この作品は、フォレスト·ロワーに授与国立衛生研究所（1 R01 GM095384-01）によってサポートされていました。私たちは、リボゼロ疫学キットへの早期アクセスを提供するためのエピセンター、イルミナ社に感謝します。我々は、超遠心分離管ホルダーの設計と生産のためのマークハタイに感謝。私たちは、撮影·プロセスを支援するための重要な測定値と原稿の議論のためにアンドレアス·ハースとベンジャミンノウルズに感謝し、そしてローレンポール。

The authors have nothing to disclose.

ウイルスメタゲノムウイルス粒子は、ポリエチレングリコール（PEG）沈殿または少量濃縮器を用いて濃縮される。いくつかのケースでは、濃度は必要とされないかもしれないが、予備濾過または低速遠心分離工程は、真核細胞および微生物細胞を除去するために使用される。ウイルス溶解物をさらに濃縮され、密度勾配超遠心分離9,41または小型フィルタ（ 例えば 、0.45μm）は、真核細胞および大菌体25を除去した。使用して精製され密度勾配超遠心分離は、典型的には、スクロースまたはウイルス粒子41を分離し、濃縮する塩化セシウムのような密集が、不活性の溶液を用いて行われる。物理的な分離は、サイズおよびウイルス粒子の浮遊密度に基づいている。したがって、フィルタの孔サイズの適切な選択及び勾配の厳密な製剤は、物理的な回復の成功と、特定のウイルスのコミュニティを単離することが不可欠であるVLPは、41（抽出密度内のフィルタや秋を通過しないすなわち 、ウイルス粒子メタゲノム中に検出されません）を分離し、コミュニティを決定します。ウイルスの単離および濃縮後、両方の自由な核酸、および微生物および真核細胞の形態で試料中に存在する非ウイルスゲノム物質が混入してもよい。したがって、試料中のウイルス粒子（ 図1Aおよび図1B）の純度を確認することが重要である。クロロホルム処理は、一般的に前に核酸抽出に自由に核酸を分解するためにヌクレアーゼ処理に続いて、残りの細胞を溶解するために使用される。 提示されたワークフローの警告は、CsCl勾配を入力するには余りにも浮力かもしれエンベロープウイルス粒子を除外することができるようにウイルス粒子を単離するための密度勾配分離を使用することであった。代わりの「キャッチオール」の方法は、密度勾配SEPARを省略することである0.45μmのからコミュニティDNAをATIONと隔離 - このアプローチはまた、綿棒または血漿からのものとして少量の試料を収容するのに適切であるクロロホルムおよびDNアーゼIで処理したろ液を。しかし、これはクロロホルム耐性細菌汚染およびDNase I耐性細胞外DNAのより高い量をもたらし得る。 高いDNA収量がシーケンシングオプションのより広い選択肢を提供することにより、現在のシークエンシングプロトコルは1 ngのシーケンシングライブラリの準備のための核酸のμgの1する必要があります。生成viromesのDNA濃度は、多くの場合、より多くは200ng /μlに検出限界以下の範囲である。回収されたウイルス核酸の量は、直接配列決定ライブラリーを調製するため不十分である。このような場合には、核酸増幅が不可欠である。リンカ増幅ショットガンライブラリ（LASLs）複数置換増幅（MDA）に基づき、2,42,43及び全ゲノム増幅は2である方法は、最も一般的に配列決定のための十分なDNAを生成するために使用される。このようなファージPhi29 DNAポリメラーゼに基づくもののようなMDA法は、増幅偏り苦しむことが知られており、優先的に非定量的分類学および機能的特徴44,45、結果として一本鎖DNAと環状DNAを増幅することができる。 LASLsアプローチの最適化バージョンは、最小限のバイアスを導入することが示された（出発物質の少量のための）より高い感受性を促進し、容易に異なる配列決定プラットフォーム43のために適合されている。しかし、このアプローチは、多くのステップを有するDNAの損失を最小限にするために特殊な装置を必要とし、二本鎖DNAテンプレートに制限されている。私たちの研究室では、このアプローチは成功し、気管支lavage-、coral-と海水由来のVLP（未発表とフルビッツら 46）から抽出したDNAの検出可能と検出できない量を増幅するようになってきた。 データ解析パイプラインの開発は、CLAを持ってssicallyウイルスのコミュニティの非常に多様かつ大部分は未知の性質に起因ウイルスのメタゲノム解析の最も困難な側面の一つとなって。日付現在のウイルスデータベースへの生物圏における推定10 8ウイルスの遺伝子型が、ありますが、このおおよその合計ウイルスの多様性の約1 / 100,000です〜4000ウイルスのゲノムを、含まれています。そのため、ウイルスのメタゲノムで分類学と機能の割り当てのために（例えばBLAST 47など）の類似性ベースの検索は、固有の課題を有している。多くの配列がデータベース中のゲノムへの著しい類似性を有することができないので、未知のものとして分類される。相同性ベースの検索は、データをシーケンスする分類関数を割り当てるための最も重要なアプリケーションであっても、データベースに依存しない分析に基づく代替的なアプローチは、48 50を開発されてきた。 Fancello ら 51はビラで使用された計算ツールとアルゴリズムの完全なレビューを提供Lのメタゲノミクス。 微生物メタゲノム一般的に、低張溶解処理した微生物群集（HL-DNA）から抽出したDNAの総量は、20 ngのから5μgの範囲。収率は、患者の健康状態およびこの研究（ 表2）で抽出したHL-DNAの全収率で見られる変動を説明収集痰試料の量に大きく依存している。配列データは、シーケンシングライブラリーの品質に依存して、良好な品質を生成するための重要なステップは、生成された。 図2の酵素ベースのDNA断片化手順を使用して、CF痰由来の微生物のDNAから生成されたシークエンシングライブラリーの典型的なサイズ範囲を示す。最適なライブラリーサイズは、配列決定プラットフォームおよびアプリケーションの選択に依存し、必要に応じて、したがって、断片化の手順は、超音波処理し、噴霧などの代替的なアプローチを介して、最適化することができる。に加えて提示代表的な結果は、複数の時点にわたる複数の患者から採取したCF痰に提示される方法の成功はまた、（2012）9。Limらの文献に示されており、リムら。（2014）10。 これまでの研究9,10は、すべての患者は変動が原因で、抗生物質処理のような摂動する可能性がありながら、それによってコミュニティ内の主要なプレーヤーの持続性を反映して、時間をかけてシフトする微生物群集のユニークなセットを保有することを示唆している。