Kryosektion und Immunfärbung der Netzhaut der Maus

Zusammenfassung

Es wird ein Protokoll zur Vorbereitung von Kryoschnitten der Maus-Netzhaut und zur Durchführung von Immunfärbungen an Photorezeptoren beschrieben. Dieser Artikel ermöglicht es Forschern, konsistente Schnellschnitte der Netzhaut von Mäusen mit gut erhaltener Morphologie und qualitativ hochwertigen Immunfärbeergebnissen zu erstellen.

Zusammenfassung

Gewebeschnitte und Immunhistochemie sind wesentliche Techniken bei histologischen und pathologischen Untersuchungen von Netzhauterkrankungen im Tiermodell. Diese Methoden ermöglichen detaillierte Untersuchungen der Gewebemorphologien und die Lokalisierung spezifischer Proteine im Gewebe, die wertvolle Einblicke in Krankheitsprozesse und -mechanismen liefern. Mäuse sind das am weitesten verbreitete Modell für diesen Zweck. Da Mausaugäpfel jedoch klein sind und die Netzhaut von Mäusen extrem empfindliches Gewebe ist, ist es in der Regel schwierig, qualitativ hochwertige Netzhautschnitte und Immunfärbebilder von Mausaugäpfeln zu erhalten. Diese Studie beschreibt ein verbessertes Protokoll für die Kryosektion der Netzhaut von Mäusen und die Durchführung von Immunhistochemie. Ein wesentlicher Punkt dieses Protokolls besteht darin, den Augapfel mit einer Schicht Sekundenkleber zu überziehen, der eine Verformung der Augäpfel während der Prozesse der Hornhautentfernung, der Linsenextraktion und des Einbettens verhindert. Dieser Schritt stellt sicher, dass die Integrität der retinalen Morphologien gut erhalten bleibt. Dieses Protokoll beleuchtet wichtige technische Überlegungen und Optimierungsstrategien, um konsistent qualitativ hochwertige Netzhautschnitte zu erstellen und hervorragende Immunfärbeergebnisse zu erzielen.

Einleitung

Kryosektionen und Immunhistochemie (IHC) sind unverzichtbare Techniken in der biomedizinischen Forschung, insbesondere für die Untersuchung komplexer biologischer Strukturen wie der Netzhaut¹. Diese fortschrittlichen Methoden sind ein wesentlicher Bestandteil des Verständnisses der komplizierten zellulären Zusammensetzung und molekularen Organisation der Netzhaut. Sie bieten Forschern die Möglichkeit, die Funktionalität und Pathologie der Netzhaut auf einer detaillierten Ebene zu untersuchen, und bieten Erkenntnisse, die für den Fortschritt des Wissens in diesem Bereich entscheidend sind.

Die Kryosektion spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der morphologischen Integrität des Netzhautgewebes. Es stellt sicher, dass die empfindliche Struktur der Netzhaut intakt bleibt, so dass die Schnitte mit hoher Genauigkeit und Zuverlässigkeit in nachfolgenden Immunfluoreszenzstudien verwendet werden können. Im Vergleich zu anderen Methoden, wie z.B. der Paraffineinbettung, hat die Kryosektion erhebliche Vorteile, da sie sowohl die Gewebemorphologie als auch die Antigenität besser bewahrt und sich daher besonders für die immunhistochemische Färbung eignet². Die Schnellschnitttechnik wird häufig für die Untersuchung einer Reihe komplexer Gewebe und sogar feiner zellulärer Strukturen^{eingesetzt 3} und ermöglicht eine präzise Analyse ihrer Architektur.

