. 脱塩水を使用してウェーハから残留レジストを洗い流し、実体顕微鏡でチャネル内に残留物がないか確認します。ウェーハを現像液に戻すか、マイクロピペットで現像液をウェーハに慎重に添加して、残留物を除去します。完了したら、窒素スプレーガンを使用してウェーハを乾燥させます。
    9. ウェーハを110°Cに設定したホットプレートに25分間置いて、ウェーハをリフローします。このプロセスにより、フィーチャーが丸みを帯びます。
    10. ステップ1.3で詳述したウェーハのシラン化に進みます。
      注:レジストを塗布する前に、シリコンウェーハにヘキサメチルジシラザン(HMDS)蒸着を行って、レジストとウェーハ間の接着性を向上させることもできます。
  2. 制御層のウェーハ作製を下記のように行います。
    1. 別のシリコンウェーハを取り、110°Cで15分間設定したホットプレートに置いて脱水します。
    2. ウェーハを取り出し、室温まで冷ましてからスピンコーティングを進めます。
    3. ネガ型フォトレジストをウェーハの中心に5mL塗布します。
    4. 次のスピンプロトコルを使用して、40 μmの特徴高さを取得します:500 rpm(100 rpm / s加速)で5秒、1400 rpm(300 rpm / s)で33秒、最後に300 rpm / sで5秒間0rpmに減速します。
    5. 65°Cと95°Cにそれぞれ1分間と15分間設定した2つの別々のホットプレートを使用してソフトベークします。ホットプレートからウェーハを取り外し、マイクロファイバー組織で冷まします。
    6. レジストコートしたウェーハに制御層(エマルジョン面を下にして)に対応するフォトマスク(市販品)を載せ、15mW/cm2に設定したUVランプで、合計露光量が250mJ/cm2 になるまで露光します。
    7. 2つのホットプレート(1つは65°C、もう1つは95°C)を使用し、ウェーハの露光後ベークをそれぞれ2分間、次に5分間行います。ホットプレートからウェーハを取り外し、マイクロファイバー組織で冷まします。
    8. ネガ型フォトレジストの現像液を充填したシャーレに4分間移し替えて現像します。開発者を更新し、さらに 4 分間プロセスを続けます。
    9. ウェーハをイソプロパノールですすぎ、残留フォトレジストを除去し、実体顕微鏡を使用してウェーハにチャネル内の残留物がないかチェックします。
    10. ウェーハを現像液に戻すか、マイクロピペットで現像液をウェーハに慎重に添加して、残留物を除去します。完了したら、窒素スプレーガンを使用してウェーハを乾燥させます。
    11. 完全に現像したら、95°Cにセットしたホットプレートにウェーハを10分間置いて、フォトレジストをハードベークします。
    12. 手順 1.3 で詳述されているように、シラン化に進みます。
  3. シラン化は、以下のように行ってください。
    1. ウェーハをデシケーターに入れます。ガラス瓶をデシケーターに入れ、1,1,3,3テトラメチルジシロキサンを4〜5滴加えます。
      注意:1,1,3,3テトラメチルジシロキサンは毒性はありませんが、可燃性です。他のシランも使用できますが、有毒である可能性があります。白衣、眼鏡、ニトリル手袋などの必要な個人用保護具(PPE)を着用しながら、ドラフト内でシラン化を行うことをお勧めします。
    2. 真空を15分間引き、デシケーターを12〜16時間密封して、シランがウェーハに堆積できるようにします。
    3. デシケーターを開けて、ガラス瓶を廃棄してください。ウェーハを清潔なペトリ皿に入れます。
  4. マイクロ流体デバイスの作製は、以下のように行います。
    注:以下のプロトコルは、以前の作品23から採用されています。
    1. フロー層用と制御層用の 2 つの独立した PDMS ソリューションを準備します。各溶液について、PDMSキットのベース剤と硬化剤をビーカーで混合し、ミキシングロッドを使用して撹拌します。対照層には10gのベース剤と0.5gの硬化剤(20:1の比率)が必要ですが、フロー層には40gのベース剤と8gの硬化剤(5:1の比率)が必要です。
    2. 溶液がガスフリーになるまで、デシケーターでPDMS溶液を脱気します。
    3. シラン化したフロー層ウェーハをホイルで覆われたシャーレに置き、対応するPDMS溶液をウェーハに注ぎます。ペトリ皿をデシケーターに戻し、真空を引いてさらに脱気します(約20分間)。
    4. シラン化した制御層ウェーハを、対応するPDMS溶液でスピンコートします。3〜4mLの溶液をウェーハの中心に注ぎ、408rpm/sで1500rpmで20秒間回転させます。ウェーハを閉じたペトリ皿の平らな面に20分間置きます。
    5. フロー層とコントロール層の両方を80°Cのオーブンに18〜20分間入れます。2つの層を定期的に監視して、硬化しているかどうかを確認します。層は、可鍛性がありながらもわずかに粘着性があるほど丈夫になったときに準備が整い、これにより2つの層間の結合が改善されます。
    6. フロー層ウェーハ上の各デバイスの周りのPDMSをメスで切り取ります。フィーチャに近づきすぎないようにし、フィーチャとPDMSの端の間に約2cmのスペースを空けてください。シリコンウェーハから剥がしたら、ほこりの汚染を防ぐために、機能側のテープでPDMSブロックを覆います。
    7. すべてのPDMSブロックを切り取ったら、対応する制御層ウェーハに1つずつ配置し、目視で大まかな位置合わせを行います。
    8. すべてのブロックが制御層の対応する領域に配置されたら、制御バルブが対応する流路上で重なるように各ブロックの位置を調整して、位置合わせを完了します。これは、実体顕微鏡の助けを借りて実行することもできます。
    9. 圧力を加えて、2つの層の間のエアポケットを取り除きます。エア ポケットがフィーチャ上またはフィーチャの近くにある場合は、圧力をかけているときにチャネルを折りたたまないように注意してください。
    10. デバイスを80°Cオーブンに入れ、12〜16時間接着します。各デバイスに100 gの重りを配置して、2つの層間の結合を改善します。
    11. ウェーハを取り出し、個々のデバイスを切り取ります。制御層ウェーハからデバイスを剥がし、フィーチャー側をテープで覆います。
    12. フィーチャー側を上に向けてカッティングマットの上に個々のデバイスを置き、フィーチャー側を上に向けて0.75mmの生検パンチを使用して、8つのフロー層入口、8つの制御層チャネル入口、オイル入口、および出口のそれぞれに穴を開けます。
    13. プラズマアッシャーに顕微鏡スライドと単一の装置を装着し、テープを剥がし、機能面を上に向けてください。30Wの出力で酸素プラズマアッシングを20秒間実行します。
    14. 灰化が完了したらすぐにデバイスとスライドガラスを取り出し、フィーチャー面を下にしてスライドに置きます。PDMSとガラスの接着は、肉眼ですぐに見えるはずです。エアポケットのある領域に圧力を加えて、空気を絞り出します。
    15. PDMSとガラスの接着を改善するために、重りを上にして、110°Cに設定されたホットプレートにデバイスを60分間置きます。

