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摘要

本文介绍了一种基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的双层装置的制备，用于在油包水乳液（塞子）中生产组合库。该协议中详细介绍了自动化插头生产所需的必要硬件和软件，并且还演示了荧光插头定量库的生产。

摘要

液滴微流体是一种多功能工具，允许在化学性质不同的纳升室中执行大量反应。这种系统已被用于封装各种生化反应 - 从单细胞的孵育到PCR反应的实施，从基因组学到化学合成。将微流体通道与调节阀耦合可以控制其打开和关闭，从而能够快速产生由具有独特成分的液滴群体组成的大规模组合库。在本文中，提出了制造和操作压力驱动的基于PDMS的双层微流体装置的协议，该装置可用于生成称为塞子的油包水乳液的组合库。通过结合软件程序和微流体硬件，可以控制和操纵设备中所需流体的流动，以生成组合塞库并控制组成塞群的组成和数量。这些协议将加快生成组合筛选的过程，特别是用于研究癌症患者活检细胞中的药物反应。

引言

微流体允许在微通道1 中操纵少量流体。典型微流控装置的操作规模为数十至数百微米，这使得化学和生物反应的小型化成为可能，从而使这种反应能够使用相对少量的试剂进行。最初，微流体器件是用硅2 和玻璃3 等材料制造的。尽管它们仍在使用4，但它们带来了某些问题，例如溶剂兼容性、制造成本高以及难以集成流体流动控制5,6。基于PDMS的制造方法，称为软光刻，为器件的快速原型制作提供了一种廉价的替代方案7，并为制造复杂的多层器件提供了途径8。在PDMS设备中添加阀门和泵可以控制设备9,10中流体的路线和速度。已经开发了几种以可逆或不可逆方式设计和驱动微阀的方法 - 例如，由硅和铝制成的双金属阀，它们被热驱动11 或使用电化学反应产生的气体来偏转氮化硅膜12。Gu 等人演示了使用盲文显示器的机械销对微通道施加压力以调节流量13。一套广受欢迎的微阀是由 Stephen Quake14 团队开创的基于 PDMS 的气动阀门。通常，这种阀门由两个正交微通道组成 - 一个流量通道和一个控制通道。在对控制通道加压时，一层薄的PDMS膜在流道上偏转，将其关闭，从而中断流体流动。一旦减压，膜就会松弛，从而打开流道并允许流体恢复流动。因此，PDMS阀允许以稳健和可逆的方式进行流量调节，因为控制通道可以多次加压和减压15。此外，由于这种阀门可以通过施加压力来驱动，因此它们为数字控制和自动化开辟了途径16.此外，由于它们由相同的材料制成，因此可以使用软光刻技术将它们无缝集成到基于PDMS的设备的制造中8,17,18。这些特性使PDMS阀成为微流体设备中流量调节的有吸引力的选择。Thorsen 等人利用这种阀门的原理设计了一种流体多路复用器（气动阀的组合阵列），以处理具有 20 个控制通道的近千个输入流量通道19。该原理已扩展到选择性地将流体路由到芯片内微流体化学恒温器，以便可以在每个反应器中同时进行独特的反应20,21,22,23。然而，这种微反应器虽然可用于优化有限试剂的使用，但不能并行处理多个反应，因此不足以进行高通量研究。

液滴微流体是微流体的一个子类别，涉及通过操纵微流体装置中不混溶的多相液体流动来产生液滴24。液滴的形成涉及通过引入不混溶液体而使连续流体破裂，从而由于界面能的不稳定性和乳液的形成而导致夹脱25。当乳液离开微通道时，表面活性剂通过稳定界面能量来帮助形成圆形液滴26.较大的液滴（称为塞子）稳定性较差，可以作为水性隔室阵列收集在保持室（例如一段管子）中，这些水室在两侧间隔着一种或多种不混溶液体27。除了小型化和区室化之外，液滴微流控还提高了生物反应的通量，因为可以产生大量的单分散液滴 - 每个液滴都用作纳米反应器28。液滴一旦生成，也可以进行进一步的操作，例如分裂29,30、融合31,32、分选 33,34 和组装成高阶结构 35,36。液滴微流控已经彻底改变了多个科学领域和技术 - 从 PCR37 到单细胞转录组学38，从药物发现39,40 到病毒学41，从下一代测序42 到化学合成43。

基于PDMS的软光刻和微阀与液滴技术的集成是一种有效的组合，可以调节微通道中的流体流动，并随后控制液滴含量。根据通道的打开和关闭，可以产生不同的液滴群体，每个液滴都有特定的成分。这样的平台可以使生化反应小型化、区室化和平行化，因此是组合筛选的有用技术44。组合筛选是一种高通量方法，可生成数以万计的选定试剂组合，以产生由已知组成的单个群体组成的文库。组合筛选已被用于发现药物和抗生素之间对细菌生长抑制的协同作用45。在癌症治疗领域，组合筛查已被用于测试特定患者的抗癌药物组合，从而推进个性化治疗46,47。Mathur 等人基于这项技术，通过集成组合 DNA 条形码方法来评估高通量药物筛选中的转录组变化48。因此，组合筛查是一项强大而新兴的技术，需要开发多样化的微流体技术来执行和促进此类筛查程序。

