この作品は、がんイニシアティブ、5U24CA126477 - 04の臨床プロテオミクス技術によってサポートされていました。

1）レクチンコンジュゲートPOROSカラムを準備します。 <ol><li> 1.2 - 手順1.1の間にPOROS - ALのビーズの吸入を防ぐためにマスクを着用します。 POROSビーズの所望の量（100 mgのbeads/300μlの最終容量）を秤量し、清潔なエッペンドルフチュー​​ブに移す。 </li><li> 1 mLのリン酸緩衝食塩水（PBS）を加えてビーズを洗浄してください。 3分、最高速度で遠心の遠心分離によってペレットのビーズ。上清を除去し、洗浄を繰り返します。 </li><li>非抱合型レクチンの所望の量（1 - 4 mgの/ 200μlのビーズ）を秤量し、清潔なエッペンドルフチュー​​ブに移す。 5を形成するためにPBSを追加 - 20 mg / mLのソリューション。このソリューションの準備25μlの。 </li><li> POROSビーズに、残りのレクチン溶液を移す。最終濃度50mMに、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを追加。ロッカー上にチューブを置き、一晩室温で反応する。 （注：シアノ水素化ホウ素ナトリウムは毒性があり、ドラフト内で処理する必要が汚染された廃棄物は適切に処分する必要があります。。） </li><li>ステップ1.2のようにペレットPOROSビーズ。上清を除去し、後の共役ソリューションとして保存。 </li><li> 1 mLの焼入れバッファー（1 Mトリス- Cl、pH7.4）でビーズを洗浄する。ステップ1.2と安全にペレットのビーズは、上清を捨てる。 </li><li> 1 mLの焼入れBufferでPOROSビーズの残りの反応部位をブロックする。最終濃度50mMに、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを追加。ロッカー上にチューブを置き、30分間室温でインキュベートする。 </li><li>ステップ1.2のようにペレットのビーズと上清を捨てる。 </li><li> 1 mLの1 M NaClでビーズを洗浄してください。ペレットは、ビーズと上清を捨てる。 5回の洗浄の合計4回を繰り返します。ビーズは今パックする準備が整いました。 </li><li> POROSビーズに結合させたタンパク質の量を決定するために、事前にコンジュゲートとポスト共役レクチンソリューションのタンパク質濃度のアッセイを行います。濃度の違いは、ビーズに結合させたタンパク質の量です。ビーズ体積あたりの結合タンパク質の量は、ビーズ上のレクチンの濃度に等しい。ターゲットのレクチンの濃度は2 -20 mg / mLの間です。 </li></ol> 2）PEEK製カラムにレクチンコンジュゲートPOROSビーズパッキング<ol><li>包装システムを組み立て（説明が続く）と金属製のリングスタンドでそれをサポートしています。パッキングシステムは、エンドカラムカプラー1、フリット、カラム（2 × 50 mm）の、最後のカラムカプラ2、列のコネクタ、エンドカラムカプラー3カラム（4.5 × 50 mm）を、圧力制限器、下から上に、構成されています最後のカラムカプラ4とエンドフィッティング。上部の列には、梱包材のための貯水池として機能します。 </li><li>バッファの任意のボリューム（10mMトリス緩衝液、pH7.4、150mM塩化ナトリウム、10mMの塩化カルシウム、10mMの塩化マグネシウム）でPOROSビーズを再懸濁します。つの列（〜200μlのベッドボリューム）を梱包の場合、400μlのBuffer Aに懸濁する</li><li>アッパーカラム（リザーバー）に共役POROSビーズを転送する。バッファーがカラムの上部に到達するまで貯留するバッファに追加します。ゆっくりとカラムに気泡を回避しよう、列の一番上にエンドフィッティングを置きます。 HPLCシステムに上部のカラムのエンドフィッティングを接続します。 </li><li>システムを介してバッファを流してカラムをパック。 0.5mL /分の流速で始まります。 4mL /分または最大圧力（3000 psi）のどちらかに達するまで、0.5mL /分毎分によって流量を増加させる。バッファの少なくとも35 mLをカラムを通過するまで、可能な最大流量で継続する。 </li><li>ポンプの電源をオフにし、カラムの圧力が&lt;20 psiにドロップすることができます。 </li><li>ゆっくりと、上から、包装システムを分解。最後のカラムカプラ2に達したときに、慎重に取り外します。いくつかのパックされた材料は、塔頂から押出されるべきである。かみそりの刃または類似の鋭いエッジで、静かに列の最上部でさえあるビーズ表面を残して、押し出しビーズを拭き取ってください。これを行う間、ビーズに圧力をかけないでください。 </li><li>リングスタンドから充填したカラムを外します。新しいエンドのカプラーに新しいフリットを置き、オープン（旧トップ）コラムの端にフリット/エンドカプラーでこれを接続するための充填カラムを裏返します。 </li><li>適切な列にラベルを付けます。それを使用する準備が整いました。使用しないときは、列を4で0.02％のアジ化ナトリウム℃で6ヶ月までのCを含むPBSに格納されていない可能性があります。 </li></ol> 3）プログラムのHPLC法<ol><li>あなたのHPLCのプログラミングの詳細については、製造元のソフトウェアの仕様に応じて異なります。我々はMichromパラダイムMG4 HPLCを使用してください。このマシン上で、メソッドは画面の上部にある&quot;設定&quot;タブの下に構築され、アクセスされます。次のメソッドをプログラム： <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td>タイム</td><td>流量（μL/分） </td><td> ％ </td><td> ％のB </td></tr><tr><td>午後12時</td><td> 50 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr><tr><td>午前9時00分</td><td> 50 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 9時01 </td><td> 500 </td><td> 0 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 13時50分</td><td> 500 </td><td> 0 </td><td> 100 </td></tr><tr><td>夜01時51分</td><td> 3000 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr><tr><td>午前19時50分</td><td> 3000 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr></tbody></table> 10mMトリス緩衝液（pH7.4）、150mMの塩化ナトリウム、10mMの塩化カルシウム、10mMの塩化マグネシウム：バッファ バッファーB：0.5 M酢酸 UV検出器は、0:00から午前19時50分に280 nmで読み込むようにプログラムする必要があります。 。50 AU - y軸は低吸光度レベルが、 例えば 、0を検出するために調整する必要があります。 </li><li>オートサンプラが使用可能な場合は、フラクションコレクションのための次のスケジュールをプログラムする。クロマトグラフィーを行うときに示されるようにそうでなければ、手で画分を集めた。 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td>分数</td><td>試料注入から収集するまでの遅延</td><td>コレクションの持続時間（分） </td></tr><tr><td>フロースルー</td><td> 2.8 </td><td> 4.1 </td></tr><tr><td>バインド</td><td> 9 </td><td> 2.6 </td></tr></tbody></table></li></ol> 4）HPLC用サン​​プルを調製<ol><li>このプロトコルで使用する前に、ヒト血漿は、MARSの列（;サンタクララ、カリフォルニア州アジレント）を用いて14最も豊富なタンパク質の枯渇してください。枯渇した血漿、ヒトラクトフェリンおよび酵母インベルターゼは、前述の1としてトリプシン消化し ​​、脱塩し、個別にする必要があります。 </li><li>レクチン特異ラクトフェリン標準を準備するには、第3の方法を使用してAALまたはSNAの列のいずれかを介してラクトフェリンをトリプシン消化50μgの上でクロマトグラフィーを行う。結合画分は、レクチン固有のラクトフェリンの糖ペプチドが含まれます。パート6のようにパート4.4のようなサンプル、および脱塩を中和する。得られた試​​料の使用準備が整う1 mLの緩衝液Aでサンプルを再懸濁します。 </li><li> 3つの実験が実行される複製。三人複製用にサンプルを準備するには、30μlのMARS枯渇、トリプシン消化、プラズマ同等物（PE）のトリプシン消化インベルターゼとレクチン特異ラクトフェリン（どちらAAL - LACまたはSNA - LAC）を1μlの3 pmolのを追加。 PEは、処理血漿（MARS欠乏およびトリプシン消化）の所定量が由来するnon-processed/intact/originalプラズマの体積として定義されています。 330μlの最終容量に到達するためのサンプルにバッファに追加します。 </li><li>溶出液を収集するサンプルバイアルに、中和バッファー（1 MトリスpH8.0）を追加します。作業対象とバイアルの数とボリュームは、オートサンプラの制約に依存するであろう。 MG4パラダイムの場合は、1バイアルは、フロースルーと二人溶出液を収集する収集します。それは、約1.5 mLのトリス緩衝液で溶出液を1 mLを中和するために必要になります。ターゲット中和pHが7.0から8.0であり、pH指示薬の紙でテストのテストの最終pH。 </li></ol> 5）クロマトグラフィーを実行<ol><li>続くすべてのブランクとサンプルの実行は、パート1に記載の方法を使用します。列とバッファが使用中に室温でいます。バッファーは室温で保存されている間、列は、4℃で保存されています。 </li><li> HPLCシステムのいずれかにAALまたはSNAレクチンカラムを取り付けて2行の空のメソッドを（のみバッファを注入する）を実行します。