著者らは、異種の生合成に特化プロジェクトを支援するための資金のためのNIH（AI074224とGM085323）とNSF（0712019および0924699）に感謝。

下のテキストは、エリスロマイシン抗生物質に特異的であるが、手順は、異種合成の候補として他の天然物に一般的に適用できるように設計されています。 1。エリスロマイシン遺伝クラスタ転送<ol><li>エリスロマイシン·S内のクラスタに関連付けられたすべての遺伝子を増幅するためのPCRプライマーを設計erythraea染色体。このステップでは、その遺伝子の塩基配列が決定されたこれらの自然の製品候補に固有のものです。あるいは、必要な遺伝子が新たに合成された遺伝子は、E.新しい内最適コドン使用のために設計されるという利点が（いくつかの商用ベンダーオプションを使用して）合成することができる大腸菌宿主。 DNA合成が追求されている場合は、現在の課題は、長さが10キロバイトを超える場合がありますmegasynthase遺伝子を生成しています。技術的には、合成が達成されますが、それは挑戦的で高価であることができます。それが懸念されている継続的なimprovem遺伝子合成技術の親は現在の欠点を解決し、更なる異種遺伝物質を提供するため、このアプローチを検証します。 </li><li>作りたてのSを使用して PCRを行い、テンプレートとしてerythraeaゲノムDNA。染色体DNAは、S.の培養物から調製することができるerythraeaまたは細菌の凍結ストックから（ 図3）25。 PCR反応は、ターゲットの高G+ C含量を考慮するためにDMSOの添加（50μlの反応で4μl）の恩恵を受ける可能性があり、S. erythraea遺伝子 。各増幅された遺伝子は、完全な遺伝子が取り​​出されたことと全く変異がPCRプロセスの間に導入されていないことを確認するために配列決定されるべきである。 </li><li>制限酵素消化およびライゲーションを通して、 大腸菌用に設計された発現ベクターに単離された遺伝子のそれぞれを挿入する大腸菌 （ 図3）。これは、適切な事後に消化し、ライゲーションを可能にするためのPCRプライマー内に制限部位を設計することによって開始されpressionベクター（例えば、 図3に含まれています）。我々はpET21とpET28ベク​​トルの両方を使用しています。 pET28ベク​​ターは、エリスロマイシンの場合に遺伝子発現を助けた5 &#39;リーダー配列を含めることができる。 RT-PCR法、SDS-PAGE分析（可溶性タンパク質画分を使用）、または便利な表現型アッセイ（ 図4）を介して個々の遺伝子の発現を確認してください。 </li><li>首尾よく、個々の発現プラスミド（ 図3）から発現された遺伝子に基づいオペロンを構築します。我々は伝統的に順次オペロンに遺伝子を変換するために互換性のある、まとまりの制限酵素（例えばXbaIおよびSPE私のような）24の組み合わせを使用していますが、オペロンの構築のために選ばれた制限部位は内に存在しなければなりません（または削除する必要があります）孤立を遺伝子配列（遺伝子合成が使用されていれば回避できる問題）。このステップは、 大腸菌の前に20エリスロマイシンの遺伝子を統合大腸菌 transformation。現在、我々は標準pETベクターへの外来DNAの20キロバイト（〜10キロバイトずつの2つの遺伝子）まで含めるには、このメソッドを使用している。さらに、我々は9遺伝子を含むオペロンを生成するには、このアプローチを使用している。それは不明である正確にどのように多くのDNAまたはどのように多くの遺伝子をpET-型プラスミドに組み込まれてもよいが、メトリックは、エリスロマイシンの生合成経路のような複雑なシステムのための基準を提供する上で引用。最後に、標準は in vitroライゲーションステップおよび後続の成功の変換ステップでオペロンおよびプラスミドサイズが大きくなるにつれて、ますます困難になる。ライゲーション温度（12から22℃）と時間（3月24日HR）多様であると電気の変換が最終プラスミドコンストラクトを作製するプロセスを支援するために使用されます。 </li><li> Eに新たに設計された合成プラスミドを形質転換大腸菌は 、電気の変換（ 図5）を使用して BAP1を痛める。手順は、順次または共同で導入されたプラスミドを用いて試みられるかもしれないmbination。サイズ可能または多数のプラスミドを形質転換するとき、我々は伝統的に（などの化学変換とは対照的に）電気の変換を使用しています。一度プレートテトラサイクリン（5 mg / l）の、カルベニシリン（100mg / lの）、カナマイシン（50 mg / l）の、ストレプトマイシン（50mg / lの）、およびアプラマイシン（50mg / lのを含む固体LB培地上の細胞は、形質転換）プラスミドの維持のために選択します。