本手稿的目的是提出一套完整的协议，用于制造能够生成油包水塞组合库的双层微流体设备，并描述运行此类设备所需的硬件和软件。流体流量使用基于PDMS的压力控制气动阀进行调节，而气动阀又由自定义的LabVIEW程序控制。设备中试剂的流动是使用市售的压力泵实现的。提出了一种八进样口原型，其中塞子由三个进样口的内容物形成，每个进样口都含有水性试剂。水相与连续油相相遇，塞子在频率为 0.33 Hz 的 T 形结处生产。该系统的功能通过生成包含三个不同荧光插头群的定量库来证明。这项技术和一套协议将有助于加快用于高通量筛选目的的组合文库的生产。

研究方案

1. 软光刻

注：微流控器件由两层组成，流动层和控制层（图1A），每层分别使用正极和负极光刻胶由单独图案的晶圆模制而成（有关光刻胶和显影剂的详细信息，请参阅 材料表 ）。

  1. 如下所述执行流动层的晶圆制造。
    1. 将硅晶片（直径100mm，<1-0-0>方向，525）在250°C下脱水过夜（12-16小时）。
    2. 让晶圆冷却，然后再进行旋涂。将 3-4 mL 的正极光刻胶涂在晶圆中心。
    3. 以 1400 rpm （344 rpm/s） 旋转 40 秒，以获得 45 μm 的特征高度。
    4. 使用温度斜坡在加热板上进行软烘烤，以 450 °C /h 的速度从 35 °C 增加到 105 °C。 此步骤也可以在超细纤维组织上进行，以防止直接接触并最大限度地减少光刻胶的冒泡。从加热板中取出晶圆，让它在超细纤维组织上冷却。
    5. 将与流动层（乳液面朝下）相对应的光掩模（商业生产）放在抗蚀涂层硅片上，并在紫外线灯下以 10 mW/cm 2 的速率曝光，直到总曝光达到 200 mJ/cm2 。
    6. 使用两个加热板 - 一个在65°C，另一个在95°C - 在板上进行暴露后烘烤 - 分别为1分钟和7分钟。
    7. 通过将晶圆转移到装有正性光刻胶显影剂的培养皿中来显影晶圆。在台式振荡器上摇晃培养皿，使晶圆完全浸没，搅拌培养皿，并定期刷新显影液，直到晶圆完全显影，并且可以清楚地看到特征。
    8. 使用软化水冲洗掉晶圆上的残留光刻胶，并在立体显微镜下检查通道内是否有任何残留物。通过将晶圆返回到显影液中或使用微量移液管小心地将显影剂添加到晶圆中来去除残留物。完成后，使用氮气喷枪干燥晶圆。
    9. 通过将晶圆放在设置为110°C的加热板上25分钟来回流焊晶圆。此过程会产生圆形特征。
    10. 按照步骤 1.3 中所述进行晶圆的硅烷化。
      注意：六甲基二硅氮烷 （HMDS） 气相沉积也可以在应用光刻胶之前在硅晶圆上进行，以提高光刻胶和晶圆之间的粘附力。
  2. 如下所述，为控制层执行晶圆制造。
    1. 取另一个硅晶片，将其置于设置在110°C的加热板上脱水15分钟。
    2. 取出晶圆并让其冷却至室温，然后再进行旋涂。
    3. 将 5 mL 的负极光刻胶涂在晶圆的中心。
    4. 使用以下自旋协议获得 40 μm 的特征高度：500 rpm（100 rpm/s 加速度）为 5 s，1400 rpm（300 rpm/s）为 33 s，最后以 300 rpm/s 减速至 0 rpm 5 s。
    5. 使用两个分别设置为 65 °C 和 95 °C 的独立加热板进行软烘烤 1 分钟和 15 分钟。从加热板中取出晶圆，让它在超细纤维组织上冷却。
    6. 将与控制层（乳液面朝下）相对应的光掩模（商业生产）放在抗蚀剂涂层的晶圆上，并将晶圆暴露在紫外灯下，设置为 15 mW/cm2，直到总曝光达到 250 mJ/cm2 。
    7. 使用两个加热板 - 一个在65°C，另一个在95°C - 并分别对晶圆进行2分钟和5分钟的曝光后烘烤。从加热板中取出晶圆，让它在超细纤维组织上冷却。
    8. 通过将晶圆转移到装有负性光刻胶显影剂的培养皿中来显影晶圆 4 分钟。刷新开发人员并继续该过程 4 分钟以上。
    9. 用异丙醇冲洗晶圆以去除残留的光刻胶，并使用立体显微镜检查晶圆沟道内是否有任何残留物。
    10. 通过将晶圆返回到显影液中或使用微量移液管小心地将显影剂添加到晶圆中来去除残留物。完成后，使用氮气喷枪干燥晶圆。
    11. 一旦完全显影，通过将晶圆放在设置为95°C的加热板上10分钟来硬烘烤光刻胶。
    12. 按照步骤 1.3 中所述进行硅烷化。
  3. 如下所述进行硅烷化。
    1. 将晶圆放入干燥器中。将一个玻璃瓶放入干燥器中，加入 4-5 滴 1,1,3,3-四甲基二硅氧烷。
      注意：1,1,3,3-四甲基二硅氧烷无毒，但易燃。可以使用其他硅烷，但它们可能有毒。建议在穿着必要的个人防护设备 （PPE） （如实验室外套、眼镜和丁腈手套）的情况下在通风橱中进行硅烷化。
    2. 拉真空 15 分钟，将干燥器密封 12-16 小时，让硅烷沉积在晶圆上。
    3. 打开干燥器并处理掉玻璃瓶。将晶圆放入干净的培养皿中。
  4. 如下所述进行微流控设备制造。
    注意：以下协议改编自以前的作品23。
    1. 准备两个单独的PDMS解决方案 - 一个用于流动层，另一个用于控制层。对于每种溶液，将PDMS套件的基础剂和固化剂混合在烧杯中，并使用混合棒搅拌。控制层需要10 g基础剂和0.5 g固化剂（20：1比例），而流动层需要40 g基础剂和8 g固化剂（5：1比例）。
    2. 在干燥器中对PDMS溶液进行脱气，直到溶液无气体。
    3. 将硅烷化流动层晶圆放入覆盖有箔纸的培养皿中，并将相应的PDMS溶液倒在晶圆上。将培养皿放回干燥器中，并拉动真空以进一步脱气（约20分钟）。
    4. 用相应的PDMS溶液旋涂硅烷化控制层晶圆。将 3-4 mL 溶液倒在晶圆中心，以 1500 rpm 和 408 rpm/s 的速度旋转 20 秒。将晶圆放在封闭培养皿中的水平表面上 20 分钟。
    5. 将流动层和对照层置于80°C的烤箱中18-20分钟。定期监测两层，检查它们是否固化。当它们足够坚韧以具有延展性但略带粘性时，这些层就准备好了，因为这改善了两层之间的粘合。
    6. 用手术刀在流态层晶圆上的每个器件周围切出PDMS。确保不要切得离特征太近，并在特征和 PDMS 的边缘之间留出大约 2 厘米的空间。从硅晶圆上分离后，在特征侧用胶带覆盖 PDMS 模块，以避免任何灰尘污染。
    7. 一旦所有PDMS模块都被切下，将它们一个一个地放在相应的控制层晶圆上，通过肉眼进行粗略对准。
    8. 在将所有模块放置在控制层上的相应区域后，调整每个模块的位置，使控制阀重叠在相应的流道上以完成对准。这也可以在体视显微镜的帮助下进行。
    9. 通过施加压力去除两层之间的气穴。如果气穴位于要素上或附近，请注意在施加压力时不要塌陷通道。
    10. 将设备放入80°C烤箱中，并让它们粘合12-16小时。在每个设备上放置 100 克重物，以改善两层之间的粘合。
    11. 取出晶圆并切下每个单独的设备。将器件从控制层晶圆上剥离，并用胶带覆盖特征侧。
    12. 将每个单独的设备放在切割垫上，特征面朝上，并使用 0.75 毫米活检打孔器为八个流层入口、八个控制层通道入口、进油口和出口中的每一个打孔，特征面朝上。
    13. 用显微镜载玻片和单个设备装入等离子离子分析仪，取下胶带，特征面朝上。以 30 W 的功率进行氧等离子灰化，持续时间为 20 秒。
    14. 灰化完成后，立即取出设备和载玻片，并将设备的特征面朝下放在载玻片上。PDMS和玻璃之间的粘附力应该立即用肉眼看到。对任何有气穴的区域施加压力，以将空气挤出。
    15. 将设备放在设置为110°C的加热板上60分钟，顶部放一个重物，以改善PDMS与玻璃的粘合。

