Criosección e inmunotinción de retina de ratón

Resumen

Se describe un protocolo para preparar criosecciones de retina en ratones y realizar inmunotinción en fotorreceptores. Este artículo permite a los investigadores producir de forma consistente secciones congeladas de retina de ratón con una morfología bien conservada y resultados de inmunotinción de alta calidad.

Resumen

El corte de tejidos y la inmunohistoquímica son técnicas esenciales en los estudios histológicos y patológicos de las enfermedades de la retina utilizando modelos animales. Estos métodos permiten exámenes detallados de las morfologías de los tejidos y la localización de proteínas específicas dentro del tejido, lo que proporciona información valiosa sobre los procesos y mecanismos de las enfermedades. Los ratones son el modelo más utilizado para este fin. Sin embargo, debido a que los globos oculares de ratón son pequeños y las retinas de ratón son tejidos extremadamente delicados, la obtención de secciones de retina de alta calidad e imágenes de inmunotinción de globos oculares de ratón suele ser un desafío. Este estudio describe un protocolo mejorado para crioseccionar retinas de ratones y realizar inmunohistoquímica. Un punto esencial de este protocolo consiste en recubrir el globo ocular con una capa de superpegamento, que evita la deformación de los globos oculares durante los procesos de extracción de córnea, extracción del cristalino e incrustación. Este paso asegura que la integridad de las morfologías de la retina esté bien preservada. Este protocolo destaca las consideraciones técnicas críticas y las estrategias de optimización para producir de manera consistente secciones de retina de alta calidad y lograr excelentes resultados de inmunotinción.

Introducción

La criosección y la inmunohistoquímica (IHQ) son técnicas indispensables en la investigación biomédica, especialmente para el estudio de estructuras biológicas complejas como la retina¹. Estas metodologías avanzadas son fundamentales para comprender la intrincada composición celular y la organización molecular de la retina. Proporcionan a los investigadores la capacidad de investigar la funcionalidad y la patología de la retina a un nivel detallado, ofreciendo información que es fundamental para avanzar en el conocimiento en este campo.

La criosección desempeña un papel vital en el mantenimiento de la integridad morfológica del tejido de la retina. Asegura que la delicada estructura de la retina permanezca intacta, lo que permite que las secciones se utilicen en estudios posteriores de inmunofluorescencia con alta precisión y fiabilidad. En comparación con otros métodos, como la inclusión en parafina, la criosección tiene ventajas significativas, ya que conserva mejor tanto la morfología del tejido como la antigenicidad, lo que la hace particularmente adecuada para la tinción inmunohistoquímica². La técnica de la sección congelada es ampliamente adoptada para estudiar una variedad de tejidos complejos e incluso estructuras celulares finas³, lo que permite análisis precisos de su arquitectura.

La IHQ es una técnica de laboratorio potente y versátil que permite la visualización de la localización de proteínas específicas dentro de los tejidos. Esta técnica se ha convertido en una piedra angular tanto en el ámbito clínico como en el de investigación, donde se utiliza ampliamente para el diagnóstico, el seguimiento de enfermedades y las investigaciones biológicas. El éxito de un experimento de IHQ depende en gran medida de la preparación meticulosa de la muestra, el manejo cuidadoso del tejido y el control preciso de las condiciones de inmunotinción. Pequeñas variaciones en el protocolo pueden tener un gran impacto en la calidad de los resultados, lo que subraya la importancia de la estandarización y la optimización¹.

Cuando se combinan, la criosección y la IHQ ofrecen ventajas incomparables para los investigadores que buscan explorar la distribución espacial, los niveles de expresión y las interacciones celulares de varias proteínas dentro de la retina. Estas metodologías permiten investigaciones detalladas sobre los mecanismos moleculares que subyacen al desarrollo, la función y la enfermedad de la retina. Estos conocimientos son particularmente valiosos en el estudio de los trastornos de la retina, incluida la degeneración macular relacionada con la edad, la retinopatía diabética y la retinitis pigmentosa. Al dilucidar la fisiopatología de estas afecciones, la criosección y la IHQ contribuyen a la identificación de posibles biomarcadores y al desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas.