これらの変動はあっても、外部摂動またはサンプリング手順とサンプル処理に起因することなく、日々発生するかどうか、疑問のままです。 HL-DNAのメタゲノムおよび16S rDNAのアンプリコンの分析に基づいて、7日間の長手方向のサンプリングは、抗生物質摂動なしこと微生物プロファイルの日内変動を示している（1日目、2、および3）（ 図3Aおよび3B）最小であった。イントロの際経口抗生物質の生産抗生物質シプロフロキサシンは、Pとして既知の細菌性病原体の広いスペクトルをターゲットにしている間すぐに3日目サンプリング後、コミュニティプロファイルの変化は4日目に明らかになった緑膿菌 、 黄色ブドウ球菌 、及び連鎖球菌性肺炎 、治療はPの相対的存在量を増加させ緑膿菌は、ストレプトコッカス種を減少させながら。とP. melaninogenicaの 。 6日目までに、コミュニティはゆっくりと最初の出発コミュニティ構造に回復した。結果は、単一の患者内の微生物のプロファイルの変動による気道におけるコミュニティ摂動に可能性が高いことを示唆している。 HL-由来のDNAからの16S rDNAのライブラリとメタゲノムの微生物のプロファイル間の一貫性を考えると、我々は本研究で用いた16S rRNAのプライマーから生じるバイアスを否定した。 16S rDNAの分類学上の全体に見られる差異の一つの可能​​な説明総DNAおよびHL由来DNA（ 図3B）から生成されたアルプロファイルは、 シュードモナス属の高い量の存在下であってもよい。抗生物質治療後に外DNA。これは、3日間のシュードモナス属を対象とし、抗生物質処理、後に、これらの差は7日目で最も明らかであったという知見によってサポートされています。他人に加えて。シプロフロキサシンは、一般的にCFおよび慢性P.を有する患者における第一選択薬として使用され緑膿菌感染活動のそのスペクトルは、ほとんどのCF-関連した病原体が含まれていても。私たちは、抗生物質治療がストレプトコッカス種などの影響を受けやすい地域社会を根絶するという仮説を立てた。従って、耐性のPで満たされたニッチを作成する緑膿菌 。 緑膿菌はバイオフィルムのコミュニティを増加を通して抵抗を得てもよいし、細胞外DNAは、バイオフィルムのアーキテクチャ52の主要な構造的支持であることが示されている。でもTとして彼はコミュニティ構造は、細胞外DNAは、CF痰に残っている可能性があり、回復した。したがって、これらのデータは、低張溶解し、潜在的にのみヒト由来のDNAを除去しないで利益をこのワークフローに提示洗浄工程だけでなく、微生物由来の細胞外DNAが実際の微生物のプロファイルを偽ることができることを示唆している。 Metatranscriptomics 高品質metatranscriptomeは、比較的少数のリボソームRNA（rRNAの）配列を含有し、地域社会の転写産物（mRNA）の公平なサンプリングを表している必要があります。によるmRNAの半減期が短いと、限られた量に、そのプロトコルは、ここに提示され、回収された転写物の数を最大にするために、サンプルの取り扱いを最小限に抑えることが重要である。 近年では、rRNAを枯渇のためのいくつかのアプローチが開発され、市販のキットに適合される。これらには、がMicroB エンリッチ 、リボゼロ、およびサンプル固有のサブトHが含まれるybridizations 53オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、および5 &#39;一リン酸を含むRNAを標的とするエキソヌクレアーゼ酵素活性に基づいていたmRNA-ONLYキットに基づいている。また、このような優先的に線形RNAをpolyadenylatesと増幅のMessageAmp II-細菌キットとしてのmRNAの濃縮度のためのいくつかのアプローチも利用できます。これらの方法（ 例えば、mRNA-ONLY、がMicroB のE XPRESSとのMessageAmp）の中には、最適な効率のために同時に使用されている。しかしながら、これらのアプローチのすべての有効性は、部分的に分解のrRNAの作業としてしばしばCF試料から抽出した全RNAで観察された場合は特に、制限される。ポリアデニル化依存性RNA増幅は、真核生物および原核生物の両方のmRNAからなるmetatranscriptomesを生成するために使用することができない。加えて、ポリ（A）テールは、有用な配列データの量が減少するかもしれない配列に付加。ホモポリマーストレッチを有する領域は、より低い品質スコアを有することがcとなる傾向があるかなりの数のausingするシングおよびポストシーケンスソフトウェアによってフィルタリングされる読み出し、ポリ（A）尾部を切断、トリミング後の平均有用読み取り長を大幅に54減少する。 複雑なCFの微生物のコミュニティや、部分的に分解したRNA（ 図4Aおよび4C）への対応、これまでの研究では、リボゼロゴールドキットによるハイブリダイゼーション捕獲法を使用して組み合わせる治療法と比較して、ヒトと微生物rRNAの両方を除去するのに効果的であったことを示した他のキ ​​ット9（ 表3）。結果として得られるデータは、ヒト宿主と微生物の転写産物の両方の同時分析を可能にする。収量と品質のRNA、ならびに配列決定プラットフォームの究極の選択に応じて、cDNA合成工程を含む、これらのプロセスの多くは、シーケンシングライブラリーの生成を合理化することができる。例えば、リボゼロ処理したRNAはmetatranscriptomeシング天秤座を作製するために使用することができるScriptSeq RNA-のSeqライブラリ調製キットを使用してリース。 動物関連コミュニティのメタゲノム解析は、ホストとその関連コミュニティを含んで全体の機能エンティティの総合的な表現を提供。ここに提示されたワークフローは、特に、所望のウイルスおよび微生物に加えて多量の粘液、細胞残屑、細胞外DNA、タンパク質および糖タンパク質複合体の高い量、ならびに宿主細胞を含有するもの、複雑な動物に関連する様々な試料に適応可能である粒子。ウイルスおよび微生物粒子はすべての段階で失われる可能性があるにもかかわらず、単離および精製は、宿主DNAの量を最小にすることが不可欠である粒子。メタゲノミクスデータを調べコミュニティの代謝電位を提供するが、符号化された機能9の発現差異を明らかにすることによって、これを補完するmetatranscriptomics。ゲノミクスおよび転写産物データの総合的な評価は、新しいインをもたらしたコミュニティの相互作用のダイナミクスにightsと改善治療法9,10,55の開発を容易にします。