2. 硬件设置

注：与微流体设备的连接示意图如图 1B 所示，使用必要硬件实现此类方案如图 2 所示。

  1. 如下所述设置气动阀。
    注意：调节芯片上的PDMS阀的每个控制通道又由单个电磁阀控制。这里展示的原型由八个控制通道组成（图1A），因此需要八个电磁阀。
    1. 电磁阀使用定制的LabVIEW软件程序（主接口程序; 图3 和 补充文件1、补充文件2、补充文件3、补充文件4）。该程序通过TCP连接（补充文件5、补充文件6）向WAGO控制器发送MODBUS命令。使用以太网电缆将WAGO设备连接到带有LabVIEW程序的计算机。继续将电磁阀按顺序连接到WAGO控制器上的端口。有关更详细的描述，请参阅先前描述的协议23。
    2. 使用 1/4 英寸管将电磁阀阵列连接到压缩空气源，并将阀阵列的压力设置为 3.5 bar。在该系统中，使用了标记为 9-16 的八个阀门。
  2. 如下所述设置压力调节器。
    注意：市售的压力泵用于控制流体流量（图 2）。一个八端口和一个四端口泵组用于容纳设备中的八个进水口和两个进油口。每个端口的压力都通过制造商提供的软件进行调节。
    1. 将压力泵连接到压缩空气源，确保提供的压力不超过泵允许的最大压力（八端口和四端口控制器均为 2.2 bar）。
    2. 使用 USB 连接器将压力泵连接到计算机。
    3. 一旦泵打开，它们应该在相应的软件中可见。设置泵时将压力设置为零。
    4. 将公鲁尔器连接到 3/32 英寸倒钩连接器，连接到控制器上的 12 个母鲁尔锁输出端口中的每一个。
    5. 将一根软管（外径：3 毫米，内径：1 毫米，长：15 厘米）连接到倒钩。将另一个公鲁尔连接到 3/32 in 倒钩连接器到软管的另一端。
    6. 将鲁尔短截线（23 G，0.5 in）连接到倒钩连接器。此时，压力调节器已设置好并可以使用。