A pesar de su utilidad, trabajar con retinas de ratón presenta desafíos únicos. Los ratones son ampliamente utilizados como modelos animales en la investigación oftálmica debido a su similitud genética con los humanos y su estructura retiniana bien caracterizada. Sin embargo, obtener criosecciones de alta calidad es inherentemente difícil debido al pequeño tamaño y la delicada naturaleza del tejido de la retina del ratón. Este estudio proporciona una metodología detallada para la criosección y la realización de IHQ en retinas de ratones, destacando consideraciones técnicas críticas y ofreciendo estrategias de optimización para abordar estos desafíos. Al refinar estas técnicas, los investigadores pueden lograr resultados consistentes y de alta calidad, avanzando en el estudio de la biología y la patología de la retina.

Protocolo

El procedimiento se adhirió a las pautas establecidas por la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología para el Uso de Animales en Investigación. Se obtuvo la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Hospital Popular Provincial de Sichuan. Para este protocolo se utilizaron ratones machos C57Bl/6J, de dos a tres meses de edad y con un peso de 25-30 g. Una lista completa de los reactivos y equipos utilizados en este estudio se proporciona en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de reactivos

1. 1x Búfer PBS
   1. Pesar 8 g de NaCl, 1,42 g de Na₂HPO₄, 0,42 g de KH₂PO₄ y 0,2 g de KCl utilizando una báscula. Transfiéralos a un vaso de precipitados y agregue una cantidad adecuada de agua bidestilada (ddH₂O) para disolver los componentes. Vierta la solución en un matraz aforado de 1 L y ajuste el volumen a 1 L con ddH₂O.
2. Solución de paraformaldehído (PFA) al 4%
   1. Añadir 0,4 g de PFA en polvo y 15 μL de NaOH 1 M a un tubo cónico de 15 mL que contenga 8 mL de tampón PBS 1x. Coloque el tubo en un baño de agua ajustado a 60 °C para disolver completamente el polvo de PFA. Ajuste el volumen final a 10 mL con 1x PBS.
3. Solución de bloqueo IHC
   1. Combine 1 mL de suero de burro normal, 20 μL de NaN₃ al 20%, 200 μL de Triton X-100 al 20% y 18,78 mL de tampón PBS 1x. Homogeneizar.
4. Solución de sacarosa al 30%
   1. Disolver 15 g de sacarosa en 40 mL de 1x tampón PBS. Ajuste el volumen a 50 ml con 1x tampón PBS y mezcle hasta que se disuelva por completo.
5. Solución de anticuerpos secundarios IHC
   1. Diluya el anticuerpo anti-conejo de cabra conjugado Alexa Fluor 488 en una proporción de 1:300 y DAPI en una proporción de 1:2,000 utilizando el tampón de bloqueo preparado.