それは、Eの6つの異なる選択抗生物質はポスト変換を使用するのは非常に異例のことだ大腸菌細胞が、これは単に最後のエリスロマイシンの生合成を可能にするために必要なプラスミドの総数を反映している。可能ですが、アプローチが培養回化合物の生産能力が制限されます（以下を参照してください）​​を開始しました。 </li></ol> 2、E.大腸菌の生合成再構成<ol><li>ひずみBAP1は生合成に必要な基質を提供し、翻訳後エリスロノリドBのmegasynthaseを変更するように設計されています。 erytの個々の遺伝子hromycin経路は、遺伝子発現および発現プラスミドにオペロンとしての連結のためにテストされています。このセクションでは、フルエリスロマイシン経路の協調的活動のためにテストするための培養条件に捧げられています。 </li><li>新たに変換BAP1の3つの別々のコロニーを取り、必要なプラスミドの選択抗生物質（同じ濃度で固体培地上で形質転換体を選択する上で示した）、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG含む1.5 mlのLB培養液接種し、100μMを）、アラビノース（2 mg / ml）の遺伝子発現を誘導するため、細胞内生合成前駆体の形成をサポートするためにプロピオン20mMのナトリウム。生が確認された後、大規模な文化は、製品の価をスケーリングし、最大化するための試みで行われてもよい。 </li><li> 24から48時間、22℃、250rpmで培養は、細胞。この場合には、抗生物質の選択は、必要なプラスミドは細胞培養の初期段階で維持されることを保証します。しかし、プラスミド選択抗生物質の濃度は培養時間の経過とともに変更されたとおりの、sは簡単に失われる可能性があります。そして、これは生産能力が制限されるプラスミドの不安定性（ すなわち 、培養中に1つまたは複数のプラスミドの損失）につながる可能性があります。互換性のないプラスミドを完全異種遺伝子クラスターを導入するために使用されたとき問題は悪化する。このような化合物は、エリスロマイシン（ 図5）の場合ですと本当にEから化合物を過剰に是正されなければならないでしょう大腸菌 。ただし、初期生産を実証する目的で、このような設計上の欠陥は、迅速に異種のアプローチの実現可能性を確立するために許容される。 </li><li>エッペンドルフマイクロフュージで10,000 rpmで遠心分離することにより文化を明らかにする。分析のために4の上清およびストア°Cを削除します。 </li><li>エリスロマイシンA、化合物生産の不足の場合pGro7を使用GroESの/ ELシャペロニン（を含めることによって対処されました具体的には（弱い発現/活性の疑い、それらの遺伝子のための）酵素の発現後）の活性の欠如に対処し、付加的な遺伝子コピーの包含する。同様の戦略は、他の異種天然産物の生産努力で必要になることがあります。 </li></ol> 3。製品分析<ol><li>形成を確認し、エリスロマイシンを定量化するために、LC-MSシステム（ 図6）に培養上清を注入します。市販エリスロマイシンは、生産を確認し、定量時の標準としてするために使用された。市販の規格のない症例では、LC-MS分析は、NMRと高分解能質量分析法による付加的な化学特性を必要とするであろう。 </li><li> BAP1変換から3コロニー/文化間の生産と比較してください。最高の生産者を選択し、コロニー·ソースからのグリセロールストックを準備します。この手順は、プロトコルセクションの生産文化と並行して行うことができますグリセロールストックを準備するために文化のごく一部を使って2。 -80℃の冷凍庫にグリセロールストックを保管してください。 </li><li>確認され、最も高い産生細胞株を用いて、独立した生産培養を開始し、酢酸エチルで2倍のボリュームとの最終的な上澄みを抽出します。抽出液を乾燥し、100μlのメタノール中に再懸濁するために真空蒸発システムを使用してください。滅菌フィルターディスク（〜1/4インチ径）にエキスを移し、ディスクが乾燥することができます。これとは別に、文化B.一晩LB液体で枯草 。 Bの20μlを添加し45℃の液体LB寒天20mlに菌の培養℃のプレート寒天固化することができます。 37°C（ 図7）で、プレートとインキュベートにフィルターディスクを挿入します。あるいは、抽出物をプレートリーダー（ 図7）を使用して、アクティビティを定量化するために、96ウェルプレート内で液体培養液に添加することができます。 </li></ol>