3. 微流控装置设置

  1. 如下所述连接控制通道管道（图 2）。
    1. 对于每个控制通道，切割一段聚四氟乙烯 （PTFE） 管（外径：0.042 英寸，内径：0.022 英寸）。将 23 G， 0.5 的引脚插入鲁尔短管的一端。
    2. 将鲁尔短管连接到公鲁尔到 3/32 倒钩尼龙连接器。将连接器的倒钩插入一段聚氨酯管（外径：4 毫米，内径：2.5 毫米）。将聚氨酯管的另一端直接连接到电磁阀。
    3. 将注射器装满水，并在末端连接一个 23 G、0.5 英寸的鲁尔短管。
    4. 将PTFE管的自由端连接到该注射器，并注入水，直到大约穿过管子的一半。
    5. 从注射器上断开管子，并将管子的自由端插入相应控制通道的冲孔中（图1A-C 1-8）。重复上述步骤，直到每个控制通道都连接到其相应的电磁阀。
      注：本文中，电磁阀 9-16 分别连接到对应于 C1 至 C8 的控制通道。虽然这些可以以任何方式连接，但重要的是要记住连接的顺序和顺序，尤其是在操作主接口程序时。
    6. 使用主接口程序（图 3）打开所有电磁阀 （对所有控制通道加压）。这会将流体从管道中推入微流体装置的控制通道，从而将其填充。加压阀和减压阀的示例如图 4 所示。
  2. 如下所述连接试剂并灌注设备。
    1. 通过在主接口程序中按下 Pressurize all Control Channels 按钮，确保所有控制通道都已加压（图 3）。
    2. 对于每种水性试剂，切一段 PTFE 管（外径：0.042 英寸，内径：0.022 英寸），以将泵连接到微流体装置入口的入口。将其中一个管道连接到步骤 2.2.6 中的鲁尔短管。
    3. 用所需的试剂填充注射器，并在末端连接一个 23 G， 0.5 英寸的鲁尔短管。
    4. 将试剂注入相应的 PTFE 管中，直到管子装满。注意试剂不要进入泵组的输出端口。
    5. 将管道的自由端插入微流控芯片中的相应入口。
    6. 使用提供的软件对每个入口水试剂施加 400 mbar 的压力。
    7. 使用主接口程序（图 3）按顺序对控制通道进行减压，以确保所有试剂都已到达设备的 T 形接头。如果需要，通过按下盒子中程序上的相应按钮来启动各个阀门 控制通道 手动加压。
    8. 对油试剂重复步骤 3.2.3 至 3.2.5。对每种进油试剂施加 400 mbar 的压力。
    9. 通过按下减 压所有控制通道 （图 3）同时对所有控制通道进行减压，直到从设备中排出所有空气。这可以通过肉眼或显微镜观察到。
    10. 按 Pressureize All Control Channels 按钮对所有控制通道加压（图 3）。在此阶段，所有试剂均已连接，设备已启动并可以使用。
  3. 如下所述对实验进行编程和执行。
    1. 将要生成的每个插件群的组成、序列和重复编码到一个.csv文件中，如 补充文件 7 所示，该文件用作主接口程序中 自动实验 的输入（图 3）。如果对应于需要打开的入口，则用 0 标记必要的控制通道，如果需要关闭，则用 1 标记。.csv文件中的每一行对应于一个不同的插头组。
    2. 通过单击“实验文件”选项卡中的“文件夹”按钮，将.csv加载到“主界面”程序上。
    3. 在程序中输入相关字段，例如实验迭代次数（以确定给定的塞子序列产生多少次）、减压时间（确定入口通道需要打开多长时间以及相应的控制通道需要以毫秒为单位减压）、加压时间（以确定入口需要在塞子组序列之间关闭多长时间（以毫秒为单位）。
    4. 在 条形码入口 （最多 3 个通道）部分中选择与条形码生产相对应的入口通道以及它们需要打开的持续时间（条形码时间（毫秒））。或者，这些条形码也可以硬编码到输入.csv文件中，如 补充文件 7 所示。
    5. 将进油试剂的压力降低到 200 mbar。
    6. 在出口处连接所需长度的 PTFE 管（外径：0.042 英寸，内径：0.022 英寸）以收集塞子。为确保均匀的塞子生产，请使用大约 100 厘米的管子预填充塞子进行收集。这是为了中和出口处的压力差，这种压力差是由管道中的塞子收集所施加的。
    7. 按 Run Experiment 启动程序并插入生产。
  4. 如下所述执行数据记录和分析（见 图 5）。
    注意：本节专门概述了一种分析荧光插头的方法。根据生成的插头的性质，可以根据需要更改此部分。
    1. 在注射器中注入油（矿物油或氟化油），并在末端连接 23 G 0.5 鲁尔短管。将注射器固定在泵上。
    2. 将填充的收集管的一端连接到注射器上的鲁尔管。将填充的收集管的另一端固定在显微镜的物镜上方。
    3. 在靠近物镜的管道末端下方放置一个废物储存器。
    4. 将显微镜聚焦在管子的给定区域，并将其设置为在所需通道中记录荧光。
    5. 将泵的流速设置为 50 μL/min。
    6. 将荧光通道的视频录制为.avi文件。
    7. 使用提供的 python 脚本（补充文件 8）分析 .avi 文件，以提取 .avi 文件每帧预定义感兴趣区域 （ROI） 的平均荧光（补充 文件 9 中给出了示例）。
    8. 使用提供的自定义 R 脚本（补充文件 10）提取条件并绘制原始数据和峰值高度。
      注：本文使用补充文件 10 中的 R 脚本进行分析。 补充文件 11 中提供了此脚本中用于切割数据、使用条形码检测条件以及分析单个插头和绘图的峰高的定制 R 函数。