レクチンカラムはレクチン固有のラクトフェリン（パート2）に対応していることを確認してください。 </li><li> HPLCの実行7の合計のために、各注入試料との間に空白を注入し、3つのプラズマのサンプルをクロマトグラフ。ブランクランからの画分は、収集する必要はありません。 </li></ol> 6）脱塩画分を集め各分画のために次のように1つ1 mLのウォーターズオアシスHLB SPEカートリッジを使用します。 <ol><li>真空マニホールドに必要なカートリッジの数を取り付けます。 </li><li> 1％ギ酸（ - 20 lnHgマニホールド上に真空計が5をお読みください）​​に1 mLの80％ACNで各カートリッジを濡らす。 </li><li> 1.5 mLの0.1％ギ酸（ - 20 lnHgマニホールド上に真空計が5をお読みください）​​でカートリッジを平衡化する</li><li>つのカートリッジの上に一つのサンプルのボリューム全体をロードする（マニホールド上に真空ゲージは2をお読みください - 2.5 lnHgを、と流速は1 mL /分を超えないようにしてください） </li><li> 3 × 1 mLの0.1％ギ酸でカートリッジを洗浄してください（マニホールド上に真空計が5をお読みください - 20 lnHgを） </li><li> 0.1％ギ酸で1 × 1 mLの80％アセトニトリルで標識したエッペンドルフチュー​​ブに溶出ペプチド/糖ペプチド。シングルコレクションチューブが各カートリッジに使用されるべきである - （2.5 lnHgを、そして流速は1mL /分を超えないようにしてくださいマニホールド上の真空計は、2をお読みください。）。 </li><li>それぞれのコレクションチューブに60μlの0.5 M炭酸水素アンモニウムを添加することにより溶出液を中和する。ターゲットneutralized pHは7.0から8.0です。pH指示薬の紙でテスト最終pH。 </li><li> 〜2時 ​​間@ 35℃のために（ 例えば、サーモSavantのSpeedVac）真空遠心分離でそれらを実行することによって溶出されたペプチド/〜50μLの糖ペプチドを濃縮する</li></ol> 7）PNGase F消化<ol><li>それを確実にするために、テストサンプルのpHは7.0の間です - 8.0。必要に応じて、pHを上げるために50 mM重炭酸アンモニウムを追加。それは50〜100μlの間になるまでであれば、最終的なサンプル量は&gt; 100μlを、speedvacサンプ​​ルです。 </li><li> 37℃で一晩各サンプルチューブとインキュベートする0.5μlの（250 U）グリセロールフリーPNGase Fを追加します。 </li></ol> 8）郵便番号のヒントのサンプル<ol><li> PNGase F消化サンプルから始めて、次のようにそれぞれをziptip。 </li><li> 10μlの100％アセトニトリル、10μlの80％アセトニトリル、0.1％ギ酸が続くとウェットziptip。 </li><li> 20μlの0.1％ギ酸でziptipを平衡化させます。 </li><li> ziptipの行列を上下に10回、それをピペッティングすることによりziptipにサンプルをロードします。 </li><li> 10μlの0.1％ギ酸、5回ピペッティングしてziptipを洗ってください。 </li><li> 10μlの80％アセトニトリル、0.1％ギ酸できれいなエッペンドルフチュー​​ブにサンプルを溶出させる。 </li><li>溶出を繰り返すと、同じチューブに次の10μlを加える。 </li><li> &lt;2μlのためにサンプルをSpeed​​vac。 </li><li> 20μlの0.1％ギ酸でサンプルを再懸濁します。現在、サンプルLC-MS/MSによる分析のための準備が整いました。 </li></ol> 9）代表的な結果： 20 mg / mlの - POROSの接合は、通常2の範囲内で、ビーズレクチン濃度が得られます。これは、アフィニティークロマトグラフィーに最適です。 トリプシン消化MARS欠乏ヒト血漿のレクチンクロマトグラフィーが一般的に結合画分の糖ペプチドを豊かに。糖ペプチドがPNGase前LC-MS/MSにF -扱われるように、それらはアスパラギンがに変換されているN -結合コンセンサス配列、NXS / T（Xは任意の残留物がプロリンである）、を有するペプチドとして同定されていますこれらの特性を持つPNGase Fのペプチドの作用によってアスパラギン酸は、脱グリコシル化ペプチド（または&quot;deglycopeptides&quot;）とみなされます。結合画分に回収されたペプチドの30〜50％がdeglycopeptidesであるのに対し、平均でAALまたはSNAクロマトグラフィーからのフロースルー（FT）割合は、2〜4％のdeglycopeptidesが含まれています。通常は、QSTARエリートを使用して、1000年から1300年のペプチドは、FTの割合で識別される、および200から400ペプチドを結合画分で識別されます。二つ以上の別個のインベルターゼdeglycopeptidesは、FTフラクションと結合画分（表1）、2つ以上の別々のラクトフェリンのdeglycopeptidesで観察されるべきである。 <img src="/files/ftp_upload/1398/1398table.jpg" alt="表1" /> 表1。