<html>人体に関連付けられたウイルスおよび微生物群集の配列決定技術1,2の適用により、過去10年間で広く研究されている。成果は、ヒトの健康および疾患における重要性微生物の認識につながっている。主要なイニシアチブは、ヒトの皮膚に存在する細菌（および一部の古細菌）について説明し、人間microbiomeプロジェクトから来て、口腔内、気道、尿生殖路、および消化管3。気管支肺胞洗浄（BAL）4,5及び鼻咽頭スワブ4を通して、健康なヒトの気道のさらなるmicrobiome研究は、肺環境サンプリング装置、気道における一過性微生物のコロニー形成の結果としての役割を果たすことができることを示している。しかし、障害者気道表面における微生物の植民地化の影響は、嚢胞性線維症（CF）患者で見られるもののような重篤な慢性肺感染症につながることができます。 tは&quot;&gt; CFは、嚢胞性線維症膜貫通レギュレーター（CFTR）の突然変異遺伝子6によって引き起こされる致死性遺伝病である。これらの変異は、今度は、上皮の頂端面を横切って経上皮イオン輸送に影響を与える欠陥CFTRタンパク質を生じる。疾患に影響複数の器官系が、死亡率と罹患率の大半は、CF肺疾患7に起因するものである。CF肺は微生物のコロニー化のためのユニークな生態系を提供します。イオン輸送に欠陥が好気性からなる微小環境を作成し、CF気道に蓄積する粘液を引き起こし静的な栄養豊富な粘膜表面によって固定、微好気性、嫌気コンパートメント。この環境は、ウイルス、細菌、および真菌を含む微生物のコロニー形成および増殖を促進します。急性および慢性の肺の微生物感染症は、その結果、一定だが効果のない免疫応答を引き起こす大規模な気道リモデリング、肺容量の喪失、そして最終的にパルモNARY失敗。 CF肺に関連した細菌群集はよく16SリボソームRNA（rRNAの）遺伝子配列決定8と散弾銃のメタゲノミクス9,10を使用することを含む、両方の文化に依存すると文化に依存しないアプローチを使用して、記載されている。 16S rRNAのベースのアプローチは、微生物種の広い範囲を特徴付ける、コミュニティの多様性において幅広いシフトを捕捉することができる。しかし、それは（2010年11。クラーソンらにまとめた）コミュニティを定義する際に、その解像度に制限され、代謝ポテンシャルの予測は特定され分類群のために知られているものの一般的な機能に限定されている。従って、16S rRNAの遺伝子配列決定法は、CF肺に存在する多様な微生物群集の必要な分類学的および機能的な分析精度は不十分である。ここで説明するメタゲノムアプローチは、その限界を克服する、16S rRNAのベースのアプローチを補完するものであり、比較的効果的な方法を可能にするCF肺に微生物群集の分類学と遺伝的内容の両方を分析する。 動物関連試料から単離された微生物DNAは、しばしば、宿主DNAを大量に含んでいる。 14 - CF痰または肺組織試料は、通常、免疫応答において好中球によって放出されたヒトDNAの大量の総DNA 12のしばしば99％以上を含む。いくつかの無傷のヒト細胞が存在することができるが、このDNAの大部分が溶液中で遊離または微生物の表面に吸着される。また、非常に粘性の粘液栓、細胞破片、および他の未知の汚染物の存在は、さらに、微生物細胞の単離を複雑にする。いくつかの方法が選択的にヒトDNA 16、及びMolYsisキット、限られた成功すべてを分解するために、微生物細胞15からDNアーゼI、臭化エチジウムアジドでの処理を、ヒトを分離するパーコール勾配を含む、ヒトDNAのこれらの試料を枯渇するために試験した。<html> CF痰のために最も効果的な微生物のDNA精製を、今日までは、Breitenstein らによって記載された方法の改変。（1995）17となっている。ここに低張溶解（HL）メソッドと呼ばれるこのアプローチは、ムチンのジスルフィド結合、真核細胞の低張溶解、及び可溶性DNA 9のDNアーゼI処理を減らすためにβメルカプトエタノールの組み合わせを使用します。選択肢の欠如にもかかわらず、HL方法が原因群集組成9,10の観察された変動するかどうか、不要な微生物の溶解および（II）の結果は、（i）可能なバイアスのためにいくつかの懸念を表明したサンプル処理に関連したバリエーションの成果物です。散弾銃のメタゲノムの生成に加えて、我々は、総DNAと連続7日間にわたって単一の患者から採取した痰試料の同じセットを使用して、HL法から抽出された微生物のDNAの16S rRNA遺伝子プロファイルを比較することにより、これらの問題に対処する。 ENT &quot;&gt;微生物群集と比較すると、動物に関連したウイルスのコミュニティの特徴付けは18,19限られているCF気道におけるウイルスのコミュニティが最小限しか20特徴づけられている- 。。22に CF気道におけるウイルスのコミュニティのDNAを特徴づける第一メタゲノム研究CF肺に関連したほとんどのウイルスはファージは20であることを示した。CFと非CFの個人におけるファージの代謝可能性が大幅に異なっていた。具体的には、CFの個人におけるファージコミュニティがCF気道の生理機能に細菌宿主適応の反射遺伝子を実施し、およびCF肺組織におけるウイルスの細菌毒性20。その後のメタゲノム研究は、解剖学的領域22の間のウイルスのコミュニティの別個の空間的不均一性を示した。また、CF肺組織は、任意のエコシステム22に現在まで観察最低ウイルスの多様性を保有。同定ほとんどのウイルスは、ファージたCFの病原体に感染する可能性を秘めた。しかし、このようなヘルペスウイルス、アデノウイルス、およびヒトパピローマウイルス（HPV）などの真核生物ウイルスも検出された。肺組織における嚢胞切開中に観察された一つのイベントでは、ヒトパピローマウイルスゲノムの99％以上が、患者が肺の乳頭又は癌と診断されなかったにもかかわらず、回収された。これは、本ウイルスの多様性は、組織損傷の重症度を反映するだけでなく、露出させ、下にある未同定の疾患を説明することができるだけでなく、ことを示している。ここで説明するプロトコルは、多量の粘液、宿主および微生物細胞遊離DNA、ならびに細胞破片の大量から成る試料からのウイルス様粒子（VLP）を単離するためのシンプルかつ強力な方法を提供する。 メタゲノミクス補完、metatranscriptomicsは微生物群集とホスト9,23間での遺伝子発現のダイナミクスを監視するために使用される。この場合、両方の微生物及びHOSトンmRNAを優先的に選択する必要がある。細菌のmRNAがポリアデニル化されていないため、オリゴdTベースのmRNAプルダウン方法が悪用されることはありません。サンプルは真核生物のmRNAを大量に含有することが知られている場合にはポリアデニル化依存性RNA増幅は、ホストに関連したサンプルでは使用できません。 CF痰を含む多くの動物に関連したサンプルは、RNアーゼを含む細胞破片とヌクレアーゼの高い量に加えて高密度の細胞を含む。したがって、別の困難な課題はmetatranscriptome処理中に広範なRNAの分解を防止するためである。ほとんどの場合、CF喀痰から抽出した全RNAは、派生RNAの下流の適用および有用性を制限する、部分的に分解される。近年では、rRNAを枯渇のためのいくつかのアプローチが開発され、市販のキットに適合される。これらのアプローチの有効性は、しかし、特に部分的に分解されたrRNAを9,24を操作するときに、制限されている。ここで用いられている方法を許可効率的な下流の合計のrRNA除去に適し部分的に分解全RNAの検索のためにED。二つの異なるキットを比較し、部分的に分解された全RNAからのrRNAの除去効率の直接比較は、リムらによって示された。（2012）9。 全体として、この論文の目的は、一例として、誘発痰サンプルを用いて、単一の動物に関連したサンプルから、ウイルス及び微生物ガンメタゲノムを生成するためのプロトコルの完全なセット（ 図1）、及びmetatranscriptomeを提供することにある。分子検査室ワークフローは交差汚染を最小限にするために別個の前後の増幅領域を含むべきである。方法は、そのような組織22、鼻咽頭および口腔咽頭ぬぐい液25、気管支肺胞洗浄（BAL）とサンゴ（未発表データ）のような他のサンプルタイプに簡単に適応可能である。各サンプルを収集するとすぐに処理された場合は特に微生物のメタゲノムと満たされるべきであるatranscriptomics研究が望まれている。試料が凍結した場合、それは潜在的に細胞の完全性を破壊するように凍結微生物メタゲノム無傷の微生物細胞の単離を制限する。しかし、凍結はmetatranscriptomics及びウイルス分離が、凍結融解プロセスによって影響を受ける可能性が回復したウイルス粒子のRNAの品質および量を排除するものではない。それは、その誘発喀痰はBALがあまりにも侵襲され得るように、成人CF患者および他の慢性肺疾患26,27に関連した多くの研究におけるサンプルの主要な供給源を務めているに注意することが重要である。我々の研究では、痰試料を最小限に唾液サンプル内の口腔微生物汚染を保つために、滅菌生理食塩水を用いて口腔のうがい薬及びすすぎ以下、 すなわち 、慎重かつ一貫したサンプリング方法で収集した。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="741">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:119px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Guanidine isothiocyanate-based RNA lysis buffer</td>