代表性结果

微流控芯片的关键特征之一是PDMS阀，其调节流体流动的能力被表征为影响设备的操作范式。为此，在定期加压（3.5 bar，2000 ms）和减压（1000 ms）PDMS阀门的同时，通过入口通道的蒸馏水流速（使用商用流速传感器测量）被记录为不同输入压力的函数（图6A）。据观察，阀门能够调节流体流量，直到大约 800 mbar 的输入压力，如阀门启动时流量降至零所示（图 6 BD）。这验证了使用这种基于 PDMS 的阀门来调节通道内的试剂流量。此外，在 1200 mbar 时，输入压力太高，阀门无法调节流量，流量不会降至零（图 6E）。虽然可以修改PDMS阀的加压和减压持续时间，但计算了当前加压（2000 ms）和减压（1000 ms）条件下的流体流动率。对于400 mbar的输入压力，可以分别以1.26 Hz和1.44 Hz的速率打开和关闭流量（图6C）。

类似的组合高通量微流控设备的先前迭代还包含了一个耦合到每个流道的废物通道46,47。这些装置在恒定流速范围内运行（试剂以恒定流速而不是恒定压力注入设备），并且废物通道被编程为在其相应的入口通道关闭时打开，以减轻任何压力积聚。这种通道虽然有用，但会导致试剂损失，因为废液通道的内容物不会导致堵塞的形成。此外，还需要额外的控制通道 - 从而需要额外的泵 - 来调节废物通道的打开和关闭。在此展示的原型中，去除了废物通道，并建立了一个操作范式，可以减少试剂的浪费，并降低设计和操作复杂性。这涉及以恒压模式（而不是恒定流速模式）注入水性试剂。为了更好地理解这两种状态，在每种情况下都评估了阀门驱动期间通道中的压力和流量之间的关系（使用如图 6A 所示的相同设置），其结果如图 7 所示。在图7A中，在恒定压力（300 mbar）下注入蒸馏水时测量了蒸馏水的流速，观察到在阀门驱动期间，流速降至零，而在阀门减压时，流速恢复到驱动前的水平。然而，在恒定流速状态下，其中在以恒定流速（2.5μL/min;图 7B），阀门驱动没有导致入口完全关闭 - 流速没有降至零证明 - 并且观察到通道中的压力积聚。这是通过开放废物渠道而缓解的压力。由于恒定的输入压力状态允许设备在阀门驱动时无背压运行，从而消除了对废物通道的需求，因此微流控芯片的操作采用了该状态。

为了证明微流控装置的功能性，我们生成了一个荧光塞的定量组合库。到装置的八个入口，三个水试剂 - 荧光素（50μM）在四个入口（I）1我3, 我5, 我7）、三个入口中的蒸馏水（I4我6, 我8），一个带有蓝色染料的入口（I2;充当条形码） - 和两种油试剂 - 氟化油 （FC-40） 和矿物油 （MO） 在入口 O1 和 O2，分别 - 插入 （图1A, 图8A).氟化油充当水性塞子分散的载体相，矿物油有助于提高塞子的稳定性，并最大限度地减少塞子内容物对壁的粘附，从而最大限度地减少塞子之间的交叉污染46.由于三个入口构成单个塞群，这种配置可以产生三个不同的荧光群：FFF - 由三个通道的荧光素组成，FFW - 由两个通道的荧光素和一个通道的水组成，FWW - 由一个通道的荧光素和两个通道的水组成。使用此设置时，有 12 个不同的条件（通过三个入口的不同组合产生的插头组）可以产生 FWW 插头，18 个不同的条件可以产生 FFW 插头，4 个不同的条件可以产生 FFF 插头。因此，对芯片进行编程以产生这 34 种不同的条件，每个条件有 5 个不同的复制插头，以及将它们分开的 5 个条形码插头重复。建议将荧光塞群与条形码群穿插在一起，即一组肉眼可见的有色（理想情况下是非荧光）塞子（在这种情况下，通过打开对应于蓝色染料的入口通道和两个蒸馏水通道形成）。它允许用户监控插头生产中的插头断裂或熔合等问题，并有助于插头的下游分析。因此，总共生成并收集了 340 个塞子 - 170 个实验塞子和 170 个条形码塞子，用于分离不同的条件 - 在 PTFE 管中生成和收集，其样品显示在 图8B.减压时间和加压时间分别设定为1000 ms和2000 ms。分析了塞子的荧光及其在不同实验条件下内部和之间的变异性，其结果如 图8C，D. 图8C 显示了在步骤 3.4.6 中生成的 .avi 文件的每帧荧光，其中突出显示了所考虑的 34 个实验条件（用蓝线分隔）。条件内峰的平均荧光值以红色显示，虚线表示该条件下的标准误差。通过从每个峰中检测到的最大荧光减去基线荧光获得的每个群体中所有塞子的峰高度，绘制如下： 图8D.在计算中，每种条件下的最后一个峰都被忽略了，因为它是由于 T 形连接处试剂混合而导致的污染塞子（由于塞子的荧光是以塞子生产的相反顺序记录的，因此在生产过程中群体中的第一个塞子是分析期间群体中的最后一个塞子）。很明显，FWW插头的高度约为FFF插头高度的三分之一（平均值= 40.9，标准差= 3.1），FFW插头的高度约为FFF插头高度的三分之二（平均值= 78.4，标准差= 5）（平均值= 117，标准差= 10）。这些结果与FFF/FFW/FWW插头不同群体中的预期荧光比例相匹配，这突出了该器件的鲁棒性及其功能。