<ol>
	<li>Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=multiplexed+assays+for+low+abundance+proteins+in+plasma+by+targeted+mass+spectrometry+and+stable+isotope+dilution.">multiplexed assays for low abundance proteins in plasma by targeted mass spectrometry and stable isotope dilution.</a> Mol Cell Proteomics. 6, 2212-2229 (2007).</li></ol>

このプロトコルは糖鎖特異的に糖ペプチドを単離および同定するための迅速な方法を提供する。グリコシル化は、特に開発や病態の間に、生体内で広範囲に変化するにつれ、この手法は、質問の様々な対処するために必要となる場合があります。特に、我々は選択的バイオマーカー探索への第一歩として、癌関連エピトープで変更された糖ペプチドを豊かにする方法を使用しています。

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Human plasma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>We make this in house</td>
</tr>
<tr>
<td>Human lactoferrin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L0520</td>
<td>Trypsin-digest before use</td>
</tr>
<tr>
<td>Yeast invertase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>I0408</td>
<td>Trypsin-digest before use</td>
</tr>
<tr>
<td>Oass HLB SPE cartridges</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Waters</td>
<td>WAT094225</td>
<td>1 cc volume</td>
</tr>
<tr>
<td>ZipTip pipet tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>ZTC1 8M0 96</td>
<td>Millipore, C18 for 10 ml pipette</td>
</tr>
<tr>
<td>Tris</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP154-1</td>
<td>99%</td>
</tr>
<tr>
<td>Ammonium bicarbonate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A6141</td>
<td>99%</td>
</tr>
<tr>
<td>Calcium chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C4901</td>
<td>96%</td>
</tr>
<tr>
<td>Magnesium chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M8266</td>
<td>98%</td>
</tr>
<tr>
<td>Acetic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>242853</td>
<td>99.7%</td>
</tr>
<tr>
<td>pH indicator paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>M95903</td>
<td>Range 0-14</td>
</tr>
<tr>
<td>Acetonitrile</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>A998</td>
<td>99.9%</td>
</tr>
<tr>
<td>Formic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pierce</td>
<td>28905</td>
<td>99%</td>
</tr>
<tr>
<td>Phosphate-buffered saline</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14190-136</td>
<td>Without calcium and magnesium</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium azide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>71289</td>
<td>99.5%</td>
</tr>
<tr>
<td>PNGase F</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>P0705L</td>
<td>Glycerol-free</td>
</tr>
<tr>
<td>Vacuum-filter flasks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>SCGVU05RE</td>
<td>0.2 mm pores</td>
</tr>
<tr>
<td>POROS-AL beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems</td>
<td>1-6028-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Aleuria aurantia lectin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>L-1390</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sambucus nigra agglutinin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>L-1300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium cyanoborohydride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>296945</td>
<td>5.0 M solution</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

a lectin hplc method to enrich selectively-glycosylated peptides from complex biological samples