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特別な利害関係は宣言されません。

異種合成における重要なステッププロセス内の3つの手続きの各時点で発生している：1）遺伝的伝達、2）生合成の再構成、3）製品分析。いずれかの段階で問題は異種合成の確立を究極の目的を脱線させるでしょう。これは絶対に成功した解析を可能にするために必要とされているので、おそらくプロセスの最も困難な側面は、再構成された生合成を確立しています。しかし、再構成は、最終...

エリスロマイシンは、グラム陽性土壌細菌サッカerythraeaによって生成されるポリケチド抗生物質であり、現在の生産量は徐々に伝統的な変異誘発およびスクリーニングプロトコルの十年を通じて、より最近でプロセスの最適化スキーム〜1-6〜10グラム/ Lに向上しました。変異誘発およびスクリーニング戦略は培養及び/の難しさの結果として、または遺伝的にネイティブの本番ホストを操作し、容易に入手できるので、抗生物質活性や選択を支援するための改善された成長の表現型の抗生物質の天然製品開発では一般的である。エリスロマイシンA、Sの場合にはerythraea生産と新規な誘導体の生合成の急速な進歩を妨げ、したがって、遅い成長プロファイルとより直接的な遺伝子操作技術の欠如（ 大腸菌などの生物に比較して）によって制限されます。生産性の問題を認識し、diversificatiの鍵を開けたエリスロマイシンAのような化合物を用いた可能性について、研究コミュニティは異種合成（ 図1）7のアイデアを追求し始めた。これらの努力は、エリスロマイシン遺伝子クラスター8月11日のために利用可能な配列情報と一致した。それを配列決定し、複雑な天然物の遺伝子クラスターの数が大幅にエンコードされた薬効がある可能性にアクセスするための異種合成における継続的な努力のための原動力を提供し、12から16を拡大したことを強調すべきである。そのためには、異種の再構成は、新しいホストが特定の生合成経路のニーズを満たすことが必要です。E.大腸菌は、技術的な利便性、製品開発のための分子生物学的技術、代謝およびプロセスエンジニアリング戦略のワイドスパンセットを提供します。しかし、ネイティブの本番ホスト、 大腸菌と比較した場合、 大腸菌は、複雑な天然物の生産の同じレベルを示していない。したがって、Eかどうかは不明であった。大腸菌は、複雑な天然物の生合成のための実行可能な異種オプションとして役立つかもしれません。しかし、それは、 大腸菌と仮定した異種合成を達成することができれば、理想的な大腸菌宿主生物であろう。 念頭に置いてこのゴールで、初期の取り組みは、6 -デオキシエリスロノリドB（6dEB）Eを通じてポリケチドアグリコンの製造を開始大腸菌 。ただし、ネイティブE.大腸菌の代謝はプロピオニルCoAのかなりのレベルを提供し、（2S） -メチルマロニルCoAの前駆体は6dEB生合成をサポートするために必要なことができなかったり、新しいホスト·翻訳後エリスロノリドBシンターゼ（DEBS）酵素を変更する可能性があります。これらの問題を解決するには、ネイティブおよび異種酵素から成る代謝経路を大腸菌に組み込まれていたこの経路を完了するためにエンジニアリング時に、SFP遺伝子が目の中に入れた、外生的に供給されたプロピオン酸プロピオニル-CoAとその後（2S） -メチルマロニルCoAに細胞内で変換されたことなどの大腸菌Eの電子染色体BAP1と呼ばれる新しい株を産生する大腸菌 BL21（DE3）。 SFP酵素はDEBS酵素17,18に4&#39;-phosphopantetheine補因子を結合できるトランスフェラーゼphosphopantetheinylです。 3 DEBS遺伝子（それぞれ〜10キロバイト）を、誘導T7プロモーターを含む2つの別々に選択可能な発現ベクター上に置かれた。誘導後の温度（22℃）のキー調整した後、DEBS遺伝子が協調6dEB 19を生成することが可能なアクティブ状態でBAP1内で発現させた。 フルエリスロマイシンの追求が生合成その後スポラmegalomiceaから類似遺伝子クラスターまたはSからの遺伝子から構成されるハイブリッド経路の使用を開始しましたerythraea、S. fradiae、およびS.