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图 1：器件设计和微流控设置示意图。 （A） 芯片的流动层用蓝色显示，控制层用红色显示。总共有八种独特的水性试剂可以通过入口 （I1-8） 流向 T 形接头，在那里它们与来自进油口 （O1-2） 的油相相遇，形成塞子，这些塞子被收集在出口处。每个入口流道都由一个唯一的控制通道 （C1-8） 控制。（B） 微流控芯片的示意图以及与入口、控制通道和油试剂的管道连接以及出口管道一起显示。箭头表示流体在管道中的流动方向。插图显示了PDMS阀门的工作原理。虚线表示控制层位于流层下方。该数字已根据 Dubuc 等人49 修改。 请点击这里查看此图的较大版本.

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图 2：插头生产的硬件设置示意图。 压力泵控制试剂（水溶液和油溶液）在入口通道中的流量，电磁阀控制PDMS阀的驱动。 请点击这里查看此图的较大版本.

figure-representative results-3961
图3：控制微流控器件的主接口程序。 这个定制的程序可以对单个气动阀（白色面板）进行手动加压。它还允许执行完整的实验（蓝色面板），其中它接受一个.csv文件，其中包含所需的塞子群和必要的参数，例如阀门加压和减压时间，并实时显示实验执行的状态，包括哪些控制通道加压，哪些控制通道没有加压。 请点击这里查看此图的较大版本.

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图 4：压力驱动的阀门驱动。 （A） PDMS 阀（水平）减压且入口通道（垂直）打开和 （B） PDMS 阀加压并关闭入口通道的明场显微镜图像。 请点击这里查看此图的较大版本.

figure-representative results-4837
图 5：数据记录设置示意图。 收集管连接到装有油的注射器上，注射器固定在泵上。塞子通过收集管飞出，并使用荧光显微镜捕获图像/视频。 请点击这里查看此图的较大版本.

figure-representative results-5216
图 6：在给定输入压力下，阀门驱动对流量的影响。 （A） 用于监测微流体通道中流速的硬件设置示意图。在 （B） 200 mbar、（C） 400 mbar、（D） 800 mbar 和 （E） 1200 mbar 的不同输入压力下运行时，通道中流速的响应。阀门驱动的持续时间显示在红色阴影区域中。所有实验均使用蒸馏水。三个独立测量值的标准偏差由绿色阴影区域表示。 请点击这里查看此图的较大版本.

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图 7：阀门驱动时入口通道中试剂的压力和流量之间的关系。 （A） 在恒定输入压力状态 （300 mbar） 阀门中，阀门启动时流量减小为零。（B） 在恒定流速 （2.5 μL/min） 下，阀门驱动会导致通道中的压力快速积聚，直到阀门减压。阀门驱动的持续时间显示在红色阴影区域中。所有实验均使用蒸馏水。 请点击这里查看此图的较大版本.

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图 8：荧光栓群的产生。 （A） 实验装置示意图，描绘了不同试剂与设备的连接。缩写：F=荧光素，W=蒸馏水，B=蓝色食用色素，FC-40=氟化油，MO=矿物油。（B） 包含塞子的收集管的样本图片。（C） 从分析中获得的原始数据显示在指定感兴趣区域 （ROI） 中测得的平均荧光强度与视频文件的帧数的关系。红线表示每种条件（使用三个入口的特定组合产生的塞子群体）的峰值荧光平均值，虚线表示相应的标准误差。（D）不同条件下峰高的箱线图。点对应于各个峰值，框对应每个条件的范围从对应峰值分布的第一到第三个四分位数，粗线用于中值。 请点击这里查看此图的较大版本.