			<td style="width:119px;">Life Technologies</td>
			<td>10296-028</td>
			<td>TRIzol LS Reagent was used in this study</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silica beads; 0.1 to 0.15 mm</td>
			<td style="width:119px;">Cole-Parmer</td>
			<td>YO-36270-62</td>
			<td>Zirconia-Silicate Beads were used in this study</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol Molecular Grade (Dry Powder)</td>
			<td style="width:119px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">V3155</td>
			<td>Can be purchased from any other company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile syringe filter; 0.45 &#181;m pore size hydrophilic PVDF membrane</td>
			<td style="width:119px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLHV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I enzyme&#160;</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td align="right">260913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Sterile syringe filter; 0.02 &#181;m pore size</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">09-926-13</td>
			<td>Diameter: 25mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Ultra-Clear Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:119px;">Beckman</td>
			<td align="right">344059</td>
			<td>9/16 X 3 &#189; in. (14X90mm), suitable for SW41 Ti Rotor and VLPs density gradient ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW41 Ti Rotor</td>
			<td style="width:119px;">Beckman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">333790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">SS-34 Fixed Angle Rotor</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Phi29 DNA polymerase</td>
			<td>Monserate Biotech</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4001</td>
			<td>10 U/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Phi29 Random Hexamer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S0181</td>
			<td>Previously bought from Fidelity Systems</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alumina matrix filter with annular polypropylene support ring; 0.02 &#181;m pore size</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">09-926-34</td>
			<td>Whatman Anodisc Filter Membranes were used in this study; Diameter 25mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td style="width:119px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">S-11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase-free DNase I&#160;</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0303S</td>
			<td>Can be purchased from any other company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Glycogen, RNA grade</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">FERR0551</td>
			<td>Can be purchased from any other company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Oak Ridge high-speed centrifuge tubes</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">05-562-16B</td>
			<td>For large volume DNA extraction procedure, suitable for SS-34 fixed-angle rotor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Total rRNA removal kit</td>
			<td style="width:119px;">Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">MRZE724</td>
			<td>ScriptSeq Complete Gold Kit (Epidemiology) can be used to couple rRNA removal with sequencing library preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Cesium chloride&#160;</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1595-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Hexadecytrimethyl-ammonium bromide (CTAB)</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H5882-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purifying the impure: sequencing metagenomes and metatranscriptomes from complex animal-associated samples