2. ハードウェアのセットアップ

注:マイクロ流体デバイスへの接続の概略図を 図1B に示し、必要なハードウェアを使用したそのようなスキームの実現を 図2に示します。

  1. 空気圧バルブを以下のように設定します。
    注:チップ上のPDMSバルブを調整する各制御チャネルは、単一のソレノイドバルブによって制御されます。ここで紹介するプロトタイプは、8つの制御チャンネル(図1A)で構成されているため、8つのソレノイドバルブが必要です。
    1. ソレノイドバルブは、カスタムLabVIEWソフトウェアプログラム(メインインタフェースプログラム; 図3 、 補足ファイル1、補足ファイル2、補足ファイル3、補足ファイル4)。このプログラムは、TCP接続(Supplementary File 5、Supplementary File 6)を介してWAGOコントローラにMODBUSコマンドを送信します。イーサネットケーブルを使用して、WAGOデバイスをLabVIEWプログラムでコンピュータに接続します。電磁弁をWAGOコントローラーのポートに順番に接続します。より詳細な説明については、前述のプロトコル23を参照されたい。
    2. 1/4インチのチューブを使用してソレノイドバルブアレイを圧縮空気源に接続し、バルブアレイの圧力を3.5バールに設定します。このシステムでは、9〜16とマークされた8つのバルブが使用されました。
  2. 圧力調整器は、以下の説明に従ってセットアップします。
    注:流体の流れを制御するために、市販の圧力ポンプが使用されます(図2)。8ポートと4ポートのポンプセットを使用して、装置に8つの水性入口と2つのオイル入口を収容しました。各ポートの圧力は、メーカーが提供するソフトウェアを介して調整されます。
    1. 圧力ポンプを圧縮空気源に接続し、供給圧力がポンプで許容される最大圧力(8ポートコントローラと4ポートコントローラの両方で2.2バール)を超えないようにします。
    2. USBコネクタを使用して圧力ポンプをコンピューターに接続します。
    3. ポンプのスイッチを入れると、対応するソフトウェアに表示されます。ポンプのセットアップ中に圧力をゼロに設定します。
    4. オスのルアーを3/32インチのバーブコネクタに接続し、コントローラーの12個のメスのルアーロック出力ポートのそれぞれに接続します。
    5. ソフトチューブ(外径:3 mm、内径:1 mm、長さ:15 cm)をバーブに接続します。別のオスルアーを3/32インチのバーブコネクタに接続し、ソフトチューブのもう一方の端に接続します。
    6. ルアースタブ(23 G、0.5インチ)をバーブコネクタに接続します。この時点で、圧力調整器がセットアップされ、使用できるようになります。

