マウス網膜の凍結切片および免疫染色

要約

マウス網膜凍結切片を調製し、光受容体上で免疫染色を実施するためのプロトコルが記載されている。この記事により、研究者は、保存状態の良い形態と高品質の免疫染色結果を備えたマウス網膜凍結切片を一貫して作製することができます。

要約

組織切片作製と免疫組織化学は、動物モデルを用いた網膜疾患の組織学的および病理学的研究に不可欠な技術です。これらの方法により、組織の形態や組織内の特定のタンパク質の局在を詳細に調べることが可能となり、疾患のプロセスやメカニズムに関する貴重な知見を得ることができます。マウスは、この目的のために最も広く使用されているモデルです。しかし、マウスの眼球は小さく、マウスの網膜は非常にデリケートな組織であるため、マウスの眼球から高品質な網膜切片や免疫染色画像を得ることは一般的に困難です。この研究では、マウス網膜の凍結切片と免疫組織化学の実施のための改良されたプロトコルについて説明します。このプロトコルの重要なポイントは、角膜の除去、レンズ抽出、および埋め込みのプロセス中に眼球の変形を防ぐ瞬間接着剤の層で眼球をコーティングすることです。このステップにより、網膜の形態の完全性が十分に維持されます。このプロトコールは、高品質の網膜切片を一貫して作成し、優れた免疫染色結果を達成するための重要な技術的考慮事項と最適化戦略を強調しています。

概要

凍結切片と免疫組織化学(IHC)は、生物医学研究、特に網膜¹などの複雑な生物学的構造を研究するために不可欠な技術です。これらの高度な方法論は、網膜の複雑な細胞組成と分子組織を理解するために不可欠です。これらは、研究者に網膜の機能と病理を詳細なレベルで調査する能力を提供し、この分野の知識を進歩させるために重要な洞察を提供します。

凍結切片は、網膜組織の形態学的完全性を維持する上で重要な役割を果たします。これにより、網膜の繊細な構造が損なわれず、切片をその後の免疫蛍光研究に高い精度と信頼性で使用することができます。パラフィン包埋などの他の方法と比較して、クライオ切片は組織の形態と抗原性の両方をよりよく保存するため、免疫組織化学染色に特に適しているという大きな利点があります²。凍結切片技術は、さまざまな複雑な組織や微細な細胞構造³の研究に広く採用されており、その構造の正確な分析を可能にします。

IHCは、組織内の特定のタンパク質の局在を可視化できる強力で汎用性の高い実験技術です。この技術は、臨床と研究の両方の環境で基礎となり、診断、疾患モニタリング、生物学的調査に広く利用されています。IHC実験の成功は、綿密なサンプル調製、組織の慎重な取り扱い、免疫染色条件の正確な制御に大きく依存します。プロトコルの小さな変更が結果の品質に大きな影響を与える可能性があり、標準化と最適化の重要性が強調されています¹。

クライオセクショニングとIHCを組み合わせると、網膜内のさまざまなタンパク質の空間分布、発現レベル、細胞間相互作用を探求したい研究者にとって、比類のない利点が得られます。これらの方法論により、網膜の発達、機能、および疾患の根底にある分子メカニズムを詳細に調査することができます。このような洞察は、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、網膜色素変性症などの網膜障害の研究において特に価値があります。これらの疾患の病態生理を解明することにより、凍結切片とIHCは、潜在的なバイオマーカーの特定と新しい治療戦略の開発に貢献します。

その有用性にもかかわらず、マウス網膜を扱う作業には独自の課題があります。マウスは、ヒトとの遺伝的類似性と十分に特徴付けられた網膜構造により、眼科研究の動物モデルとして広く使用されています。しかし、マウスの網膜組織はサイズが小さく、デリケートな性質を持っているため、高品質の凍結切片を得ることは本質的に困難です。この研究では、マウス網膜の凍結切片とIHCの実施に関する詳細な方法論を提供し、重要な技術的考慮事項を強調し、これらの課題に対処するための最適化戦略を提供します。これらの技術を洗練させることで、研究者は一貫した高品質の結果を達成し、網膜生物学と病理学の研究を前進させることができます。

プロトコル

この手続きは、Association for Research in Vision and Ophthalmology for the Use of Animals in Researchによって確立されたガイドラインに準拠していました。承認は、四川省人民病院の動物施設管理および使用委員会(IACUC)から取得されました。このプロトコルには、生後2〜3か月、体重25〜30gの雄C57Bl/6Jマウスを使用しました。この研究で使用された試薬と機器の包括的なリストは、 材料の表に記載されています。