IHC ist eine leistungsstarke und vielseitige Labortechnik, die es ermöglicht, die Lokalisierung spezifischer Proteine innerhalb von Geweben sichtbar zu machen. Diese Technik hat sich zu einem Eckpfeiler sowohl im klinischen als auch im Forschungsumfeld entwickelt, wo sie in großem Umfang für die Diagnostik, Krankheitsüberwachung und biologische Untersuchungen eingesetzt wird. Der Erfolg eines IHC-Experiments hängt stark von der sorgfältigen Probenvorbereitung, der sorgfältigen Behandlung des Gewebes und der präzisen Kontrolle der Immunfärbebedingungen ab. Kleine Abweichungen im Protokoll können die Qualität der Ergebnisse stark beeinträchtigen, was die Bedeutung von Standardisierung und Optimierung unterstreicht¹.

In Kombination bieten Kryosektion und IHC beispiellose Vorteile für Forscher, die die räumliche Verteilung, das Expressionsniveau und die zellulären Wechselwirkungen verschiedener Proteine in der Netzhaut untersuchen möchten. Diese Methoden ermöglichen eine detaillierte Untersuchung der molekularen Mechanismen, die der Entwicklung, Funktion und Erkrankung der Netzhaut zugrunde liegen. Solche Erkenntnisse sind besonders wertvoll bei der Untersuchung von Netzhauterkrankungen, einschließlich altersbedingter Makuladegeneration, diabetischer Retinopathie und Retinitis pigmentosa. Durch die Aufklärung der Pathophysiologie dieser Erkrankungen tragen Kryosektionen und IHC dazu bei, potenzielle Biomarker zu identifizieren und neue therapeutische Strategien zu entwickeln.

Trotz ihres Nutzens stellt die Arbeit mit der Netzhaut von Mäusen besondere Herausforderungen dar. Mäuse werden aufgrund ihrer genetischen Ähnlichkeit mit dem Menschen und ihrer gut charakterisierten Netzhautstruktur häufig als Tiermodelle in der Augenforschung eingesetzt. Es ist jedoch von Natur aus schwierig, qualitativ hochwertige Kryoschnitte zu erhalten, da das Netzhautgewebe der Maus klein und empfindlich ist. Diese Studie bietet eine detaillierte Methodik für die Kryosektion und die Durchführung von IHC an der Netzhaut von Mäusen, hebt kritische technische Überlegungen hervor und bietet Optimierungsstrategien zur Bewältigung dieser Herausforderungen. Durch die Verfeinerung dieser Techniken können Forscher konsistente und qualitativ hochwertige Ergebnisse erzielen und die Erforschung der Netzhautbiologie und -pathologie vorantreiben.

Protokoll

Das Verfahren entsprach den Richtlinien der Association for Research in Vision and Ophthalmology für die Verwendung von Tieren in der Forschung. Die Genehmigung wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Sichuan Provincial People's Hospital eingeholt. Für dieses Protokoll wurden männliche C57Bl/6J-Mäuse im Alter von zwei bis drei Monaten und einem Gewicht von 25-30 g verwendet. Eine umfassende Liste der in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräte finden Sie in der Materialtabelle.

1. Vorbereitung des Reagenzes

1. 1x PBS-Puffer
   1. 8 g NaCl, 1,42 g Na₂HPO₄, 0,42 g KH₂PO₄ und 0,2 g KCl mit einer Waage abwiegen. Diese in ein Becherglas geben und eine entsprechende Menge doppelt destilliertes Wasser (ddH₂O) hinzufügen, um die Bestandteile aufzulösen. Die Lösung wird in einen 1-l-Messkolben gegossen und das Volumen mit ddH₂O auf 1 l eingestellt.
2. 4%ige Paraformaldehyd (PFA)-Lösung
   1. 0,4 g PFA-Pulver und 15 μl 1 M NaOH in ein konisches 15-ml-Röhrchen geben, das 8 mL 1x PBS-Puffer enthält. Legen Sie die Tube in ein auf 60 °C eingestelltes Wasserbad, um das PFA-Pulver vollständig aufzulösen. Stellen Sie das Endvolumen auf 10 mL mit 1x PBS ein.
3. IHC-Blockierungslösung
   1. Kombinieren Sie 1 ml normales Eselserum, 20 μl 20 % NaN₃, 200 μl 20 % Triton X-100 und 18,78 ml 1x PBS-Puffer. Gründlich mischen.
4. 30%ige Saccharoselösung
   1. Lösen Sie 15 g Saccharose in 40 mL 1x PBS-Puffer auf. Stellen Sie das Volumen mit 1x PBS-Puffer auf 50 mL ein und mischen Sie, bis es sich vollständig aufgelöst hat.
5. IHC-Sekundärantikörper-Lösung
   1. Verdünnen Sie Alexa Fluor 488-konjugierten Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper im Verhältnis 1:300 und DAPI im Verhältnis 1:2.000 mit dem vorbereiteten Blockierungspuffer.