2. Criosección de globos oculares de ratón

1. Disección del globo ocular
   1. Anestesiar a un ratón C57Bl/6 de 3 meses de edad (aproximadamente 25 g) mediante inyección intraperitoneal de tribromoetanol al 2% a una dosis de 15 μL/g de peso corporal. Sacrificar al ratón mediante luxación cervical (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente).
   2. Marque el lado superior del globo ocular con un marcador azul en la esclerótica (Figura 1A). Retire los globos oculares con unas tijeras.
   3. Si hay sangre en la superficie del globo ocular, límpiela suavemente con una toallita sin pelusa. Bajo un microscopio de disección, extraiga cuidadosamente los músculos extraoculares unidos a los globos oculares.
2. Fijación
   1. Transfiera los globos oculares disecados a un tubo de microcentrífuga de fondo redondo de 2 mL que contenga 1 mL de PFA al 4%. Fije los globos oculares durante 10 minutos. Posteriormente, transfiera los globos oculares a una placa de Petri invertida de 3 o 6 cm.
   2. Bajo un microscopio de disección, haga una pequeña incisión (aproximadamente 1-2 mm) en la córnea con pinzas finas y tijeras oftálmicas. Vuelva a colocar los globos oculares en la solución de PFA al 4% para una fijación adicional de 2 h en hielo (Figura 1B).
3. Crioprotección
   1. Retire el fijador y lave los globos oculares tres veces con 1x solución tampón PBS. Transfiera los globos oculares a un tubo de microcentrífuga de fondo redondo de 2 mL que contenga 1 mL de solución de sacarosa al 30% para crioprotección a 4 °C. Deje que los globos oculares se asienten en el fondo del tubo o déjelos toda la noche.
4. Recubrimiento del globo ocular
   1. Transfiera un globo ocular a una placa de Petri invertida con el lado de la córnea hacia arriba. Seque el exceso de solución de la córnea con una toallita sin pelusa. Sumerja un segmento de 2-3 cm de cuerda de tenis en el pegamento (compuesto de cianoacrilatos) contenido en un tubo de microcentrífuga de 0,2 ml, luego retírelo rápidamente.
   2. Bajo un microscopio de disección, coloca un extremo de la cuerda de tenis con superpegamento residual en el centro de la córnea húmeda. Deje que el pegamento se solidifique durante 10-20 s. Agarre el otro extremo de la cuerda de tenis y sumerja el globo ocular en un tubo de microcentrífuga de 200 μL lleno de superpegamento, asegurándose de que la esclerótica esté completamente sumergida durante aproximadamente 1 s.
   3. Retire rápidamente el globo ocular y sumérjalo en PBS (Figura 1C). El pegamento en la superficie de la esclerótica se solidificará inmediatamente.
5. Extirpación de la córnea
   1. Seque el exceso de PBS en la superficie del pegamento solidificado con una toallita sin pelusa. Bajo un microscopio de disección, extraiga la córnea con unas tijeras oftálmicas mientras sostiene la cuerda de tenis adjunta.
6. Incrustación
   1. Con unas pinzas, extraiga con cuidado el cristalino del ocular. Absorba el exceso de solución de sacarosa atrapado dentro del ocular con una tira de toallita sin pelusa. Transfiera el ocular a un molde de inclusión lleno de compuesto de temperatura de corte óptima (OCT).
   2. Coloque el ocular de modo que mire hacia la pared lateral del molde de incrustación, asegurándose de que el plano sagital sea paralelo a la parte inferior del molde. Use la marca azul en la esclerótica como referencia. Transfiera el molde de inclusión que contiene el ocular a un congelador a -80 °C (Figura 1D). El ocular se congelará en cinco minutos.
7. Crioseccionamiento
   1. Transfiera el ocular congelado a un criostato ajustado a -20 °C y deje que se equilibre dentro de la cámara durante 30 minutos. Corte el ocular con un grosor de 12 μm. Monte las secciones en portaobjetos de vidrio cargados positivamente para su uso posterior.

3. Tinción inmunohistoquímica

1. Hornada
   1. Coloque las secciones congeladas en portaobjetos y hornee en un horno a 37 °C durante 30-60 minutos para garantizar la correcta adherencia del tejido al portaobjetos.
2. Lavado
   1. Con un bolígrafo PAP, dibuja un círculo alrededor de las secciones de la diapositiva. Sumerja el portaobjetos en un frasco Coplin que contenga 1x búfer PBS. Coloque el frasco de Coplin en una coctelera lenta y lave las secciones durante 2 × 10 minutos para eliminar el compuesto OCT.
3. Bloqueo y permeabilización
   1. Coloque el portaobjetos horizontalmente en una cámara de humedad. Agregue la solución de bloqueo a las secciones encerradas en un círculo y permita el bloqueo y la permeabilización a temperatura ambiente durante 30 minutos.
4. Incubación primaria de anticuerpos
   1. Aspire la solución de bloqueo con cuidado desde el portaobjetos. Agregue el anticuerpo primario, diluido en la solución bloqueante, a las secciones. Incubar las secciones en la cámara de humedad a 4 °C durante la noche para garantizar una unión óptima del anticuerpo al antígeno objetivo.
5. Incubación secundaria de anticuerpos
   1. Aspire la solución de anticuerpos primarios y lave el portaobjetos dos veces con 1x PBS durante 2 × 10 min. Añadir el anticuerpo secundario adecuado, mezclado con DAPI, y diluido en la solución de bloqueo.
   2. Incubar las secciones en una cámara de humedad oscura a temperatura ambiente durante 1 h para permitir la unión secundaria de anticuerpos y la contratinción con DAPI.
6. Montura
   1. Aspire la solución de anticuerpos secundarios y enjuague el portaobjetos con 1x PBS durante 2 × 10 min. Use una toallita Kimwipe para secar cualquier PBS restante en la diapositiva.
   2. Aplique una cantidad adecuada de medio de montaje antidecoloración a las secciones y cúbralas con un cubreobjetos. Almacene las muestras montadas a 4 °C en la oscuridad para preservar la fluorescencia y evitar el fotoblanqueo.