糖鎖は翻訳後修飾の重要なクラスです。一般的に分泌し、細胞外分子に見られる、糖鎖構造は細胞の内部状態を通知。腫瘍細胞上の糖鎖は、豊富なシアル酸およびフコース部分を持っている傾向がある。我々は、これらの癌関連糖鎖の変異体は、初期段階の疾患の診断を目指したバイオマーカー開発のために利用されることを提案する。したがって、我々は、レクチン、特定の糖鎖構造に結合するタンパク質から形成された親和性のマトリックスでのクロマトグラフィーを組み込んだ質量分析ベースのワークフローを開発しました。それぞれ、シアル酸およびフコースに結合するレクチンニワトコ黒（SNA）とヒイロチャワンタケ（AAL）は、共有結合POROSビーズ（アプライドバイオシステムズ社）に結合し、高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）用PEEK製カラムに充填した。 （;アジレントMARS - 14）簡単に言うと、プラズマは、マルチプルアフィニティ除去システム​​を使用してfourteen最も豊富な蛋白質の枯渇した。枯渇したプラズマは、SNAまたはAAL HPLCによるトリプシン消化し、フロースルーと結合した画分に分離した。画分をN -結合型グリカンを除去するPNGaseFで処理し、QSTARのエリートのLC-MS/MSで分析した。データは、マスコットのソフトウェアを用いて分析した。実験的なデザインは、サッカロマイセスセレビシエ-レクチンキャプチャの特異性を監視するために使用されてからポジティブコントロール-フコシル化とシアル酸ヒトラクトフェリンの糖ペプチドとコントロールの高マンノース糖陰性が含まれています。このワークフローの主な機能は、HPLCのフォーマット、それらの脱アミドAsn-Xxx-Ser/ThrのモチーフからキャプチャしたとPNGaseF処理糖ペプチドの正の同定、および糖タンパク質の標準を使用して、品質評価から得られる再現性が含まれています。プロトコル最適化はまた、カラムの容量に、出発物質の最も効率的なキャプチャと溶出バッファーを識別し、完全な脱グリコシル化を確保するためにPNGaseF処理を監視するのに適切な比率を決定するが含まれています。今後の方向性は、乳がん患者と対照個体からのプラズマの質量分析ベースの検出実験を実行するには、このワークフローを使用して含まれています。

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A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

レクチン抱合POROSビーズはHPLCに使用した。糖ペプチドの基準は、ポジティブとネガティブコントロールとして役立った。 MARS - 14欠乏、トリプシン消化したヒト血漿をクロマトグラフィー及びフロースルー（FT）と結合した分画はESI-LC-MS/MS分析のために収集された。 FTに比べて糖ペプチドを結合画分に濃縮した。

複雑な生体試料から選択的グリコシル化ペプチドを豊かにするためにレクチンHPLC法

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the ...

a-lectin-hplc-method-to-enrich-selectively-glycosylated-peptides-from

Research

JoVE Journal

Biology

15.9K ビュー.  University of California, San Francisco - UCSF. レクチン抱合POROSビーズはHPLCに使用した。糖ペプチドの基準は、ポジティブとネガティブコントロールとして役立った。 MARS - 14欠乏、トリプシン消化したヒト血漿をクロマトグラフィー及びフロースルー（FT）と結合した分画はESI-LC-MS/MS分析のために収集された。 FTに比べて糖ペプチドを結合画分に濃縮した。

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T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. The speed by which the ions traverse the drift region depends on their size: large ions will experience a greater number of collisions with the background inert gas (usually N2) and thus travel more slowly through the IM device than those ions that comprise a smaller cross-section. In general, the time it takes for the ions to migrate though the dense gas phase separates them, according to their collision cross-section (&Omega;). 
Recently, IM spectrometry was coupled with mass spectrometry and a traveling-wave (T-wave) Synapt ion mobility mass spectrometer (IM-MS) was released. Integrating mass spectrometry with ion mobility enables an extra dimension of sample separation and definition, yielding a three-dimensional spectrum (mass to charge, intensity, and drift time). This separation technique allows the spectral overlap to decrease, and enables resolution of heterogeneous complexes with very similar mass, or mass-to-charge ratios, but different drift times. Moreover, the drift time measurements provide an important layer of structural information, as &Omega; is related to the overall shape and topology of the ion. The correlation between the measured drift time values and &Omega; is calculated using a calibration curve generated from calibrant proteins with defined cross-sections1.
The power of the IM-MS approach lies in its ability to define the subunit packing and overall shape of protein assemblies at micromolar concentrations, and near-physiological conditions1. Several recent IM studies of both individual proteins2,3 and non-covalent protein complexes4-9, successfully demonstrated that protein quaternary structure is maintained in the gas phase, and highlighted the potential of this approach in the study of protein assemblies of unknown geometry. Here, we provide a detailed description of IMS-MS analysis of protein complexes using the Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd; the only commercial IM-MS instrument currently available)10. We describe the basic optimization steps, the calibration of collision cross-sections, and methods for data processing and interpretation. The final step of the protocol discusses methods for calculating theoretical &Omega; values. Overall, the protocol does not attempt to cover every aspect of IM-MS characterization of protein assemblies; rather, its goal is to introduce the practical aspects of the method to new researchers in the field.

