小鼠视网膜的冷冻切片和免疫染色

摘要

描述了制备小鼠视网膜冷冻切片和对光感受器进行免疫染色的方案。本文使研究人员能够始终如一地生产具有保存完好的形态和高质量免疫染色结果的小鼠视网膜冰冻切片。

摘要

组织切片和免疫组织化学是使用动物模型对视网膜疾病进行组织学和病理学研究的基本技术。这些方法能够详细检查组织形态和组织内特定蛋白质的定位，从而为疾病过程和机制提供有价值的见解。小鼠是用于此目的的最广泛使用的模型。然而，由于小鼠眼球很小，而小鼠视网膜是极其脆弱的组织，因此从小鼠眼球获得高质量的视网膜切片和免疫染色图像通常具有挑战性。本研究描述了一种改进的小鼠视网膜冷冻切片和进行免疫组织化学的方案。该协议的一个要点是在眼球上涂上一层强力胶，这可以防止眼球在角膜去除、晶状体摘除和嵌入过程中变形。此步骤可确保视网膜形态的完整性得到良好保留。该方案强调了关键的技术考虑和优化策略，以始终如一地产生高质量的视网膜切片并获得出色的免疫染色结果。

引言

冷冻切片和免疫组织化学 （IHC） 是生物医学研究中不可或缺的技术，特别是对于研究复杂的生物结构，如视网膜¹。这些先进的方法对于理解视网膜复杂的细胞组成和分子组织是不可或缺的。它们使研究人员能够详细研究视网膜功能和病理学，提供对推进该领域知识至关重要的见解。

冷冻切片在维持视网膜组织的形态完整性方面起着至关重要的作用。它确保视网膜的精细结构保持完整，从而允许切片以高精度和可靠性用于后续的免疫荧光研究。与其他方法（如石蜡包埋）相比，冷冻切片具有显著的优势，因为它更好地保留了组织形态和抗原性，使其特别适用于免疫组织化学染色²。冰冻切片技术被广泛用于研究一系列复杂组织，甚至精细的细胞结构³，从而能够精确分析其结构。

IHC 是一种功能强大且用途广泛的实验室技术，可实现组织内特定蛋白质定位的可视化。这项技术已成为临床和研究环境的基石，广泛用于诊断、疾病监测和生物调查。IHC 实验的成功在很大程度上取决于细致的样品制备、对组织的仔细处理以及对免疫染色条件的精确控制。实验方案的微小变化会极大地影响结果的质量，凸显了标准化和优化的重要性¹。

当冷冻切片和 IHC 相结合时，为寻求探索视网膜内各种蛋白质的空间分布、表达水平和细胞相互作用的研究人员提供了无与伦比的优势。这些方法允许详细研究视网膜发育、功能和疾病的分子机制。这些见解在研究视网膜疾病（包括年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变和视网膜色素变性）时特别有价值。通过阐明这些病症的病理生理学，冷冻切片和 IHC 有助于识别潜在的生物标志物和开发新的治疗策略。

尽管它很实用，但使用小鼠视网膜会带来独特的挑战。小鼠因其与人类的遗传相似性和特征明确的视网膜结构而被广泛用作眼科研究中的动物模型。然而，由于小鼠视网膜组织的小尺寸和脆弱的性质，获得高质量的冷冻切片本质上是困难的。本研究提供了对小鼠视网膜进行冷冻切片和进行 IHC 的详细方法，强调了关键的技术考虑因素，并提供了应对这些挑战的优化策略。通过改进这些技术，研究人员可以获得一致和高质量的结果，从而推进视网膜生物学和病理学的研究。

研究方案

该程序符合视觉和眼科学研究协会制定的关于在研究中使用动物的指南。已获得四川省人民医院机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。雄性 C57Bl/6J 小鼠，年龄 2 至 3 个月，体重 25-30 g，用于该方案。 材料表中提供了本研究中使用的试剂和设备的完整列表。