1. 試薬の調製

1. 1x PBSバッファ
   1. はかりを使用して、NaCl 8 g、Na₂HPO₄ 1.42 g、KH₂PO₄ 0.42 g、KCl 0.2 g を秤量します。これらをビーカーに移し、適量の再蒸留水(_ddH2O)を加えて成分を溶解します。溶液を1Lのメスフラスコに注ぎ、ddH₂Oで容量を1 Lに調整します。
2. 4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液
   1. 8 mLの1x PBSバッファーを含む15 mLのコニカルチューブに、0.4 gのPFA粉末と15 μLの1 M NaOHを加えます。チューブを60°Cに設定されたウォーターバスに入れて、PFA粉末を完全に溶解します。最終容量を1x PBSで10mLに調整します。
3. IHCブロッキングソリューション
   1. 1 mLの正常ロバ血清、20 μLの20% NaN₃、200 μLの20% Triton X-100、および1x PBSバッファー18.78 mLを組み合わせます。よく混ぜます。
4. 30%ショ糖溶液
   1. 15 gのスクロースを40 mLの1x PBSバッファーに溶解します。1x PBSバッファーで容量を50 mLに調整し、完全に溶解するまで混合します。
5. IHC二次抗体溶液
   1. 調製したブロッキングバッファーを使用して、Alexa Fluor 488標識ヤギ抗ウサギ抗体を1:300の比率で希釈し、DAPIを1:2,000の比率で希釈します。

2.マウスの眼球凍結切片

1. 眼球解剖
   1. 生後3か月のC57Bl/6マウス(約25g)を、体重15μL/gの用量で2%トリブロモエタノールの腹腔内注射 により 麻酔します。子宮頸部脱臼を使用してマウスを犠牲にします(施設で承認されたプロトコルに従います)。
   2. 眼球の上側を強膜に青いマーカーでマークします(図1A)。ハサミで眼球を取り出します。
   3. 眼球の表面に血液が付着している場合は、糸くずの出ないワイプでやさしく拭き取ってください。解剖顕微鏡で、眼球に付着した外眼筋を慎重に取り除きます。
2. 固定
   1. 解剖した眼球を、1 mLの4% PFAを含む2 mLの丸底マイクロ遠心チューブに移します。眼球を10分間固定します。その後、眼球を逆さまの3cmまたは6cmのシャーレに移します。
   2. 解剖顕微鏡下で、細い鉗子と眼科用ハサミを使用して角膜に小さな切開(約1〜2 mm)を行います。眼球を4%PFA溶液に戻し、氷上でさらに2時間固定します(図1B)。
3. 凍結保護
   1. 固定液を取り除き、眼球を1x PBS緩衝液で3回洗浄します。眼球を、1 mLの30%スクロース溶液が入った2 mLの丸底マイクロ遠心チューブに移し、4°Cで凍結保護します。 眼球がチューブの底に落ち着くまで待つか、一晩放置します。
4. 眼球のコーティング
   1. 角膜側を上に向けて、逆さまのシャーレに眼球を移します。糸くずの出ないワイプを使用して角膜から余分な溶液を拭き取ります。0.2mLの微量遠心チューブに含まれる接着剤(シアノアクリレートで構成)にテニスストリングの2〜3cmのセグメントを浸し、すばやく取り外します。
   2. 解剖顕微鏡で、テニスストリングの一端を瞬間接着剤が残っている状態で湿った角膜の中心に取り付けます。接着剤が10〜20秒間固まるのを待ちます。テニスストリングのもう一方の端をつかみ、瞬間接着剤で満たされた200μLの微量遠心チューブに眼球を浸し、強膜が約1秒間完全に浸されていることを確認します。
   3. 眼球をすばやく取り外し、PBSに浸します(図1C)。強膜表面の接着剤はすぐに固まります。
5. 角膜の除去
   1. 糸くずの出ないワイプを使用して、固化した接着剤の表面に余分なPBSを拭き取ります。解剖顕微鏡で、付属のテニス紐を握ったまま、眼科用ハサミで角膜を切除します。
6. 埋め込み
   1. 鉗子を使用して、アイカップからレンズを慎重に取り出します。アイカップ内に閉じ込められた余分なショ糖溶液を、糸くずの出ないワイプで吸収します。アイカップを、最適な切削温度(OCT)コンパウンドで満たされた埋め込み型に移します。
   2. アイカップを埋め込み金型の側壁に面するようにアイカップを配置し、矢状面が金型の底と平行になるようにします。強膜の青いマークを参考にしてください。アイカップを含む埋め込み型を-80°Cの冷凍庫に移します(図1D)。アイカップは5分以内に凍結します。
7. クライオセクショニング
   1. 凍結したアイカップを-20°Cに設定されたクライオスタットに移し、チャンバー内で30分間平衡化させます。アイカップを12μmの厚さで切片にします。セクションを正に帯電したスライドガラスに取り付けて、後で使用します。