补充文件1：设备操作的主要接口程序。 该控制接口用于对控制通道进行手动加压，并在八入口装置中运行自动实验。 请点击这里下载此文件。

补充文件2：用于设备操作的备用主接口程序。 用于运行不带条形码功能的八入口设备的控制接口。 请点击这里下载此文件。

补充文件3：带有全局变量的LabVIEW子程序。 主接口程序的子VI，列出并显示主接口程序中全局变量的状态，即控制通道。 请点击这里下载此文件。

补充文件4：LabVIEW程序，用于保存全局变量的值。 主接口程序的SubVI，将阀门的当前状态保存为数组，该数组将用于在用户非活动状态超过30秒的情况下保持阀门的相同状态。 请点击这里下载此文件。

补充文件5：传输控制协议（TCP）LabVIEW程序。 SubVI用于维护主接口程序和WAGO控制器之间的TCP连接。 请点击这里下载此文件。

补充文件6：TCP全局变量LabVIEW子程序。 用于存储 TCP 输出变量的程序。 请点击这里下载此文件。

补充文件7：用于进行自动实验的输入。 .csv编码窖子群的组成、序列和副本的文件，用于进行实验以生产定量荧光窿，如本文所述。 请点击这里下载此文件。

补充文件 8：用于分析荧光栓群的 Python 脚本。 自定义 python 脚本，用于从插头记录中读取荧光值（.avi 文件）。 请点击这里下载此文件。

补充文件9：插头荧光分析的输出。 Python 脚本的输出，包含来自插头记录的 5x5 ROI 的荧光值。 请点击这里下载此文件。

补充文件10：R程序读取输出文件。 本工作中使用的定制程序用于读取输出荧光值并绘制原始数据、峰高和标准偏差。 请点击这里下载此文件。

补充文件 11：用于分析和绘制荧光数据的 R 函数。 自定义 R 函数，用于 1.切去荧光值的原始数据，2。定义不同的实验条件， 3.从给定条件中识别峰， 4.绘制原始数据和检测到的条件重叠， 以及 5.绘制已识别的峰和重叠的原始数据。 请点击这里下载此文件。

讨论

在本文中，提出了一套用于制造和操作基于PDMS的微流体设备的协议，用于在称为塞子的油包水隔间中自动生成组合库。微流控与液滴技术的结合提供了一种强大的技术，可以将少量试剂封装在大量室中，从而为大规模组合筛选开辟了途径。

以前，已经描述了几种技术来使用微流体生成化学上不同的室，每种技术都有其优点和局限性。Kulesa等人[50]描述了一种策略，该策略使用微量滴定板将带有条形码的细胞封装在液滴中，并使用电场将这些液滴合并以创建组合库。虽然这种方法可以生成大量的液滴组合，但由于工作流程中需要手动处理步骤，因此受到限制。Tomasi等人51 开发了一种微流控平台，用于将含有球状体（自由漂浮的细胞聚集体）的液滴与刺激液滴合并，从而允许操纵球状体微环境。这种方法可以研究细胞间相互作用和药物作用等重要现象，但通量相对较低。Eduati et al.46 和 Utharala et al.47 开发了一种基于微流控阀的平台，可以以自动化方式生成高通量组合库。然而，在这些研究中，阀门是使用盲文设备操作的，这需要在微阀和微流体芯片之间进行繁琐的对准步骤。本文中描述的系统的一个关键特性是实现气动PDMS阀，以调节输入通道中的流体流量。由于这些阀门是基于PDMS的，因此它们可以相当顺利地集成到微流体芯片的制造步骤中。此外，它们是控制入口通道中液体流动的相对简单的选择，因为它们可以通过通过外部气源施加压力来驱动。最后，可以对这些阀门的增压和减压的持续时间和顺序进行编程，从而以高通量方式自动生产不同组的塞子。另一个重要特征是使用恒压状态通过入口注入试剂，这允许人们选择不合并废物通道，以缓解在恒定流速状态下出现的任何压力积累。这简化了设备设计，减少了对额外阀门和硬件来控制废液通道阀门的需求，并最大限度地减少了试剂浪费。

虽然使用PDMS制造设备相对简单，但此类设备的实现确实需要使用大量的硬件用具，例如气动电磁阀（用于控制PDMS阀的驱动）、压力泵（用于控制入口和油试剂的流量）和软件程序（用于调节电磁阀）。虽然它们代表了一项重大投资，但这种设置为设备的成功运行提供了一致性和可靠性。此外，该协议中概述的硬件组件和体系结构是以模块化方式设置的。因此，对于某些模块，可以使用替代方案来降低成本或使其适应特定需求。例如，根据实用性、预算、可用性和便利性，可以使用各种泵 52,53,54。可以集成其他组件，例如储液罐和温度调节器，用于敏感的入口试剂23。此外，这种设计可以按比例放大或缩小，以满足特定的科学需求。例如，在本文中，描述了一个 8 个入口原型，该原型允许将 8 种独特的试剂组合在一起以产生塞子。这可以升级到 16 个入口设备，从而允许更多数量的入口及其更大的组合。因此，它将需要额外的控制通道和电磁阀来满足入口的故障，但这样的原型允许生成更大、更多样化的组合库。最后，在本文中，每个塞子群都是通过微流体装置的八个水入口中的三个入口的开口产生的。据观察，对于这种配置，油试剂的压力约为 200 mbar，水试剂的压力约为 400 mbar，这对应于完全由阀门驱动驱动的塞子生产制度。当对油施加较高的压力时，观察到塞子破裂，而施加较低压力导致塞子融合。塞子生产的最佳压力范围取决于多种因素，例如导致塞子形成的入口数量、流体的性质和粘度以及通道的尺寸，应在必要时进行优化。