それぞれ中間エリスロマイシンCと6 -デオキシエリスロマイシンD、20から22を生産venezuelae。最近では、私たちのグループはerythromを生産することによって、これらの努力を拡張しましたE.を通じてycin A（エリスロマイシンの最も臨床的に意義のある形） 大腸菌 。前作とは対照的に、我々の戦略は、協調的に20元Sを表明ポリケチド生合成、デオキシ糖の生合成および添付ファイルは、追加仕立て、自己抵抗（ 図2）のために必要erythraea遺伝子 。合計では、26（ネイティブおよび異種）遺伝子を大腸菌を許可するように設計された4 mg / Lで23,24のエリスロマイシンを産生する大腸菌 。この結果は、 大腸菌を用いて複雑なポリケチド天然物の完全な生産を確立大腸菌やレバレッジ、この新しい制作オプションをするか、新しいものを追求するための基礎として役立つ。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td> PCR装置</td><td>エッペンドルフ</td><td> Mastercycler個人</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド（DMSO） </td><td>フィッシャー</td><td> BP231 </td><td></td></tr><tr><td>エレクトロポ</td><td> BioRad社</td><td> Micropulser </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td>フィッシャー</td><td> BP1620 </td><td></td></tr><tr><td>プロピオン酸ナトリウム</td><td>シグマ</td><td> P1880 </td><td></td></tr><tr><td> L-アラビノース</td><td>シグマ</td><td> A3256 </td><td></td></tr><tr><td>冷蔵シェーカー</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> MAXQ 4000 </td><td></td></tr><tr><td>フュージ</td><td> Eppendorf </td><td>遠心分離機5415D </td><td></td></tr><tr><td> pGro7 </td><td>タカラ</td><td>シャペロンプラスミドセット（3340） </td><td></td></tr><tr><td> pET21、pET28、PCDF-デュエット-1 </td><td> EMDケミカルズ</td><td> 69742から3、69864、71340 </td><td></td></tr><tr><td> LC-MS </td><td>アプライドバイオシステムズ</td><td> 3200 Q-トラップ</td><td></td></tr><tr><td>酢酸エチル</td><td>シグマ</td><td> 270989 </td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>シグマ</td><td> 322415 </td><td></td></tr><tr><td>真空遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>コンセントレータ5301 </td><td></td></tr><tr><td>ロータリーエバポレーター</td><td>ビュッヒ</td><td> R-200 </td><td></td></tr></tbody></table>

the logic, experimental steps, and potential of heterologous natural product biosynthesis featuring the complex antibiotic erythromycin a produced through e. coli