3. マイクロ流体デバイスのセットアップ

  1. コントロールチャンネルのチューブを以下のように接続します(図2)。
    1. コントロールチャネルごとに、PolyTetraFluoroEthylene(PTFE)チューブ(外径:0.042インチ、内径:0.022インチ)を切断します。23 G、0.5インチのルアースタブのピンを一端に挿入します。
    2. ルアースタブをオスルアーの3/32インチバーブナイロンコネクタに接続します。コネクタのバーブをポリウレタンチューブの長さ(外径:4 mm、内径:2.5 mm)に挿入します。ポリウレタンチューブのもう一方の端をソレノイドバルブに直接接続します。
    3. シリンジに水を入れ、最後に23 G、0.5インチのルアースタブを接続します。
    4. PTFEチューブの自由端をこのシリンジに接続し、チューブの約半分まで水を注入します。
    5. チューブをシリンジから外し、チューブの自由端を対応する制御チャネルのパンチ穴に挿入します(図1A-C 1-8)。各制御チャンネルが対応するソレノイドバルブに接続されるまで繰り返します。
      注:この論文では、電磁弁9〜16をそれぞれC1 〜C8 に対応する制御チャネルに接続しました。これらは任意の方法で接続できますが、特にメインインターフェイスプログラムを操作するときは、接続の順序と順序を覚えておくことが重要です。
    6. メインインターフェースプログラム(図3)を使用して、すべてのソレノイドバルブを開きます (すべての制御チャネルを加圧します)。これにより、チューブからマイクロ流体デバイスの制御チャネルに流体が押し込まれ、それによって充填されます。加圧バルブと減圧バルブの例を 図4に示します。
  2. 試薬を接続し、以下の説明に従ってデバイスをプライミングします。
    1. メインインタフェースプログラムの[ Pressurize all Control Channels](すべてのコントロールチャネルを加圧 する)ボタンを押して、すべてのコントロールチャネルが加圧されていることを確認します(図3)。
    2. 水性試薬ごとに、ポンプをマイクロ流体デバイス入口の入口に接続するのに十分な長さのPTFEチューブのセグメント(OD:0.042インチ、ID:0.022インチ)を切断します。チューブの1つを手順2.2.6のルアースタブに接続します。
    3. 必要な試薬をシリンジに充填し、最後に23 G、0.5インチのルアースタブを接続します。
    4. チューブがいっぱいになるまで、対応するPTFEチューブに試薬を注入します。試薬がポンプセットの出力ポートに入らないように注意してください。
    5. チューブの自由端をマイクロ流体チップの対応するインレットに挿入します。
    6. 付属のソフトウェアを使用して、各入口水溶液試薬に400 mbarの圧力を加えます。
    7. メインインターフェースプログラム(図3)を使用して、制御チャネルを個別に順次減圧し、すべての試薬がデバイスのT接合に到達したことを確認します。必要に応じて、ボックスのプログラムの対応するボタンを押して、個々のバルブを作動させます コントロールチャンネル手動加圧。
    8. オイル試薬について、手順3.2.3から3.2.5を繰り返します。各インレットオイル試薬に400mbarの圧力をかけます。
    9. デバイスからすべての空気が除去されるまで 、[Depressurize All Control Channels](すべての制御チャネルの減圧 )(図3)を押して、すべての制御チャネルを同時に減圧します。これは肉眼または顕微鏡で観察できます。
    10. [Pressurize All Control Channels](すべてのコントロールチャンネルを加圧)ボタンを押して、すべてのコントロールチャネルを加圧します(図3)。この段階で、すべての試薬が接続され、デバイスは準備が整い、使用できるようになります。
  3. 以下のように実験をプログラムし、実行します。
    1. メインインターフェイスプログラム(図3)の自動実験の入力として機能する補足ファイル7に示すように、生成する各プラグ母集団の組成、配列、および複製を.csvファイルにエンコードします。必要な制御チャンネルを、入口を開く必要がある場合は0でマークし、閉じる必要がある場合は1でマークします。.csvファイルの各行は、1 つの異なるプラグ母集団に対応します。
    2. [実験ファイル]タブの[フォルダ]ボタンをクリックして、.csvをメインインタフェースプログラムにロードします。
    3. 実験の反復(プラグの特定のシーケンスが生成される回数を決定するため)、減圧の時間(入口チャネルを開く必要があり、対応する制御チャネルを減圧する必要がある時間をミリ秒単位で決定するため)、加圧の時間(プラグポピュレーションのシーケンス間で入口を閉じる必要がある時間をミリ秒単位で決定するため)などの関連フィールドをプログラムに入力します。
    4. バーコードインレット(最大3チャンネル)セクションで、バーコード製造に対応するインレットチャンネルと、それらを開く必要がある期間(バーコードの時間(ミリ秒))を選択します。または、これらのバーコードは、補足ファイル 7 に示すように、入力.csvファイルにハードコードすることもできます。
    5. インレットオイル試薬の圧力を200mbarに下げます。
    6. 希望の長さのPTFEチューブ(OD:0.042インチ、ID:0.022インチ)をコンセントに接続して、プラグを収集します。均一なプラグ製造を確実にするために、収集用のプラグがあらかじめ充填された約100cmのチューブを使用してください。これは、チューブ内のプラグの収集によって加えられる出口の圧力差を中和するためです。
    7. Run Experimentを押してプログラムを開始し、生産を差し込んでください。
  4. 以下の説明に従って、データの記録と分析を実行します( 図5を参照)。
    注意: このセクションでは、蛍光プラグの分析方法について具体的に概説します。生成されるプラグの性質に応じて、このセクションは必要に応じて変更できます。
    1. シリンジにオイル(鉱油またはフッ素化オイル)を入れ、最後に23 G 0.5インチのルアースタブを接続します。シリンジをポンプに固定します。
    2. 充填された収集チューブの端の1つをシリンジのルアースタブに接続します。充填された収集チューブのもう一方の端を顕微鏡の対物レンズの上に取り付けます。
    3. 対物レンズ近くのチューブの端の下に廃棄物リザーバーを配置します。
    4. チューブの特定の領域に顕微鏡の焦点を合わせ、目的のチャンネルで蛍光を記録するように設定します。
    5. ポンプの流量を50μL/minに設定します。
    6. 蛍光チャンネルのビデオを.aviファイルとして記録します。
    7. 提供されたPythonスクリプト(補足ファイル8)を使用して.aviファイルを解析し、.aviファイルのフレームごとに事前定義された関心領域(ROI)の平均蛍光を抽出します(その例は 補足ファイル9に記載されています)。
    8. 付属のカスタマイズされたRスクリプト(補足ファイル10)を使用して条件を抽出し、生データとピーク高さをプロットします。
      注:この論文の分析には、補足ファイル10のRスクリプトを使用しました。このスクリプトでデータを切り取り、バーコードを使用して状態を検出し、個々のプラグとプロットのピーク高さを分析するために使用するカスタムメイドのR関数は、 補足ファイル11で提供されています。