2. Kryosektion mit Mausaugapfel

1. Präparieren des Augapfels
   1. Anästhesieren Sie eine 3 Monate alte C57Bl/6-Maus (ca. 25 g) durch intraperitoneale Injektion von 2% Tribromethanol in einer Dosierung von 15 μL/g Körpergewicht. Opfern Sie die Maus mit einer Gebärmutterhalsluxation (nach institutionell anerkannten Protokollen).
   2. Markieren Sie die obere Seite des Augapfels mit einem blauen Marker auf der Sklera (Abbildung 1A). Entferne die Augäpfel mit einer Schere.
   3. Wenn sich Blut auf der Oberfläche des Augapfels befindet, wischen Sie es vorsichtig mit einem fusselfreien Tuch ab. Entfernen Sie unter einem Präpariermikroskop vorsichtig die extraokularen Muskeln, die an den Augäpfeln befestigt sind.
2. Fixierung
   1. Übertragen Sie die präparierten Augäpfel in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit rundem Boden, das 1 ml 4 % PFA enthält. Fixieren Sie die Augäpfel für 10 Minuten. Übertragen Sie anschließend die Augäpfel in eine umgedrehte 3- oder 6-cm-Petrischale.
   2. Machen Sie unter einem Präpariermikroskop mit einer feinen Pinzette und einer Augenschere einen kleinen Schnitt (ca. 1-2 mm) an der Hornhaut. Legen Sie die Augäpfel wieder in die 4%ige PFA-Lösung, um weitere 2 Stunden auf Eis zu fixieren (Abbildung 1B).
3. Kryoschutz
   1. Entfernen Sie das Fixiermittel und waschen Sie die Augäpfel dreimal mit 1x PBS-Pufferlösung. Die Augäpfel werden in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit rundem Boden gegeben, das 1 ml 30%ige Saccharoselösung zur Kryoprotektion bei 4 °C enthält. Lassen Sie die Augäpfel am Boden der Tube absetzen oder lassen Sie sie über Nacht.
4. Beschichtung des Augapfels
   1. Übertragen Sie einen Augapfel mit der Hornhautseite nach oben auf eine umgekehrte Petrischale. Tupfen Sie die überschüssige Lösung mit einem fusselfreien Tuch von der Hornhaut. Tauchen Sie ein 2-3 cm langes Segment der Tennissaite in den Kleber (bestehend aus Cyanacrylaten), der in einem 0,2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen enthalten ist, und entfernen Sie es dann schnell.
   2. Befestigen Sie unter einem Präpariermikroskop ein Ende der Tennissaite mit restlichem Sekundenkleber in der Mitte der feuchten Hornhaut. Lasse den Kleber 10-20 s lang erstarren. Fassen Sie das andere Ende der Tennissaite und tauchen Sie den Augapfel in ein 200-μl-Mikrozentrifugenröhrchen, das mit Sekundenkleber gefüllt ist, und stellen Sie sicher, dass die Sklera etwa 1 s lang vollständig eingetaucht ist.
   3. Entfernen Sie schnell den Augapfel und tauchen Sie ihn in PBS (Abbildung 1C). Der Kleber auf der Sklera-Oberfläche verfestigt sich sofort.
5. Entfernung der Hornhaut
   1. Tupfen Sie das überschüssige PBS mit einem fusselfreien Tuch auf die Oberfläche des erstarrten Klebers. Entfernen Sie unter einem Präpariermikroskop die Hornhaut mit einer Augenschere, während Sie die daran befestigte Tennissaite halten.
6. Einbettung
   1. Ziehen Sie die Linse mit einer Pinzette vorsichtig aus der Augenmuschel. Nehmen Sie überschüssige Saccharoselösung, die in der Augenmuschel eingeschlossen ist, mit einem Streifen fusselfreies Tuch auf. Übertragen Sie die Augenmuschel in eine Einbettform, die mit der optimalen Schnitttemperatur (OCT) gefüllt ist.
   2. Füllen Sie die Augenmuschel vollständig mit OCT. Positionieren Sie die Augenmuschel so, dass sie zur Seitenwand der Einbettungsform zeigt, und stellen Sie sicher, dass die Sagittalebene parallel zum Boden der Form ist. Verwenden Sie die blaue Markierung auf der Sklera als Referenz. Übertragen Sie die Einbettform mit der Augenmuschel in einen -80 °C-Gefrierschrank (Abbildung 1D). Die Augenmuschel wird innerhalb von fünf Minuten eingefroren.
7. Kryosektion
   1. Übertragen Sie die gefrorene Augenmuschel in einen Kryostaten, der auf -20 °C eingestellt ist, und lassen Sie sie 30 Minuten lang in der Kammer äquilibrieren. Schneiden Sie die Augenmuschel bei einer Dicke von 12 μm ab. Montieren Sie die Abschnitte für die spätere Verwendung auf positiv geladene Glasobjektträger.