複雑な天然物の異種生産は現在の限界と今後の可能性に対処するために設計のアプローチである。それは治療的価値を有しているが、十分に生産または製造の改良型の恩恵を受けることはできませんこれらの化合物のために特に有用である。 2）異種の再構成、3）製品分析1）遺伝的伝達：関与の実験手順は、次の3つのコンポーネントに分割できます。各実験コンポーネントは課題を満たすとこの新興アプローチに関連する機会を予想する継続的な最適化の下にあります。 異種合成は、貴重な天然物の責任遺伝子配列の同定から始まる。異種宿主に、このシーケンスを転送は、製品の形成に関与する生合成経路の複雑さによって複雑になる。抗生物質のエリスロマイシンが良い例です。二十の遺伝子（）&gt; 50キロバイト、総額は最終的な生合成に必要とされています。さらに、これらの遺伝子の3つのサイズがmegasynthases、マルチドメイン酵素それぞれ〜300kDaのをエンコードします。この遺伝物質を設計し、 大腸菌に転送する必要があります再構成された生合成のための大腸菌 。 PCR産物の分離、オペロンの構築、マルチcystronicプラスミド、および電気変換の使用は、エリスロマイシンの大腸菌への遺伝的クラスタを転送することで説明される大腸菌 。 一度転送、 大腸菌大腸菌細胞は、最終的な生合成をサポートする必要があります。このプロセスは 、Eとの間の実質的な違いは与えられた挑戦している大腸菌や複雑な天然物の形成に関与する最も元ホスト。セルは、生合成をサポートし、協調的に活性な酵素を生成するために転送遺伝クラスタを表現するために必要な基質を提供する必要があります。エリスロマイシンA、Eの場合には大腸菌細胞は、2つの前駆体（PRを提供するように設計しなければなりませんでしたopionyl-CoAと（2S） - メチルマロニルCoA）生合成に必要。また、遺伝子配列の変更、プラスミドのコピー数、シャペロニン共発現、翻訳後修飾酵素、およびプロセス温度も最終エリスロマイシン形成できるようにする必要がありました。 最後に、成功した生産が評価されなければならない。エリスロマイシンのケースでは、我々は2つ​​の方法を紹介します。第一は、液体クロマトグラフィー - 質量分析（LC-MS）が生産を確認し、定量化することである。エリスロマイシンの生物活性はまた、抗生物質活性を枯草菌に対してテストされているバイオアッセイを使用することによって確認される。エリスロマイシン確立アセスメントアッセイEから生合成大腸菌や生産を改善したり、多様化する将来のエンジニアリング作業のために、このアプローチを使用して、新しい複雑な天然化合物の生産のための段階を設定します。

このアプローチの望ましい結果は、 大腸菌から完全に生理活性天然物の生産である異種宿主大腸菌 。これは最高の生産量（ 図6）と（ 図7）は、最終的な活性を確認するために使用される抗菌性バイオアッセイを確認し、定量化するために使用したLC-MSの結果によって表されます。異種合成の全体的なスキームでは、この結果は、成功を定義します。一?...

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The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

スルーエリスロマイシンの異種合成<em&gt; E大腸菌の</em2）異種の再構成、3）製品分析1）遺伝的伝達：&gt;以下のような実験の手順が含まれます。各ステップは、使用しての治療自然な製品の生産に意欲、可能性、そして課題の文脈で説明する<em&gt; E大腸菌の</em&gt;代理ホストとして。

を経て製造複合抗生物質エリスロマイシンをフィーチャーロジック、実験の手順、および異種天然物合成の可能性<em&gt; E大腸菌の</em

The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities.  It is ...

the-logic-experimental-steps-potential-heterologous-natural-product

Research

JoVE Journal

Biology

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

18.4K ビュー.  State University of New York at Buffalo. スルーエリスロマイシンの異種合成 E大腸菌の以下のような実験の手順が含まれます。各ステップは、使用しての治療自然な製品の生産に意欲、可能性、そして課題の文脈で説明する E大腸菌の代理ホストとして。

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Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign plasmid or ligation product into bacteria. This video protocol describes the traditional method of transformation using commercially available chemically competent bacteria from Genlantis. After a short incubation in ice, a mixture of chemically competent bacteria and DNA is placed at 42&deg;C for 45 seconds (heat shock) and then placed back in ice. SOC media is added and the transformed cells are incubated at 37&deg;C for 30 min with agitation. To be assured of isolating colonies irrespective of transformation efficiency, two quantities of transformed bacteria are plated. This traditional protocol can be used successfully to transform most commercially available competent bacteria. The turbocells from Genlantis can also be used in a novel 3-minute transformation protocol, described in the instruction manual.