代表的な結果

マイクロ流体チップの重要な特徴の1つはPDMSバルブであり、流体の流れを調整する能力は、デバイスの動作パラダイムに影響を与えるため、特徴付けられました。この目的のために、入口チャネルを通る蒸留水の流量(市販の流量センサを使用して測定)は、PDMSバルブを周期的に加圧(2000 msで3.5 bar)および減圧(1000 ms)しながら、異なる入力圧力の関数として記録されました(図6A)。バルブが作動したときに流量がゼロに低下することによって示されるように、バルブは入力圧力の約800mbarまで流体の流れを調整できることが観察されました(図6B-D)。これにより、このようなPDMSベースのバルブを使用して、チャネル内の試薬の流れを調節できることが実証されます。さらに、1200 mbarでは、流量がゼロに減少しないことからも明らかなように、入力圧力が高すぎてバルブが流量を調整することができません(図6E)。PDMSバルブの加圧と減圧の持続時間は変更できますが、現在の加圧(2000 ms)と減圧(1000 ms)の条件での流体の流れの変化率を計算しました。入力圧力が400mbarの場合、流量はそれぞれ1.26Hzと1.44Hzの速度でオンとオフを切り替えることができます(図6C)。

同様のコンビナトリアル・ハイスループット・マイクロ流体デバイスの以前の反復は、すべての流路に結合された廃棄物チャネルも組み込んでいた46,47。これらのデバイスは、一定の流量レジーム(試薬が一定の圧力ではなく一定の流量でデバイスに注入される)で操作され、廃棄物チャネルは、対応する入口チャネルが閉じられると開くようにプログラムされ、圧力の上昇を軽減しました。このようなチャネルは有用ですが、廃棄物チャネルの内容物がプラグ形成に寄与しないため、試薬の損失をもたらします。さらに、廃棄物チャネルの開閉を調整するために、追加の制御チャネル、したがって追加のポンプも必要です。ここで提示されたプロトタイプでは、廃棄物チャネルが取り除かれ、試薬の無駄を減らし、設計と運用の複雑さを縮小できる運用パラダイムが確立されました。これには、定流量モードではなく、定圧モードで水性試薬を注入することが含まれます。2つの領域をよりよく理解するために、バルブ作動中のチャネル内の圧力と流量の関係を(図6Aに示すのと同じセットアップを使用して)それぞれの場合で評価し、その結果を図7に示します。図7Aでは、蒸留水の流量を一定の圧力(300 mbar)で注入しながら測定し、バルブの作動中に流量がゼロに低下し、バルブを減圧すると流量が作動前のレベルに回復することが観察されました。しかしながら、一定の流量レジームでは、一定の流量(2.5μL/min;図7B)、バルブの作動は、流速がゼロに低下しないことで証明される、完全な入口閉鎖をもたらさず、チャネル内の圧力の上昇が観察されました。これは、廃棄物チャネルを開くことによって緩和される圧力です。一定の入力圧力領域により、バルブの作動時に背圧なしでデバイスを操作できるため、廃棄物チャネルが不要になるため、この領域がマイクロ流体チップの動作に採用されました。