Ion mobility-mass spectrometry is an emerging gas-phase technology that separates ions, based on their collision cross-section and mass. The method provides three-dimensional information on the overall topology and shape of protein complexes. Here, we outline a basic procedure for instrument setting and optimization, calibration of drift times, and data interpretation.

T波イオンモビリティー質量分析：タンパク質複合体解析のための基本的な実験手順

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

生物学

Peptides from Phage Display Library Modulate Gene Expression in Mesenchymal Cells and Potentiate Osteogenesis in Unicortical Bone Defects

Two novel synthetic peptides accelerate bone formation and can be delivered using a collagen matrix. The aim of this study was to investigate the effects on bone repair in a unicortical defect model. Treatment of mesenchymal cells produced an increase in alkaline phosphatase activity, showed nodule formation by the cells, and increased the expression of genes for runx2, osterix, bone sialoprotein, and osteocalcin. A collagen sponge soaked with peptide promoted repair of bone defects, whereas the control was less effective. The results from this study demonstrated that mesenchymal cells treated with peptide in vitro differentiate towards osteogenesis, and, that peptides delivered in vivo using a collagen sponge promote the repair of unicortical defects.

A phage display library was used to identify peptide sequences that target bone. The objective was to investigate the effect of these peptides on mesenchymal cell differentiation and to determine their effect on bone regeneration.

ファージディスプレイライブラリーからのペプチドは、間葉系細胞における遺伝子発現を調整するとUnicortical骨欠損に骨形成を増強する

Two novel synthetic peptides accelerate bone formation and can be delivered using a collagen matrix. The aim of this study was to investigate the effects ...

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in 73 different countries throughout Africa, Asia, Europe, New Zealand, Oceania and the Americas1-2. Cogongrass forms rapidly-spreading, monodominant stands that displace a large variety of native plant species and in turn threaten the native animals that depend on the displaced native plant species for forage and shelter. To add to the problem, an ornamental variety [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] is widely marketed under the names of Imperata cylindrica 'Rubra', Red Baron, and Japanese blood grass (JBG). This variety is putatively sterile and noninvasive and is considered a desirable ornamental for its red-colored leaves. However, under the correct conditions, JBG can produce viable seed (Carol Holko, 2009 personal communication) and can revert to a green invasive form that is often indistinguishable from cogongrass as it takes on the distinguishing characteristics of the wild-type invasive variety4 (Figure 1). This makes identification using morphology a difficult task even for well-trained plant taxonomists. Reversion of JBG to an aggressive green phenotype is also not a rare occurrence. Using sequence comparisons of coding and variable regions in both nuclear and chloroplast DNA, we have confirmed that JBG has reverted to the green invasive within the states of Maryland, South Carolina, and Missouri. JBG has been sold and planted in just about every state in the continental U.S. where there is not an active cogongrass infestation. The extent of the revert problem in not well understood because reverted plants are undocumented and often destroyed.
Application of this molecular protocol provides a method to identify JBG reverts and can help keep these varieties from co-occurring and possibly hybridizing. Cogongrass is an obligate outcrosser and, when crossed with a different genotype, can produce viable wind-dispersed seeds that spread cogongrass over wide distances5-7. JBG has a slightly different genotype than cogongrass and may be able to form viable hybrids with cogongrass. To add to the problem, JBG is more cold and shade tolerant than cogongrass8-10, and gene flow between these two varieties is likely to generate hybrids that are more aggressive, shade tolerant, and cold hardy than wild-type cogongrass. While wild-type cogongrass currently infests over 490 million hectares worldwide, in the Southeast U.S. it infests over 500,000 hectares and is capable of occupying most of the U.S. as it rapidly spreads northward due to its broad niche and geographic potential3,7,11. The potential of a genetic crossing is a serious concern for the USDA-APHIS Federal Noxious Week Program. Currently, the USDA-APHIS prohibits JBG in states where there are major cogongrass infestations (e.g., Florida, Alabama, Mississippi). However, preventing the two varieties from combining can prove more difficult as cogongrass and JBG expand their distributions. Furthermore, the distribution of the JBG revert is currently unknown and without the ability to identify these varieties through morphology, some cogongrass infestations may be the result of JBG reverts. Unfortunately, current molecular methods of identification typically rely on AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) and DNA sequencing, both of which are time consuming and costly. Here, we present the first cost-effective and reliable PCR-based molecular genotyping method to accurately distinguish between cogongrass and JBG revert.