ハイスループットシークエンシングのアクセス可能性は、生物学の多くの分野に革命をもたらしました。良いホスト随伴ウイルスおよび微生物群集を理解するために、DNAおよびRNA抽出のための総合的なワークフローが開発された。ワークフローは同時に次世代配列決定のための単一のサンプルからのウイルスおよび微生物メタゲノム、ならびにmetatranscriptomesを生成する。これらのアプローチのカップリングは、分類学的特性や地域社会符号化された機能の両方の概要を説明します。それは非常に粘性があるとムチンの高い量、無料の好中球のDNA、および他の未知の汚染物質が含まれているため、提示された方法は、嚢胞性線維症（CF）痰、問題のサンプルタイプを使用しています。ここに記載されているプロトコルは、これらの問題を対象とし、正常に最小限の人間のDNAの混入でウイルスおよび微生物のDNAを回収。メタゲノミクス研究を補完するために、metatranscriptomicsプロトコルは、両方の微生物を回収するために最適化された比較的少数のリボソームRNA（rRNAの）配列を含み、宿主のmRNA。データ特性の概要は、メソッドの成功を評価するための基準として機能するために提示されている。追加のCF痰サンプルはまた（i）の単一の患者内で連続7日間を横切るmicrobiomeプロファイルの一貫性を評価し、及び（ii）の16SリボソームRNA遺伝子に基づいた配列決定メタゲノムアプローチの一貫性を比較するに収集した。結果は、抗生物質の摂動のない微生物のプロファイルの日内変動が最小であったと共通のCF-関連した細菌の分類学プロフィールは低張溶解（HL）由来DNAから生成された16S rDNAのライブラリとメタゲノムの間で非常に類似していたことを示した。しかし、総DNAおよびHL-由来のDNAから生成された16S rDNA遺伝子分類学的プロファイル間の差異は、低張溶解し、洗浄工程でのみヒト由来のDNAを除去しないで利益を得ることを示唆しているだけでなく、微生物由来extracellul実際の微生物のプロフィールを偽って、AR DNA。