マイクロ流体デバイスの機能を実証するために、蛍光プラグの定量的コンビナトリアルライブラリを生成しました。デバイスの8つの入口には、3つの水性試薬-4つの入口(I1私3, 私5, 私7)、3つの入口(I4私6, 私8)、青色染料(I2;バーコードとして機能する)-および2つのオイル試薬-入口Oのフッ素化オイル(FC-40)と鉱油(MO)1 とO2、それぞれ - プラグインされていました (図1A, 図8A).フッ素系油は、水性プラグが分散するキャリア相として機能し、鉱油はプラグの安定性を助け、プラグ内容物の壁への付着を最小限に抑え、プラグ間の相互汚染を最小限に抑えます46.3つの入口が1つのプラグ集団の構成に寄与するため、この構成は3つの異なる蛍光集団を生成することができます:FFF-3つのチャネルからのフルオレセイン、FFW-2つのチャネルからのフルオレセイン、および1つのチャネルからのフルオレセインと2つのチャネルからの水で構成されるFWW。このセットアップでは、FWW プラグを製造できる 12 の異なる条件 (3 つの入口の異なる組み合わせで製造されたプラグ ポピュレーション)、FFW プラグを製造できる 18 の異なる条件、FFF プラグを製造できる 4 つの異なる条件があります。したがって、チップは、それぞれ5つの異なる複製プラグと、それらを分離するバーコードプラグの5つの複製を使用して、これらの34の異なる条件を生成するようにプログラムされました。蛍光プラグ集団にバーコード集団、すなわち肉眼で見える色付きの(理想的には非蛍光性の)プラグのセット(この場合、青色染料に対応する入口チャネルと2つの蒸留水チャネルを開くことによって形成される)を散在させることが推奨される。これにより、ユーザーはプラグの破損や融合などの問題についてプラグの生産を監視でき、プラグの下流分析に役立ちます。したがって、合計340個のプラグ(170個の実験用プラグと170個のバーコードプラグ)が生成され、PTFEチューブに収集されました。 図8B.減圧時間は1000ms、加圧時間は2000msとした。プラグの蛍光と、異なる実験条件内および実験条件間でのそれらの変動性を分析し、その結果を 図8C、D. 図8C は、ステップ3.4.6で生成した.aviファイルのフレームあたりの蛍光を示し、考慮している34の実験条件を強調表示しています(青い線で区切られています)。条件内のピークの平均蛍光値は赤で示され、破線はその条件内の標準誤差を示します。各集団における全てのプラグのピークの高さは、各ピークで検出された最大蛍光からベースライン蛍光を差し引くことによって得られ、 図 8D.各条件の最後のピークは、T 接合部での試薬の混合により汚染されたプラグであったため、計算には使用しませんでした(プラグの蛍光はプラグ製造の逆順に記録されたため、製造中の最初のポピュレーションは分析中の最後のプラグです)。FFFプラグの高さ(平均=117、標準偏差=10)の約3分の1(平均=40.9、標準偏差=3.1)、FFWプラグの高さが約3分の2(平均=78.4、標準偏差=5)であることが明らかになった。これらの結果は、FFF/FFW/FWWプラグのさまざまな集団で予想される蛍光の割合と一致しており、デバイスの堅牢性とその機能を強調しています。

figure-representative results-3555
図1:デバイス設計とマイクロ流体セットアップの概略図 (A)チップのフロー層を青で示し、制御層を赤で示しています。合計8つのユニークな水性試薬が入口(I1-8)を通ってT字路に向かって流れ、そこで油入口(O1-2)からの油相に遭遇して、出口で集められたプラグを形成します。各入口流路は、固有の制御流路(C1-8)の制御下にあります。(B)マイクロ流体チップの概略図と、入口、制御チャネル、およびオイル試薬へのチューブ接続が、出口チューブとともに示されています。矢印は、チューブ内の流体の流れの方向を示します。挿入図は、PDMSバルブの動作原理を示しています。破線は、制御層がフロー層の下にあることを示します。この図は、Dubuc etal 49から修正されています。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