3. Immunhistochemische Färbung

1. Backen
   1. Legen Sie die gefrorenen Schnitte auf Objektträger und backen Sie sie 30-60 min in einem 37 °C heißen Ofen, um eine gute Haftung des Gewebes auf dem Objektträger zu gewährleisten.
2. Waschen
   1. Zeichnen Sie mit einem PAP-Stift einen Kreis um die Abschnitte auf der Folie. Tauchen Sie den Objektträger in ein Coplin-Glas mit 1x PBS-Puffer. Stellen Sie das Coplin-Glas auf einen langsamen Schüttler und waschen Sie die Abschnitte 2 × 10 Minuten lang, um die OCT-Verbindung zu entfernen.
3. Blockierung und Permeabilisierung
   1. Legen Sie den Objektträger waagerecht in eine Feuchtigkeitskammer. Geben Sie die Blockierungslösung zu den eingekreisten Abschnitten und lassen Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur blockieren und permeabilisieren.
4. Inkubation von Primärantikörpern
   1. Saugen Sie die Verstopfungslösung vorsichtig aus dem Objektträger ab. Geben Sie den primären Antikörper, verdünnt in der Blockierungslösung, in die Schnitte. Inkubieren Sie die Schnitte über Nacht bei 4 °C in der Feuchtigkeitskammer, um eine optimale Bindung des Antikörpers an das Zielantigen zu gewährleisten.
5. Inkubation von sekundären Antikörpern
   1. Aspirieren Sie die primäre Antikörperlösung und waschen Sie den Objektträger zweimal mit 1x PBS für 2 × 10 min. Fügen Sie den entsprechenden Sekundärantikörper hinzu, mischen Sie ihn mit DAPI und verdünnen Sie ihn in der Blockierungslösung.
   2. Inkubieren Sie die Schnitte in einer dunklen Feuchtigkeitskammer bei Raumtemperatur für 1 h, um eine sekundäre Antikörperbindung und Gegenfärbung mit DAPI zu ermöglichen.
6. Montage
   1. Die Sekundärantikörperlösung aspirieren und den Objektträger 2 × 10 min mit 1x PBS spülen. Verwenden Sie einen Kimwipe, um alle verbleibenden PBS auf der Folie zu entfernen.
   2. Tragen Sie eine angemessene Menge Antifading-Eindeckmittel auf die Abschnitte auf und decken Sie sie mit einem Deckglas ab. Lagern Sie die eingefassten Proben bei 4 °C im Dunkeln, um die Fluoreszenz zu erhalten und Photobleiche zu verhindern.