Watch this Scientific Journal Video about Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples at JoVE.com

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

例として、嚢胞性線維症の気道を使用すると、原稿は、動物関連のサンプル中の微生物およびウイルスのコミュニティを特徴づけるためにメタゲノムとmetatranscriptomicアプローチの組み合わせを含む総合的なワークフローを提供します。

複雑な動物に関連したサンプルからのシーケンシングメタゲノムとMetatranscriptomes：不純を精製する

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

purifying-impure-sequencing-metagenomes-metatranscriptomes-from

Research

JoVE Journal

Biology

37.1K ビュー.  San Diego State University. 例として、嚢胞性線維症の気道を使用すると、原稿は、動物関連のサンプル中の微生物およびウイルスのコミュニティを特徴づけるためにメタゲノムとmetatranscriptomicアプローチの組み合わせを含む総合的なワークフローを提供します。 

ビデオ: Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit

Plasmid DNA purification from E. coli is a core technique for molecular cloning. Small scale purification (miniprep) from less than 5 ml of bacterial culture is a quick way for clone verification or DNA isolation, followed by further enzymatic reactions (polymerase chain reaction and restriction enzyme digestion). Here, we video-recorded the general procedures of miniprep through the QIAGEN's QIAprep 8 Miniprep Kit, aiming to introducing this highly efficient technique to the general beginners for molecular biology techniques. The whole procedure is based on alkaline lysis of E. coli cells followed by adsorption of DNA onto silica in the presence of high salt. It consists of three steps: 1) preparation and clearing of a bacterial lysate, 2) adsorption of DNA onto the QIAprep membrane, 3) washing and elution of plasmid DNA. All steps are performed without the use of phenol, chloroform, CsCl, ethidium bromide, and without alcohol precipitation. It usually takes less than 2 hours to finish the entire procedure.

キアゲンミニプレップキットを用いて細菌のコロニーからプラスミドDNAを精製

Plasmid DNA purification from E. coli is a core technique for molecular cloning. Small scale purification (miniprep) from less than 5 ml of bacterial ...

生物学

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of the stomach is defined by the mouth opening and the posterior end by the bottom of the pylorus. Along the dorsal side of the stomach lies the stomatogastric nervous system (STNS). This nervous system, which contains rhythmic networks that underlie feeding behavior, is an established model system for studying rhythm generating networks and neuromodulation 1,2. While it is possible to study this system in vivo 3, the STNS continues to produce its rhythmic activity when isolated in vitro. In order to study this system in vitro the stomach must be removed from the animal. This video article describes how the stomach can be dissected from the American lobster. In an accompanying video article4 we demonstrate how the STNS can be isolated from the stomach.

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

We describe the gross dissection of the stomach of the American lobster (Homarus americanus).

ロブスターの胃の肉眼解剖、ロブスター属Americanus</em

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of ...