1. 试剂制备

1. 1x PBS 缓冲液
   1. 使用秤称取 8 g NaCl、1.42 g Na₂HPO₄、0.42 g KH₂PO₄ 和 0.2 g KCl。将这些物质转移到烧杯中，加入适量的双蒸水 （ddH₂O） 以溶解成分。将溶液倒入 1 L 容量瓶中，用 ddH₂O 将体积调节至 1 L。
2. 4% 多聚甲醛 （PFA） 溶液
   1. 将 0.4 g PFA 粉末和 15 μL 1 M NaOH 添加到含有 8 mL 1x PBS 缓冲液的 15 mL 锥形管中。将试管置于设置为 60 °C 的水浴中，以完全溶解 PFA 粉末。用 1x PBS 将最终体积调节至 10 mL。
3. IHC 封闭液
   1. 混合 1 mL 正常驴血清、20 μL 20% NaN₃、200 μL 20% Triton X-100 和 18.78 mL 1x PBS 缓冲液。充分混合。
4. 30% 蔗糖溶液
   1. 将 15 g 蔗糖溶解在 40 mL 的 1x PBS 缓冲液中。用 1x PBS 缓冲液将体积调节至 50 mL，并混合直至完全溶解。
5. IHC 二抗溶液
   1. 使用制备的封闭缓冲液，以 1：300 的比例稀释 Alexa Fluor 488 偶联的山羊抗兔抗体，以 1：2,000 的比例稀释 DAPI。

2. 小鼠眼球冷冻切片

1. 眼球解剖
   1. 通过腹膜内注射 2% 三溴乙醇，剂量为 15 μL/g 体重，麻醉 3 个月大的 C57Bl/6 小鼠（约 25 g）。使用颈椎脱位处死小鼠（遵循机构批准的方案）。
   2. 在巩膜上用蓝色记号笔标记眼球的上侧（图 1A）。用剪刀去除眼球。
   3. 如果眼球表面有任何血液，请使用无绒湿巾轻轻擦去。在解剖显微镜下，小心地去除附着在眼球上的眼外肌。
2. 固定
   1. 将解剖的眼球转移到含有 1 mL 4% PFA 的 2 mL 圆底微量离心管中。固定眼球 10 分钟。随后，将眼球转移到倒置的 3 厘米或 6 厘米培养皿中。
   2. 在解剖显微镜下，使用细镊子和眼科剪刀在角膜上做一个小切口（约 1-2 毫米）。将眼球放回 4% PFA 溶液中，在冰上再固定 2 小时（图 1B）。
3. 低温保护
   1. 取出固定剂，用 1x PBS 缓冲溶液洗涤眼球 3 次。将眼球转移到含有 1 mL 30% 蔗糖溶液的 2 mL 圆底微量离心管中，以便在 4 °C 下进行低温保护。 让眼球沉淀在管子底部或放置过夜。
4. 眼球涂层
   1. 将眼球转移到倒置的培养皿上，角膜面朝上。使用无绒湿巾吸干角膜上多余的溶液。将一段 2-3 cm 的网球线浸入 0.2 mL 微量离心管中的胶水（由瞬干酪组成）中，然后快速取出。
   2. 在解剖显微镜下，将网球线的一端与残留的强力胶粘在潮湿的角膜中心。让胶水凝固 10-20 秒。抓住网球线的另一端，将眼球浸入装有强力胶的 200 μL 微量离心管中，确保锁膜完全浸入约 1 秒。
   3. 快速取出眼球并将其浸入 PBS 中（图 1C）。巩膜表面的胶水会立即凝固。
5. 去除角膜
   1. 使用无绒布吸干凝固胶水表面多余的 PBS。在解剖显微镜下，用眼科剪刀去除角膜，同时握住附带的网球线。
6. 嵌入
   1. 使用镊子小心地从眼罩中取出镜片。用一条不起毛的湿巾吸收眼罩内多余的蔗糖溶液。将眼罩转移到填充有最佳切割温度 （OCT） 化合物的包埋模具中。
   2. 用 OCT 完全填充眼罩。放置眼罩，使其面向包埋模具的侧壁，确保矢状面平行于模具底部。使用巩膜上的蓝色标记作为参考。将含有眼罩的包埋模具转移到-80°C的冰箱中（图1D）。眼罩将在 5 分钟内冻结。
7. 冷冻切片
   1. 将冷冻眼罩转移到设置为 -20 °C 的低温恒温器中，并使其在腔室内平衡 30 分钟。将眼罩切成 12 μm 的厚度。将切片安装在带正电的载玻片上以备后续使用。