4. Imágenes

1. Adquiera señales de fluorescencia de las secciones de retina inmunoteñidas utilizando un microscopio confocal de barrido láser. Ajuste la configuración para obtener una resolución y sensibilidad óptimas para capturar señales de fluorescencia claras y distintas.
2. Asegúrese de que se utilizan los filtros adecuados para detectar las longitudes de onda específicas de los fluoróforos empleados en el experimento.

Resultados

Siguiendo el protocolo descrito anteriormente, los ojos de ratones C57Bl/6J de tipo salvaje de 1 mes de edad se fijaron en PFA al 4%. A continuación, las muestras fijadas se incrustaron en OCT y se crioseccionaron. Las secciones se inmunotiñeron con un anticuerpo anti-PDE6B y se contratiñeron con DAPI para marcar los núcleos. PDE6B es una proteína de fototransducción que se expresa específicamente en las células fotorreceptoras de bastones⁴. En comparació...

Discusión

Varios factores influyen en la calidad de las secciones de tejido, incluida la composición de la solución de fijación, el tiempo de fijación y crioprotección, y los métodos de inclusión⁵. Al enuclear el globo ocular del ratón, es esencial eliminar los músculos extraoculares y otro tejido conectivo unido al globo ocular. Si no se extirpan correctamente, estos tejidos pueden causar la deformación del globo ocular durante la extracción de la cuenca del ojo...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
-80 °C freezer	Haier	DW-86L626
Adhesion microscope slides	CITOTEST	80312-3161
Alexa488-Goat anti-Rabbit	Proteintech	SA00006-2
C57BL/6J mouse	The Jackson Laboratory	664
Cryosection microtome	Leica	N/A
Cryostat	LEICA	N/A
DAPI	Cell Signaling Technology	4083S
Dissecting microscope	ZEISS	3943030830
Donkey serum	Solarbio	S9100
Embedding molds	Thermo Fisher Scientific	1841
Fine dissection scissors	RWD	S13001-10
Fine forceps	RWD	F11020-11
Fluoromount aqueous mounting medium	Sigma-Aldrich	F4680
Incubator	Shanghai Yuejin	N/A
KCl	Sigma-Aldrich	1049330500
KH2PO4	Sigma-Aldrich	1048771000
Kimwipes	Thermo Fisher Scientific	FIS-06666
Laser confocal microscope	ZEISS	N/A
Microscope cover Glass	CITOTEST	80340-3610
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	1065860500
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaOH	Sigma-Aldrich	1091371003
O.C.T compound	Sakura	4583
Pap pen	Sigma-Aldrich	Z672548
PFA	Sigma-Aldrich	441244
Rabbit anti-PDE6B	Proteintech	22063-1-AP
Shaker	SCILOGEX	8042210200
Spring scissors	RWD	S11036-08
Sucrose	BioFroxx	1245GR500
Super glue	Deli	7147S
Tennis string (1.24 mm)	Gosen	TS761
Tribromoethanol	Macklin	T831042
Triton X-100	Solarbio	IT9100