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図2:プラグ製造用のハードウェアセットアップの概略図。 圧力ポンプは、入口チャネル内の試薬(水性と油の両方)の流れを制御し、ソレノイドバルブはPDMSバルブの作動を制御します。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

figure-representative results-4719
図3:マイクロ流体デバイスを制御するためのメインインターフェースプログラム。 このカスタムメイドのプログラムにより、個々の空気圧バルブ(ホワイトパネル)を手動で加圧できます。また、完全な実験(青色パネル)の実行も可能で、目的のプラグポピュレーションとバルブの加圧時間や減圧時間などの必要なパラメータを含む.csvファイルを受け取り、どの制御チャネルが加圧されているか、加圧されていないかなど、実験の実行状況をリアルタイムで表示します。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

figure-representative results-5262
図4:圧力駆動バルブの作動。 (A)PDMSバルブ(水平)が減圧され、入口チャネル(垂直)が開いている、(B)PDMSバルブが加圧され、入口チャネルを閉じている明視野顕微鏡画像。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

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図5:データ記録設定の概略図。 収集チューブは、ポンプに取り付けられたオイルの入ったシリンジに接続されています。プラグは収集チューブを通って飛ばされ、画像/ビデオは蛍光顕微鏡を使用してキャプチャされます。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

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図6:特定の入力圧力での流量に対するバルブ作動の影響(A)マイクロ流体チャネル内の流量を監視するために使用されるハードウェアセットアップの概略図。(B)200 mbar、(C)400 mbar、(D)800 mbar、および(E)1200 mbarの異なる入力圧力で操作した場合のチャネル内の流量の応答。バルブ作動時間は、赤色の網掛け領域に示されています。すべての実験に蒸留水を使用しました。3つの独立した測定値の標準偏差は、緑色の網掛け領域で示されます。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

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図7:バルブ作動時の入口チャネル内の試薬の圧力と流量の関係(A)一定の入力圧力領域(300 mbar)バルブでは、バルブの作動時に流量がゼロに減少します。(B)一定の流量領域(2.5 μL / min)では、バルブの作動により、バルブが減圧されるまでチャネル内の圧力が急速に上昇します。バルブ作動時間は、赤色の網掛け領域に示されています。すべての実験に蒸留水を使用しました。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

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図8:蛍光プラグ集団の生成(A)異なる試薬の装置への接続を示す実験装置の概略図。略語:F =フルオレセイン、W =蒸留水、B =青色食用色素、FC-40 =フッ素化油、MO =鉱油。(B)プラグを含む収集チューブのサンプル写真。(C)解析から得られた生データは、指定された関心領域(ROI)で測定された平均蛍光強度と、ビデオファイルのフレーム番号を示しています。赤い線は、各条件(3つのインレットの特定の組み合わせで製造されたプラグの母集団)のピーク蛍光の平均を示し、破線は対応する標準誤差を示します。(D)さまざまな条件でのピークの高さの箱ひげ図。ドットは個々のピークに対応し、各条件のボックスは対応するピークの分布の第1四分位数から第3四分位数の範囲であり、太い線は中央値に使用されます。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:デバイス操作のメインインターフェイスプログラム。 制御チャネルを手動で加圧し、8インレットデバイスで自動実験を実行するための制御インターフェース。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル 2: 装置操作用の代替メイン・インターフェース・プログラム。 バーコード機能のない8インレットデバイスを実行するための制御インターフェース。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル3:グローバル変数を使用したLabVIEWサブプログラム メインインタフェースプログラムのサブVIは、メインインタフェースプログラム、つまり制御チャンネルのグローバル変数のステータスを一覧表示および表示します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル4: グローバル変数の値を保存するLabVIEWプログラムバルブの現在の状態を配列として保存するメインインタフェースプログラムのサブVIは、ユーザが30秒以上非アクティブな場合にバルブの同じ状態を維持するために使用されます。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル5:TCP(Transmission Control Protocol)LabVIEWプログラム メインインタフェースプログラムとWAGOコントローラ間のTCP接続を維持するためのサブVI。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル6: TCPグローバル変数LabVIEWサブプログラムTCP出力変数を格納するプログラム。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル7:自動実験を行うための入力。 この論文で詳述されているように、定量的蛍光プラグを製造するための実験を実施するためのプラグ集団の構成、配列、およびレプリカをエンコードした.csvファイル。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル8:蛍光プラグの母集団を分析するためのPythonスクリプト。 プラグ(.aviファイル)の記録から蛍光値を読み取るためのカスタムPythonスクリプト。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル9:プラグの蛍光分析の出力。 プラグの記録からの5x5 ROIの蛍光値を含むPythonスクリプトからの出力。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル10:出力ファイルを読み込むためのRプログラム。 この作業で使用したカスタムプログラムは、出力蛍光値を読み取り、生データ、ピーク高さ、および標準偏差をプロットします。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル11:蛍光データを解析・プロットするためのR関数。 1.蛍光値の生データをカットします、2。さまざまな実験条件を定義する、3.与えられた条件からピークを特定し、4.生データと検出された条件を重ねてプロットし、5.同定されたピークと生データが重なり合ってプロットされます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