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

We provide a cost-effective and rapid molecular genotyping protocol that employs variety-specific PCR primers that target DNA sequence differences within the chloroplast trnL-F spacer region to differentiate between varieties of Imperata cylindrica (cogongrass) that cannot be distinguished by morphology alone. These varieties include the federally listed noxious weed, cogongrass and closely-related, wide-spread ornamental variety, I. cylindrica var. koenigii (Japanese blood grass).

の野生型と観賞用品種を区別するPCRベースのジェノタイピング法チガヤ</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities. It is particularly useful for those compounds which possess therapeutic value but cannot be sufficiently produced or would benefit from an improved form of production. The experimental procedures involved can be subdivided into three components: 1) genetic transfer; 2) heterologous reconstitution; and 3) product analysis. Each experimental component is under continual optimization to meet the challenges and anticipate the opportunities associated with this emerging approach.
Heterologous biosynthesis begins with the identification of a genetic sequence responsible for a valuable natural product. Transferring this sequence to a heterologous host is complicated by the biosynthetic pathway complexity responsible for product formation. The antibiotic erythromycin A is a good example. Twenty genes (totaling &gt;50 kb) are required for eventual biosynthesis. In addition, three of these genes encode megasynthases, multi-domain enzymes each ~300 kDa in size. This genetic material must be designed and transferred to E. coli for reconstituted biosynthesis. The use of PCR isolation, operon construction, multi-cystronic plasmids, and electro-transformation will be described in transferring the erythromycin A genetic cluster to E. coli.
Once transferred, the E. coli cell must support eventual biosynthesis. This process is also challenging given the substantial differences between E. coli and most original hosts responsible for complex natural product formation. The cell must provide necessary substrates to support biosynthesis and coordinately express the transferred genetic cluster to produce active enzymes. In the case of erythromycin A, the E. coli cell had to be engineered to provide the two precursors (propionyl-CoA and (2S)-methylmalonyl-CoA) required for biosynthesis. In addition, gene sequence modifications, plasmid copy number, chaperonin co-expression, post-translational enzymatic modification, and process temperature were also required to allow final erythromycin A formation.
Finally, successful production must be assessed. For the erythromycin A case, we will present two methods. The first is liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) to confirm and quantify production. The bioactivity of erythromycin A will also be confirmed through use of a bioassay in which the antibiotic activity is tested against Bacillus subtilis. The assessment assays establish erythromycin A biosynthesis from E. coli and set the stage for future engineering efforts to improve or diversify production and for the production of new complex natural compounds using this approach.

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

The heterologous biosynthesis of erythromycin A through E. coli includes the following experimental steps: 1) genetic transfer; 2) heterologous reconstitution; and 3) product analysis. Each step will be explained in the context of the motivation, potential, and challenges in producing therapeutic natural products using E. coli as a surrogate host.

を経て製造複合抗生物質エリスロマイシンをフィーチャーロジック、実験の手順、および異種天然物合成の可能性<em&gt; E大腸菌の</em

The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities.  It is ...

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and evolution of developmental processes. The sea star, Patiria miniata, is gaining prevalence as a model system for these types of studies which were previously performed almost exclusively in the sea urchins, Strongylocentrotus purpuratus and Lytechinus variegatus. An advantage of these model systems is the ease of producing modified embryos in which a particular gene is up or downregulated, labeling a group of cells, or introducing a reporter gene. A single microinjection method is capable of creating a wide variety of such modified embryos. Here, we present a method for obtaining gametes from P. miniata, producing zygotes, and introducing perturbing reagents via microinjection. Healthy morphant embryos are subsequently isolated for quantitative and qualitative studies of gene function. The availability of genome and transcriptome data for this organism has increased the types of studies that are performed and the ease of executing them.

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Methods that produce morphant embryos are essential to study developmental mechanisms and gene regulatory networks. The sea star Patiria miniata is an emerging model system for these studies. Here we present a protocol for obtaining gametes, producing cultures of embryos, and rapid microinjection of zygotes from this species.