ヒートショック法による大腸菌へのプラスミドDNAの形質転換

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

生物学

Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs. The array is produced in our laboratory for use by researchers studying gene expression in pine and other conifer species. PtGen2 was developed as a result of our gene discovery efforts in loblolly pine, and is comprised of sequences identified primarily from root tissues, but also from needle and stem.1,2 PtGen2 has been tested by hybridizing different Cy-dye labeled conifer target cDNAs, using both amplified and non-amplified indirect labeling methods, and also tested with a number of hybridization and washing conditions. This video focuses on the handling and processing of slides before and after pre-hybridization, as well as after hybridization, using some modifications to procedures developed previously.3,4 Also included, in text form only, are the protocols used for the generation, labeling and clean up of target cDNA s, as well as information on software used for downstream data processing. 
PtGen2 is printed with a proprietary print buffer that contains high concentrations of salt that can be difficult to remove completely. The slides are washed first in a warm SDS solution prior to pre-hybridization. After pre-hybridization, the slides are washed vigorously in several changes of water to complete removal of remaining salts. LifterSlips&trade; are then cleaned and positioned on the slides and labeled cDNA is carefully loaded onto the microarray by way of capillary action which provides for even distribution of the sample across the slide, and reduces the chance of bubble incorporation. Hybridization of targets to the array is done at 48&deg;C in high humidity conditions. After hybridization, a series of standard washes are done at 53&deg;C and room temperature for extended times. Processing PtGen2 slides using this technique reduces salt and SDS-derived artifacts often seen when the array is processed less rigorously. Hybridizing targets derived from several different conifer RNA sources, this processing protocol yielded fewer artifacts, reduced background, and provided better consistency among different experimental groups of arrays.

The cDNA microarray PtGen2 was developed for gene expression studies in loblolly pine, P. taeda, and other conifer species. Here, we show pre- and post-hybridization handling and washing techniques that can be used with this array to yield better consistency, reduced artifacts, and lower backgrounds.

ロボロリーパインPtGen2 cDNAマイクロアレイの処理

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs.  The array is produced in our laboratory for use by researchers ...

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of the stomach is defined by the mouth opening and the posterior end by the bottom of the pylorus. Along the dorsal side of the stomach lies the stomatogastric nervous system (STNS). This nervous system, which contains rhythmic networks that underlie feeding behavior, is an established model system for studying rhythm generating networks and neuromodulation 1,2. While it is possible to study this system in vivo 3, the STNS continues to produce its rhythmic activity when isolated in vitro. In order to study this system in vitro the stomach must be removed from the animal. This video article describes how the stomach can be dissected from the American lobster. In an accompanying video article4 we demonstrate how the STNS can be isolated from the stomach.

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

We describe the gross dissection of the stomach of the American lobster (Homarus americanus).

ロブスターの胃の肉眼解剖、ロブスター属Americanus</em

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

内タンパク質の定方向進化のための変異導入と機能選択プロトコル E.大腸菌</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

で産生された組換えジスルフィド豊富な毒タンパク質に印加される高スループット定量的発現スクリーニングおよび精製<em&gt; E.大腸菌の</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

酸化ストレスに赤/近赤外光療法の波長および強度の範囲の効果の評価のための手法<em&gt;インビトロ</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

膜タンパク質の緑色蛍光タンパク質ベースの発現スクリーニングで<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. The S domain forms a contiguous scaffold around the viral RNA, whereas the P domain forms viral spikes on the S domain and contains determinants for antigenicity and host-cell interactions. The P domain binds carbohydrate structures, i.e., histo-blood group antigens, which are thought to be important for norovirus infections. In this protocol, we describe a method for producing high quality norovirus P domains in high yields. These proteins can then be used for X-ray crystallography and ELISA in order to study antigenicity and host-cell interactions.
The P domain is firstly cloned into an expression vector and then expressed in bacteria. The protein is purified using three steps that involve immobilized metal-ion affinity chromatography and size exclusion chromatography. In principle, it is possible to clone, express, purify, and crystallize proteins in less than four weeks, which makes this protocol a rapid system for analyzing newly emerging norovirus strains.