在恒压状态下运行的缺点之一是，具有不同粘度的流体在恒定压力下具有不同的流速。因此，需要确保流经进样口的水性试剂具有相当的粘度。使用不同粘度的流体不仅会影响入口通道中的流体流动，还会影响 T 形接头处的塞子形成，从而影响塞子群的组成。另一个缺点是 T 形接头处的残留试剂会污染栓塞群。当设备在产生不同的插头群体之间切换时，每个群体序列中的第一个/最后一个插头往往会被前一个或下一个群体污染。这可以通过产生每个群体的额外重复并在分析过程中忽略污染的塞子来克服。最后，由于制造和/或外部来源（压力波动）的不一致，各个设备之间也存在差异。这个问题可以通过多次重复使用单个微流控芯片并确保在单个芯片上执行组合库的完整运行来缓解，以最大程度地减少这些不一致的影响。

本文中介绍的微流控装置和随附的一组操作协议已被用于演示定量组合塞库的生产。因此，该平台可以以高通量方式快速生成不同插头群的组合库。因此，这些技术可用于各种筛查目的，包括但不限于对患者活检样本进行组合药物筛选 - 从而将从活检中取出的少量细胞分布在大量液滴中，并用大量抗癌药物组合处理，以优化针对给定患者样本的个体治疗 - 从而加速个性化癌症治疗46，48,55.

披露声明

F. E. 是 TheraMe 的自由职业者！银。提交人宣称他们没有相互竞争的经济利益。

致谢

我们要感谢 NanoLab TuE 的 Stacey Martina 在 HMDS 气相沉积方面的帮助。这项研究由 TU/e 的复杂分子系统研究所 （ICMS） 和荷兰科学研究组织 （NWO） 引力计划 IMAGINE 资助！（项目编号 24.005.009）。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
1,1,3,3 tetramethyldisiloxaneMerck Life Science NVMFCD00008256
4 channel digital input/output moduleWAGO Kontakttechnik GmbH750-504
AcetoneBoom LabsBOOMSKEUZW3
Analysis SoftwareEindhoven University of Technologyhttps://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE
AZ 40XT 11DMerck Life Science NV 212299 Positive photoresist 
AZ 726 MIF developerMerck Life Science NV10055824960Developer for positive photoresist
Biopsy Punch, Rapid CoreWorld Precision Instruments Germany, GMBH5045290.75 mm ID, W/Plunge
Blue food dyePMEFC1036
Controller end module WAGO Kontakttechnik GmbH 750-600
Ethernet Controller WAGO Kontakttechnik GmbH 750-881
FC-40Merck MilliporeF9755-100ML
Fluigent flow unitFluigentFLU-S-D
Fluigent pressure system Fluigent MFCS-EZ 0 - 2 bar
FluoresceinMerck Life Science NVMFCD00005050
Hot plate Torrey Pines Scientific HP61
Inverted microscope Nikon Instruments Eclipse Ti-E
IsopropanolBoom LabsBOOMSKEUZE3
LabVIEW (Software Version 20)Eindhoven University of Technologyhttps://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE/tree/main/LabVIEW_8_inlet_device_
VERSION_1		All files have been saved for LabVIEW version 20. It is advised to use this version or higher to open the files.
Luer stubs Instech Laboratories, Inc. LS2323 ga, 0.5"
Male Luer to barb connectors Cole Parmer 45505-32 3/32" ID
MasterFlex PTFE tubingAvator/VWR48634
Microscope SlidesVWR470150-480
Microscope slides,  PlainCorning2947-75X50
Mineral OilMerck Millipore330760-1L
mr DEV 600Micro resist TechnologyR815100Developer for negative photoresist
OvenThermo Scientific Heraeus T6P 50045757
Oxygen plasma asherQuorum TechnologiesK1050X
PhotomaskCAD/Art Services, Inc.
Photomask DesignEindhoven University of Technology (Adapted from Merten Lab, EPFL)https://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE/blob/main/8_inlet_JoVE_device_design.dwg
Pneumatic valve arrayFESTO1x 8 valve array, Normally closed valves
Silicon WafersSilicon Materials<1-0-0>, 100 mm diameter, 525 μm thickness
Single edge blades GEM Scientific
Soft tubingFluigent1 mm ID, 3 mm OD
Spin coater Laurell Technologies Corporation WS-650MZ-23NPPB
Stereo microscope Olympus Corporation SZ61
SU-8 3050Kayakli Advanced MaterialsY311075 1000L1GLNegative photoresist
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)Dow1317318
SyringeB Braun Injekt - F Fine Dosage Syringe10303002
UV-LED exposure systemIdonusUV-EXP150S-SYS
Vacuum pump Vacuumbrand GmbH MD1C
Weighing scales Sartorius M-prove

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