のマイクロインジェクション法<em&gt; Patiria minata</em&gt;接合体

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and microbial communities, a comprehensive workflow for DNA and RNA extraction was developed. The workflow concurrently generates viral and microbial metagenomes, as well as metatranscriptomes, from a single sample for next-generation sequencing. The coupling of these approaches provides an overview of both the taxonomical characteristics and the community encoded functions. The presented methods use Cystic Fibrosis (CF) sputum, a problematic sample type, because it is exceptionally viscous and contains high amount of mucins, free neutrophil DNA, and other unknown contaminants. The protocols described here target these problems and successfully recover viral and microbial DNA with minimal human DNA contamination. To complement the metagenomics studies, a metatranscriptomics protocol was optimized to recover both microbial and host mRNA that contains relatively few ribosomal RNA (rRNA) sequences. An overview of the data characteristics is presented to serve as a reference for assessing the success of the methods. Additional CF sputum samples were also collected to (i) evaluate the consistency of the microbiome profiles across seven consecutive days within a single patient, and (ii) compare the consistency of metagenomic approach to a 16S ribosomal RNA gene-based sequencing. The results showed that daily fluctuation of microbial profiles without antibiotic perturbation was minimal and the taxonomy profiles of the common CF-associated bacteria were highly similar between the 16S rDNA libraries and metagenomes generated from the hypotonic lysis (HL)-derived DNA. However, the differences between 16S rDNA taxonomical profiles generated from total DNA and HL-derived DNA suggest that hypotonic lysis and the washing steps benefit in not only removing the human-derived DNA, but also microbial-derived extracellular DNA that may misrepresent the actual microbial profiles.

Using the cystic fibrosis airway as an example, the manuscript presents a comprehensive workflow comprising a combination of metagenomic and metatranscriptomic approaches to characterize the microbial and viral communities in animal-associated samples.

複雑な動物に関連したサンプルからのシーケンシングメタゲノムとMetatranscriptomes：不純を精製する

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses performed. Considering that the use of new bacterial community analysis techniques (e.g., microbiomics, metagenomics) is becoming more prevalent in the agricultural and environmental sciences and many environmental samples within these disciplines can be physiochemically and microbiologically unique (e.g., fecal and litter/bedding samples from the poultry production spectrum), appropriate and effective DNA extraction methods need to be carefully chosen. Therefore, a novel semi-automated hybrid DNA extraction method was developed specifically for use with environmental poultry production samples. This method is a combination of the two major types of DNA extraction: mechanical and enzymatic. A two-step intense mechanical homogenization step (using bead-beating specifically formulated for environmental samples) was added to the beginning of the &#8220;gold standard&#8221; enzymatic DNA extraction method for fecal samples to enhance the removal of bacteria and DNA from the sample matrix and improve the recovery of Gram-positive bacterial community members. Once the enzymatic extraction portion of the hybrid method was initiated, the remaining purification process was automated using a robotic workstation to increase sample throughput and decrease sample processing error. In comparison to the strict mechanical and enzymatic DNA extraction methods, this novel hybrid method provided the best overall combined performance when considering quantitative (using 16S rRNA qPCR) and qualitative (using microbiomics) estimates of the total bacterial communities when processing poultry feces and litter samples.

A novel semi-automated hybrid DNA extraction method for use with environmental poultry production samples was developed and demonstrated improvements over a common mechanical and enzymatic extraction method in terms of the quantitative and qualitative estimates of the total bacterial communities.

家禽生産のサンプルからの細菌群集の定性的および定量的評価のためのハイブリッドDNA抽出法

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Removal of Exogenous Materials from the Outer Portion of Frozen Cores to Investigate the Ancient Biological Communities Harbored Inside

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect conditions over vast time periods and investigation of biological materials harbored inside could provide insight of ancient environments. To appropriately analyze these ecosystems and extract meaningful biological information from frozen soils and ice, proper collection and processing of the frozen samples is necessary. This is especially critical for microbial and DNA analyses since the communities present may be so uniquely different from modern ones. Here, a protocol is presented to successfully collect and decontaminate frozen cores. Both the absence of the colonies used to dope the outer surface and exogenous DNA suggest that we successfully decontaminated the frozen cores and that the microorganisms detected were from the material, rather than contamination from drilling or processing the cores.

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. A protocol is presented to collect and decontaminate permafrost cores of soils and ice. The absence of exogenous colonies and DNA suggest that microorganisms detected represent the material, rather than contamination from drilling or processing.

古代生物群集抱いて内部を調査するための冷凍コアの外側部分からの外因性物質の除去

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

走査型透過電子トモグラフィーにより太い生物学的サンプルの調製と観察

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.