この論文では、プラグと呼ばれる油中水コンパートメントにコンビナトリアルライブラリを自動生成するためのPDMSベースのマイクロ流体デバイスの製造と操作のための一連のプロトコルが提示されました。マイクロ流体工学と液滴技術の組み合わせは、少量の試薬を多数のコンパートメントにカプセル化する強力な技術を提供し、大規模なコンビナトリアルスクリーニングへの道を開きます。

以前に、マイクロ流体工学を使用して化学的に異なるコンパートメントを生成するためのいくつかの技術が説明されており、それぞれに利点と制限があります。Kulesaら50は、マイクロタイタープレートを使用して細胞をバーコードで液滴にカプセル化し、電場を使用してこれらの液滴を融合して組み合わせライブラリを作成する戦略について説明しました。このようなアプローチでは、多くの液滴の組み合わせを生成できますが、ワークフローで手動処理手順が必要になるため、制限があります。Tomasiら51 は、スフェロイド(自由浮遊細胞凝集体)を含む液滴を刺激液滴と融合させるマイクロ流体プラットフォームを開発し、それによってスフェロイド微小環境の操作を可能にしました。この方法は、細胞間相互作用や薬物の効果などの重要な現象の研究を可能にしますが、比較的スループットが低くなります。Eduatiら46 およびUtharalaら47 は、ハイスループットのコンビナトリアルライブラリを自動的に生成できるマイクロ流体バルブベースのプラットフォームを開発しました。しかし、これらの研究では、バルブは点字デバイスを使用して操作されるため、マイクロバルブとマイクロ流体チップの間の煩雑なアライメントステップが必要になります。このホワイトペーパーで説明するシステムの主な特徴は、入力チャネル内の流体の流れを調整するための空気圧PDMSバルブの実装です。これらのバルブはPDMSベースであるため、マイクロ流体チップの製造工程にかなりスムーズに組み込むことができます。さらに、外部ガス源を介して圧力を加えることで作動させることができるため、入口チャネル内の液体の流れを制御するための比較的簡単なオプションです。最後に、これらのバルブの加圧と減圧の持続時間と順序をプログラムできるため、高スループットの方法で異なるプラグ集団の製造を自動化できます。もう一つの重要な特徴は、入口からの試薬の注入に一定の圧力レジームを使用していることであり、これにより、一定の流量レジームで発生する圧力の蓄積を軽減するために、廃棄物チャネルの組み込みをオプトアウトすることができます。これにより、デバイスの設計が簡素化され、廃棄物チャネルのバルブを制御するための追加のバルブやハードウェアの必要性が減り、試薬の無駄が最小限に抑えられます。

PDMSを使用したデバイスの製造は比較的複雑ではありませんが、このようなデバイスの実装には、空気圧ソレノイドバルブ(PDMSバルブの作動を制御するため)、圧力ポンプ(入口およびオイル試薬の流れを制御するため)、ソフトウェアプログラム(ソレノイドバルブを調整するため)などの広範なハードウェア機器を使用する必要があります。これらは多額の投資を表しますが、このようなセットアップは、デバイスの正常な動作のための一貫性と信頼性を提供します。さらに、このプロトコルで概説されているハードウェアコンポーネントとアーキテクチャは、モジュラー方式でセットアップされます。したがって、一部のモジュールでは、コストを削減したり、特定のニーズに適合させたりするために、代替手段を使用できます。例えば、実用性、予算、可用性、および利便性に基づいて使用できるさまざまなポンプが存在する52,53,54。流体リザーバや温度調節器などの追加成分は、敏感な入口試薬23のために組み込むことができる。さらに、この設計は、特定の科学的ニーズに対応するためにスケールアップまたはスケールダウンできます。例えば、この論文では、8つのユニークな試薬を組み合わせてプラグを製造することができる8つのインレットプロトタイプについて説明します。これは、より多くのインレットとそれらのより大きな組み合わせを可能にする16インレットデバイスにアップスケールすることができます。その結果、インレットに対処するために追加の制御チャネルとソレノイドバルブが必要になりますが、そのようなプロトタイプを使用すると、より大きく、より多様な組み合わせライブラリを生成できます。最後に、この論文では、各プラグ集団は、マイクロ流体デバイスの8つの水性入口のうち3つを開くことによって生成されます。このような構成では、オイル試薬の圧力が約200 mbar、水性試薬の圧力が約400 mbarで、バルブの作動のみによって駆動されるプラグ製造の体制に対応することが観察されました。オイルに高い圧力をかけると、プラグの破壊が観察され、より低い圧力を加えるとプラグが融合しました。プラグ製造に最適な圧力領域は、プラグの形成に寄与する入口の数、流体の性質と粘度、チャネルの寸法など、さまざまな要因に依存し、必要に応じて最適化する必要があります。