A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the internal status of the cell. Glycans on tumor cells tend to have abundant sialic acid and fucose moieties. We propose that these cancer-associated glycan variants be exploited for biomarker development aimed at diagnosing early-stage disease. Accordingly, we developed a mass spectrometry-based workflow that incorporates chromatography on affinity matrices formed from lectins, proteins that bind specific glycan structures. The lectins Sambucus nigra (SNA) and Aleuria aurantia (AAL), which bind sialic acid and fucose, respectively, were covalently coupled to POROS beads (Applied Biosystems) and packed into PEEK columns for high pressure liquid chromatography (HPLC). Briefly, plasma was depleted of the fourteen most abundant proteins using a multiple affinity removal system (MARS-14; Agilent). Depleted plasma was trypsin-digested and separated into flow-through and bound fractions by SNA or AAL HPLC. The fractions were treated with PNGaseF to remove N-linked glycans, and analyzed by LC-MS/MS on a QStar Elite. Data were analyzed using Mascot software. The experimental design included positive controls&mdash;fucosylated and sialylated human lactoferrin glycopeptides&mdash;and negative controls&mdash;high mannose glycopeptides from Saccharomyces cerevisiae&mdash;that were used to monitor the specificity of lectin capture. Key features of this workflow include the reproducibility derived from the HPLC format, the positive identification of the captured and PNGaseF-treated glycopeptides from their deamidated Asn-Xxx-Ser/Thr motifs, and quality assessment using glycoprotein standards. Protocol optimization also included determining the appropriate ratio of starting material to column capacity, identifying the most efficient capture and elution buffers, and monitoring the PNGaseF-treatment to ensure full deglycosylation. Future directions include using this workflow to perform mass spectrometry-based discovery experiments on plasma from breast cancer patients and control individuals.

Lectin-conjugated POROS beads were employed for HPLC. Glycopeptide standards served as positive and negative controls. MARS-14 depleted, trypsin-digested human plasma was chromatographed and flow-through (FT) and bound fractions collected for ESI-LC-MS/MS analyses. Glycopeptides were enriched in the bound fraction as compared to FT.

複雑な生体試料から選択的グリコシル化ペプチドを豊かにするためにレクチンHPLC法

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &amp;#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

組織サンプルのγH2AX病巣の定量

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that allows for the glycosylation profiling of specific proteins. Glycosylation of proteins is the most prevalent post-translational modification found on proteins, and leads diversified modifications of the physical, chemical, and biological properties of proteins. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases. However, current methods to study protein glycosylation typically are too complicated or expensive for use in most normal laboratory or clinical settings and a more practical method to study protein glycosylation is needed. The new protocol described in this study makes use of a chemically blocked antibody microarray with glycan-binding protein (GBP) detection and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements needed to study protein glycosylation. In this method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies are printed directly onto the microarray slides and the N-glycans on the antibodies are blocked. The blocked, immobilized glycoprotein-specific antibodies are able to capture and isolate glycoproteins from a complex sample that is applied directly onto the microarray slides. Glycan detection then can be performed by the application of biotinylated lectins and other GBPs to the microarray slide, while binding levels can be determined using Dylight 549-Streptavidin. Through the use of an antibody panel and probing with multiple biotinylated lectins, this method allows for an effective glycosylation profile of the different proteins found in a given human or animal sample to be developed.
Introduction
Glycosylation of protein, which is the most ubiquitous post-translational modification on proteins, modifies the physical, chemical, and biological properties of a protein, and plays a fundamental role in various biological processes1-6. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases 7-12. In fact, most current cancer biomarkers, such as the L3 fraction of &alpha;-1 fetoprotein (AFP) for hepatocellular carcinoma 13-15, and CA199 for pancreatic cancer 16, 17 are all aberrant glycan moieties on glycoproteins. However, methods to study protein glycosylation have been complicated, and not suitable for routine laboratory and clinical settings. Chen et al. has recently invented a chemically blocked antibody microarray with a glycan-binding protein (GBP) detection method for high-throughput and multiplexed profile glycosylation of native glycoproteins in a complex sample 18. In this affinity based microarray method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies capture and isolate glycoproteins from the complex mixture directly on the microarray slide, and the glycans on each individual captured protein are measured by GBPs. Because all normal antibodies contain N-glycans which could be recognized by most GBPs, the critical step of this method is to chemically block the glycans on the antibodies from binding to GBP. In the procedure, the cis-diol groups of the glycans on the antibodies were first oxidized to aldehyde groups by using NaIO4 in sodium acetate buffer avoiding light. The aldehyde groups were then conjugated to the hydrazide group of a cross-linker, 4-(4-N-MaleimidoPhenyl)butyric acid Hydrazide HCl (MPBH), followed by the conjugation of a dipeptide, Cys-Gly, to the maleimide group of the MPBH. Thus, the cis-diol groups on glycans of antibodies were converted into bulky none hydroxyl groups, which hindered the lectins and other GBPs bindings to the capture antibodies. This blocking procedure makes the GBPs and lectins bind only to the glycans of captured proteins. After this chemically blocking, serum samples were incubated with the antibody microarray, followed by the glycans detection by using different biotinylated lectins and GBPs, and visualized with Cy3-streptavidin. The parallel use of an antibody panel and multiple lectin probing provides discrete glycosylation profiles of multiple proteins in a given sample 18-20. This method has been used successfully in multiple different labs 1, 7, 13, 19-31. However, stability of MPBH and Cys-Gly, complicated and extended procedure in this method affect the reproducibility, effectiveness and efficiency of the method. In this new protocol, we replaced both MPBH and Cys-Gly with one much more stable reagent glutamic acid hydrazide (Glu-hydrazide), which significantly improved the reproducibility of the method, simplified and shorten the whole procedure so that the it can be completed within one working day. In this new protocol, we describe the detailed procedure of the protocol which can be readily adopted by normal labs for routine protein glycosylation study and techniques which are necessary to obtain reproducible and repeatable results.