4. Bildgebung

1. Erfassen Sie Fluoreszenzsignale von den immungefärbten Netzhautschnitten mit einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop. Passen Sie die Einstellungen für eine optimale Auflösung und Empfindlichkeit an, um klare und deutliche Fluoreszenzsignale zu erfassen.
2. Stellen Sie sicher, dass geeignete Filter verwendet werden, um die spezifischen Wellenlängen der im Experiment verwendeten Fluorophore zu erfassen.

Ergebnisse

Gemäß dem oben beschriebenen Protokoll wurden die Augen von 1 Monat alten Wildtyp-Mäusen mit C57Bl/6J in 4 % PFA fixiert. Die fixierten Proben wurden dann in eine OCT eingebettet und kryosektioniert. Die Schnitte wurden mit einem Anti-PDE6B-Antikörper immungefärbt und mit DAPI gegengefärbt, um die Zellkerne zu markieren. PDE6B ist ein Phototransduktionsprotein, das spezifisch in Stäbchen-Photorezeptorzellen exprimiert^{wird 4}. Im Vergleich zu herkömmlichen P...

Diskussion

Eine Reihe von Faktoren beeinflussen die Qualität von Gewebeschnitten, darunter die Zusammensetzung der Fixierlösung, die Fixierungs- und Kryoproduktionszeit sowie die Einbettungsmethoden⁵. Bei der Entkernung des Augapfels aus der Maus ist es wichtig, die extraokulären Muskeln und anderes Bindegewebe, das am Augapfel befestigt ist, zu entfernen. Wenn dieses Gewebe nicht richtig entfernt wird, kann es bei der Extraktion aus der Augenhöhle zu einer Verformung de...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
-80 °C freezer	Haier	DW-86L626
Adhesion microscope slides	CITOTEST	80312-3161
Alexa488-Goat anti-Rabbit	Proteintech	SA00006-2
C57BL/6J mouse	The Jackson Laboratory	664
Cryosection microtome	Leica	N/A
Cryostat	LEICA	N/A
DAPI	Cell Signaling Technology	4083S
Dissecting microscope	ZEISS	3943030830
Donkey serum	Solarbio	S9100
Embedding molds	Thermo Fisher Scientific	1841
Fine dissection scissors	RWD	S13001-10
Fine forceps	RWD	F11020-11
Fluoromount aqueous mounting medium	Sigma-Aldrich	F4680
Incubator	Shanghai Yuejin	N/A
KCl	Sigma-Aldrich	1049330500
KH2PO4	Sigma-Aldrich	1048771000
Kimwipes	Thermo Fisher Scientific	FIS-06666
Laser confocal microscope	ZEISS	N/A
Microscope cover Glass	CITOTEST	80340-3610
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	1065860500
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaOH	Sigma-Aldrich	1091371003
O.C.T compound	Sakura	4583
Pap pen	Sigma-Aldrich	Z672548
PFA	Sigma-Aldrich	441244
Rabbit anti-PDE6B	Proteintech	22063-1-AP
Shaker	SCILOGEX	8042210200
Spring scissors	RWD	S11036-08
Sucrose	BioFroxx	1245GR500
Super glue	Deli	7147S
Tennis string (1.24 mm)	Gosen	TS761
Tribromoethanol	Macklin	T831042
Triton X-100	Solarbio	IT9100