定圧領域で動作することの欠点の1つは、粘度の異なる流体が一定圧力下で異なる流量を持つことです。したがって、入口を流れる水性試薬の粘度が同等であることを確認する必要があります。異なる粘度の流体を使用すると、入口チャネル内の流体の流れだけでなく、T接合部でのプラグ形成にも影響し、プラグ集団の構成が損なわれます。別の欠点は、T接合部の残留試薬によるプラグ集団の汚染です。デバイスが異なるプラグ集団の生産を切り替えると、各集団のシーケンスの最初/最後のプラグは、前または次の母集団によって汚染される傾向があります。これは、各母集団の余分な反復を生成し、分析中に汚染されたプラグを割り引くことで克服できます。最後に、製造および/または外部ソースの不整合(圧力変動)から生じる個々のデバイス間の変動の可能性もあります。この問題は、単一のマイクロ流体チップを複数回再利用し、組み合わせライブラリの完全な実行が単一のチップで実行されるようにすることで軽減でき、これらの不整合の影響を最小限に抑えることができます。

この論文で紹介したマイクロ流体デバイスとそれに付随する一連の操作プロトコルは、プラグの定量的な組み合わせライブラリの作成を実証するために使用されてきました。したがって、このプラットフォームは、ハイスループットな方法で、異なるプラグポピュレーションの組み合わせライブラリを迅速に生成できます。その結果、このような技術は、患者の生検サンプルに対する併用薬物スクリーニングを含むが、これらに限定されない様々なスクリーニング目的に使用することができ、これにより、生検から回収された少数の細胞を多数の液滴に分配し、抗癌薬の大規模な組み合わせで治療して、所与の患者サンプルに対する個々の治療を最適化することができ、したがって、個別化された癌治療を加速することができる46。48,55.

開示事項

F.E.はTheraMeのフリーランサーです!AGです。著者らは、競合する金銭的利害関係はないと宣言している。

謝辞

HMDS蒸気蒸着にご協力いただいたNanoLab TuEのStacey Martina氏に感謝いたします。この研究は、TU/eの複雑分子システム研究所(ICMS)とオランダ科学研究機構(NWO)の重力プログラムIMAGINE!(プロジェクト番号24.005.009)。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1,1,3,3 tetramethyldisiloxaneMerck Life Science NVMFCD00008256
4 channel digital input/output moduleWAGO Kontakttechnik GmbH750-504
AcetoneBoom LabsBOOMSKEUZW3
Analysis SoftwareEindhoven University of Technologyhttps://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE
AZ 40XT 11DMerck Life Science NV 212299 Positive photoresist 
AZ 726 MIF developerMerck Life Science NV10055824960Developer for positive photoresist
Biopsy Punch, Rapid CoreWorld Precision Instruments Germany, GMBH5045290.75 mm ID, W/Plunge
Blue food dyePMEFC1036
Controller end module WAGO Kontakttechnik GmbH 750-600
Ethernet Controller WAGO Kontakttechnik GmbH 750-881
FC-40Merck MilliporeF9755-100ML
Fluigent flow unitFluigentFLU-S-D
Fluigent pressure system Fluigent MFCS-EZ 0 - 2 bar
FluoresceinMerck Life Science NVMFCD00005050
Hot plate Torrey Pines Scientific HP61
Inverted microscope Nikon Instruments Eclipse Ti-E
IsopropanolBoom LabsBOOMSKEUZE3
LabVIEW (Software Version 20)Eindhoven University of Technologyhttps://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE/tree/main/LabVIEW_8_inlet_device_
VERSION_1		All files have been saved for LabVIEW version 20. It is advised to use this version or higher to open the files.
Luer stubs Instech Laboratories, Inc. LS2323 ga, 0.5"
Male Luer to barb connectors Cole Parmer 45505-32 3/32" ID
MasterFlex PTFE tubingAvator/VWR48634
Microscope SlidesVWR470150-480
Microscope slides,  PlainCorning2947-75X50
Mineral OilMerck Millipore330760-1L
mr DEV 600Micro resist TechnologyR815100Developer for negative photoresist
OvenThermo Scientific Heraeus T6P 50045757
Oxygen plasma asherQuorum TechnologiesK1050X
PhotomaskCAD/Art Services, Inc.
Photomask DesignEindhoven University of Technology (Adapted from Merten Lab, EPFL)https://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE/blob/main/8_inlet_JoVE_device_design.dwg
Pneumatic valve arrayFESTO1x 8 valve array, Normally closed valves
Silicon WafersSilicon Materials<1-0-0>, 100 mm diameter, 525 μm thickness
Single edge blades GEM Scientific
Soft tubingFluigent1 mm ID, 3 mm OD
Spin coater Laurell Technologies Corporation WS-650MZ-23NPPB
Stereo microscope Olympus Corporation SZ61
SU-8 3050Kayakli Advanced MaterialsY311075 1000L1GLNegative photoresist
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)Dow1317318
SyringeB Braun Injekt - F Fine Dosage Syringe10303002
UV-LED exposure systemIdonusUV-EXP150S-SYS
Vacuum pump Vacuumbrand GmbH MD1C
Weighing scales Sartorius M-prove

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