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Here, we describe a method to express and purify high quality norovirus protruding (P) domains in E. coli for use in X-ray crystallography studies. This method can be applied to other calicivirus P domains, as well as non-structural proteins, i.e., viral protein genome-linked (VPg), protease, and RNA dependent RNA polymerase (RdRp).

ヒトノロウイルス突出ドメインの生産で<em&gt; E。大腸菌</em&gt; X線結晶用

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. ...

Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

Obstacles present on DNA, including tightly-bound proteins and various lesions, can severely inhibit the progression of the cell&#39;s replication machinery. The stalling of a replisome can lead to its dissociation from the chromosome, either in part or its entirety, leading to the collapse of the replication fork. The recovery from this collapse is a necessity for the cell to accurately complete chromosomal duplication and subsequently divide. Therefore, when the collapse occurs, the cell has evolved diverse mechanisms that take place to restore the DNA fork and allow replication to be completed with high fidelity. Previously, these replication repair pathways in bacteria have been studied using UV damage, which has the disadvantage of not being localized to a known site. This manuscript describes a system utilizing a Fluorescence Repressor Operator System (FROS) to create a site-specific protein block that can induce the stalling and collapse of replication forks in Escherichia coli. Protocols detail how the status of replication can be visualized in single living cells using fluorescence microscopy and DNA replication intermediates can be analyzed by 2-dimensional agarose gel electrophoresis. Temperature sensitive mutants of replisome components (e.g. DnaBts) can be incorporated into the system to induce a synchronous collapse of the replication forks. Furthermore, the roles of the recombination proteins and helicases that are involved in these processes can be studied using genetic knockouts within this system.

Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

We describe here a system utilizing a site-specific, reversible in vivo protein block to stall and collapse replication forks in Escherichia coli. The establishment of the replication block is evaluated by fluorescence microscopy and neutral-neutral 2-dimensional agarose gel electrophoresis is used to visualize replication intermediates.

サイトを誘導する具体的なレプリケーション閉塞中<i&gt; E。大腸菌</i&gt;蛍光プレッサーオペレータシステムの使用

Obstacles present on DNA, including tightly-bound proteins and various lesions, can severely inhibit the progression of the cell&#39;s replication ...

Visualization and Quantification of Mesenchymal Cell Adipogenic Differentiation Potential with a Lineage Specific Marker

Several dyes are currently available for use in detecting differentiation of mesenchymal cells into adipocytes. Dyes, such as Oil Red O, are cheap, easy to use and widely utilized by laboratories analyzing the adipogenic potential of mesenchymal cells. However, they are not specific to changes in gene transcription. We have developed a gene-specific differentiation assay to analyze when a mesenchymal cell has switched its fate to an adipogenic lineage. Immuno-labelling against fatty acid binding protein-4 (FABP4), a lineage-specific marker of adipogenic differentiation, enabled visualization and quantification of differentiated cells. The ability to quantify adipogenic differentiation potential of mesenchymal cells in a 96 well microplate format has promising implications for a number of applications. Hundreds of clinical trials involve the use of adult mesenchymal stromal cells and it is currently difficult to correlate therapeutic outcomes within and especially between such clinical trials. This simple high-throughput FABP4 assay provides a quantitative assay for assessing the differentiation potential of patient-derived cells and is a robust tool for comparing different isolation and expansion methods. This is particularly important given the increasing recognition of the heterogeneity of the cells being administered to patients in mesenchymal cell products. The assay also has potential utility in high throughput drug screening, particularly in obesity and pre-diabetes research.

Traditional methods of assessing adipogenic differentiation are cheap and easy to use, but are not specific to changes in gene expression. We have developed an assay to quantify mesenchymal cell differentiation into mature adipocytes using a lineage specific marker. This assay has diverse applications across basic research and clinical medicine.

可視化と系統特異的マーカーと間葉系細胞脂肪細胞の微分の潜在性の定量化

Several dyes are currently available for use in detecting differentiation of mesenchymal cells into adipocytes. Dyes, such as Oil Red O, are cheap, easy ...