3. 免疫組織化学染色

1. ベーキング
   1. 凍結切片をスライドに置き、37°Cのオーブンで30〜60分間焼き、組織がスライドに適切に接着するようにします。
2. 洗浄
   1. PAP ペンを使用して、スライド上のセクションの周りに円を描きます。スライドを1x PBSバッファーを含むCoplinジャーに浸します。Coplinジャーを低速シェーカーに置き、切片を2〜10分間洗浄して×OCT化合物を取り除きます。
3. ブロッキングと透過化
   1. スライドを水分チャンバーに水平に置きます。丸で囲んだ部分にブロッキング溶液を添加し、室温で30分間ブロッキングと透過化を行います。
4. 一次抗体のインキュベーション
   1. スライドからブロッキング溶液を慎重に吸引します。ブロッキング溶液で希釈した一次抗体を切片に加えます。モイスチャーチャンバー内の切片を4°Cで一晩インキュベートし、抗体が標的抗原に最適に結合するようにします。
5. 二次抗体インキュベーション
   1. 一次抗体溶液を吸引し、スライドを1x PBSで2回×10分間洗浄します。適切な二次抗体を添加し、DAPIと混合し、ブロッキング溶液で希釈します。
   2. 暗湿チャンバー内で切片を室温で1時間インキュベートし、二次抗体の結合とDAPIによる対比染色を可能にします。
6. マウンティング
   1. 二次抗体溶液を吸引し、スライドを1x PBSで2×10分間すすぎます。キムワイプを使用して、スライドに残っているPBSを拭き取ります。
   2. 退色防止封入剤を適量塗布し、カバースリップで覆います。マウントされたサンプルは、蛍光を保持し、光退色を防ぐために、暗所で4°Cに保管してください。

4. イメージング

1. 免疫染色した網膜切片から、レーザー走査型共焦点顕微鏡を用いて蛍光シグナルを取得します。最適な分解能と感度が得られるように設定を調整して、クリアで明瞭な蛍光シグナルを捕捉します。
2. 実験で使用した蛍光色素の特定の波長を検出するために、適切なフィルターが使用されていることを確認してください。

結果

上記のプロトコルに従って、生後1か月の野生型C57Bl/6Jマウスの眼を4%PFAに固定しました。その後、固定したサンプルをOCTに包埋し、凍結切片化しました。切片を抗PDE6B抗体で免疫染色し、DAPIで対比染色して核を標識しました。PDE6Bは、桿体視細胞⁴に特異的に発現する光伝達タンパク質である。従来のプロトコルと比較して、このプロトコルはマウス?...

ディスカッション

組織切片の品質には、固定液の組成、固定時間と凍結保護時間、埋め込み方法など、多くの要因が影響します⁵。マウスから眼球を摘出するときは、眼球に付着している外眼筋やその他の結合組織を取り除くことが不可欠です。適切に除去しないと、これらの組織は眼窩からの抽出中に眼球の変形を引き起こし、網膜剥離につながる可能性がありま?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
-80 °C freezer	Haier	DW-86L626
Adhesion microscope slides	CITOTEST	80312-3161
Alexa488-Goat anti-Rabbit	Proteintech	SA00006-2
C57BL/6J mouse	The Jackson Laboratory	664
Cryosection microtome	Leica	N/A
Cryostat	LEICA	N/A
DAPI	Cell Signaling Technology	4083S
Dissecting microscope	ZEISS	3943030830
Donkey serum	Solarbio	S9100
Embedding molds	Thermo Fisher Scientific	1841
Fine dissection scissors	RWD	S13001-10
Fine forceps	RWD	F11020-11
Fluoromount aqueous mounting medium	Sigma-Aldrich	F4680
Incubator	Shanghai Yuejin	N/A
KCl	Sigma-Aldrich	1049330500
KH2PO4	Sigma-Aldrich	1048771000
Kimwipes	Thermo Fisher Scientific	FIS-06666
Laser confocal microscope	ZEISS	N/A
Microscope cover Glass	CITOTEST	80340-3610
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	1065860500
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaOH	Sigma-Aldrich	1091371003
O.C.T compound	Sakura	4583
Pap pen	Sigma-Aldrich	Z672548
PFA	Sigma-Aldrich	441244
Rabbit anti-PDE6B	Proteintech	22063-1-AP
Shaker	SCILOGEX	8042210200
Spring scissors	RWD	S11036-08
Sucrose	BioFroxx	1245GR500
Super glue	Deli	7147S
Tennis string (1.24 mm)	Gosen	TS761
Tribromoethanol	Macklin	T831042
Triton X-100	Solarbio	IT9100