3. 免疫组化染色

1. 烘
   1. 将冷冻切片放在载玻片上，并在 37 °C 的烘箱中烘烤 30-60 分钟，以确保组织正确粘附在载玻片上。
2. 洗涤
   1. 使用 PAP 笔，在幻灯片上的各部分周围画一个圆圈。将载玻片浸入含有 1x PBS 缓冲液的 Coplin 罐中。将 Coplin 染色缸放在慢速摇床上，清洗切片 2 × 10 分钟以去除 OCT 化合物。
3. 封闭和透化
   1. 将玻片水平放置在湿气室中。将封闭溶液添加到带圆圈的切片中，并在室温下封闭和透化 30 分钟。
4. 一抗孵育
   1. 小心地从载玻片中吸出封闭溶液。将用封闭溶液稀释的一抗添加到切片中。将切片在水分室中于 4 °C 孵育过夜，以确保抗体与靶抗原的最佳结合。
5. 二抗孵育
   1. 吸出一抗溶液，用 1x PBS 洗涤载玻片两次，每次 2 × 10 分钟。加入适当的二抗，与 DAPI 混合，并在封闭溶液中稀释。
   2. 将切片在室温下在黑暗的湿室中孵育 1 小时，以允许二抗结合和用 DAPI 复染。
6. 安装
   1. 吸出二抗溶液，用 1x PBS 冲洗载玻片 2 × 10 分钟。使用 Kimwipe 吸干载玻片上残留的 PBS。
   2. 在切片上涂抹适量的抗淬灭封固剂，并用盖玻片覆盖。将封固的样品在 4 °C 下避光保存，以保持荧光并防止光漂白。

4. 成像

1. 使用激光扫描共聚焦显微镜从免疫染色的视网膜切片获取荧光信号。调整设置以获得最佳分辨率和灵敏度，以捕获清晰清晰的荧光信号。
2. 确保使用适当的滤光片来检测实验中采用的荧光团的特定波长。

结果

按照上述方案，将 1 个月大野生型 C57Bl/6J 小鼠的眼睛固定在 4% PFA 中。然后将固定的样品包埋在 OCT 中并冷冻切片。用抗 PDE6B 抗体对切片进行免疫染色，并用 DAPI 复染以标记细胞核。PDE6B 是一种在视杆状感光细胞中特异性表达的光转导蛋白⁴。与传统方案相比，该方案显着改善了小鼠视网膜的形态和免疫荧光图像的质量，提供了很好的一致性。代表性结?...

讨论

许多因素会影响组织切片的质量，包括固定液的成分、固定和冷冻保护时间以及包埋方法⁵.从小鼠中取出眼球时，必须去除附着在眼球上的眼外肌和其他结缔组织。如果去除不当，这些组织会在从眼眶中提取时导致眼球变形，可能导致视网膜脱离。在固定过程中，应在角膜上做一个切口以释放眼压 （IOP）。如果没有这个切口，眼球可能会缩小，导致变形...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
-80 °C freezer	Haier	DW-86L626
Adhesion microscope slides	CITOTEST	80312-3161
Alexa488-Goat anti-Rabbit	Proteintech	SA00006-2
C57BL/6J mouse	The Jackson Laboratory	664
Cryosection microtome	Leica	N/A
Cryostat	LEICA	N/A
DAPI	Cell Signaling Technology	4083S
Dissecting microscope	ZEISS	3943030830
Donkey serum	Solarbio	S9100
Embedding molds	Thermo Fisher Scientific	1841
Fine dissection scissors	RWD	S13001-10
Fine forceps	RWD	F11020-11
Fluoromount aqueous mounting medium	Sigma-Aldrich	F4680
Incubator	Shanghai Yuejin	N/A
KCl	Sigma-Aldrich	1049330500
KH2PO4	Sigma-Aldrich	1048771000
Kimwipes	Thermo Fisher Scientific	FIS-06666
Laser confocal microscope	ZEISS	N/A
Microscope cover Glass	CITOTEST	80340-3610
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	1065860500
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaOH	Sigma-Aldrich	1091371003
O.C.T compound	Sakura	4583
Pap pen	Sigma-Aldrich	Z672548
PFA	Sigma-Aldrich	441244
Rabbit anti-PDE6B	Proteintech	22063-1-AP
Shaker	SCILOGEX	8042210200
Spring scissors	RWD	S11036-08
Sucrose	BioFroxx	1245GR500
Super glue	Deli	7147S
Tennis string (1.24 mm)	Gosen	TS761
Tribromoethanol	Macklin	T831042
Triton X-100	Solarbio	IT9100