In this study, we describe an improved protocol for a multiplexed high-throughput antibody microarray with lectin detection method that can be used in glycosylation profiling of specific proteins. This protocol features new reliable reagents and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements as compared to the previous procedure.

複雑なサンプル中の特定のタンパク質のグリコシル化の多重化ハイスループットプロファイリングのための化学的にブロックされた抗体マイクロアレイ

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

EMBLでMultiBacタンパク質複合体生産プラットフォーム

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

遺伝子発現およびゲノム変化を特徴づけるために、RNAシーケンシングアッセイをターゲットに

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many different proteins associate with curved membranes because of their ability to sense or induce membrane curvature. Typically, these processes involve a multitude of proteins making them too complex to study quantitatively in the cell. We describe a protocol to reconstitute a curved membrane in vitro, mimicking a curved cellular structure, such as the endocytic neck. A giant unilamellar vesicle (GUV) is used as a model of a cell membrane, whose internal pressure and surface tension are controlled with micropipette aspiration. Applying a point pulling force on the GUV using optical tweezers creates a nanotube of high curvature connected to a flat membrane. This method has traditionally been used to measure the fundamental mechanical properties of lipid membranes, such as bending rigidity. In recent years, it has been expanded to study how proteins interact with membrane curvature and the way they affect the shape and the mechanics of membranes. A system combining micromanipulation, microinjection, optical tweezers, and confocal microscopy allows measurement of membrane curvature, membrane tension, and the surface density of proteins, concurrently. From these measurements, many important mechanical and morphological properties of the protein-membrane system can be inferred. In addition, we lay out a protocol of creating GUVs in the presence of physiological salt concentration, and a method of quantifying the surface density of proteins on the membrane from fluorescence intensities of labeled proteins and lipids.

Many proteins in the cell sense and induce membrane curvature. We describe a method to pull membrane nanotubes from lipid vesicles to study the interaction of proteins or any curvature-active molecule with curved membranes in vitro.

巨大リポソームの膜カーボンナノ チューブを引っ張ってください。

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, microbiome modification is designed to concentrate genomic DNA of a target foodborne pathogen contaminant to facilitate the detection and subtyping of the pathogen in a single workflow. Here, we explain and demonstrate the sample preparation steps for the quasi-metagenomics analysis of Salmonella enterica from representative food and environmental samples including alfalfa sprouts, ground black pepper, ground beef, chicken breast and environmental swabs. Samples are first subjected to the culture enrichment of Salmonella for a shortened and adjustable duration (4&#8211;24 h). Salmonella cells are then selectively captured from the enrichment culture by immunomagnetic separation (IMS). Finally, multiple displacement amplification (MDA) is performed to amplify DNA from IMS-captured cells. The DNA output of this protocol can be sequenced by high throughput sequencing platforms. An optional quantitative PCR analysis can be performed to replace sequencing for Salmonella detection or assess the concentration of Salmonella DNA before sequencing.

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Here, we present a protocol to prepare DNA samples from food and environmental microbiomes for concerted detection and subtyping of Salmonella through quasimetagenomic sequencing. The combined use of culture enrichment, immunomagnetic separation (IMS), and multiple displacement amplification (MDA) allows effective concentration of Salmonella genomic DNA from food and environmental samples.&#160;

食品および環境試料からのサルモネラの準メタゲノム解析

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are executed by multiple cell types arranged in a complex architecture across the corticomedullary axis of the organ. Recent advances in single-cell transcriptomics have accelerated the understanding of cell type-specific gene expression in renal physiology and disease. However, enzyme-based tissue dissociation protocols, which are frequently utilized for single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq), require mostly fresh (non-archived) tissue, introduce transcriptional stress responses, and favor the selection of abundant cell types of the kidney cortex resulting in an underrepresentation of cells of the medulla.
Here, we present a protocol that avoids these problems. The protocol is based on nuclei isolation at 4 &#176;C from frozen kidney tissue. Nuclei are isolated from a central piece of the mouse kidney comprised of the cortex, outer medulla, and inner medulla. This reduces the overrepresentation of cortical cells typical for whole-kidney samples for the benefit of medullary cells such that data will represent the entire corticomedullary axis at sufficient abundance. The protocol is simple, rapid, and adaptable and provides a step towards the standardization of single-nuclei transcriptomics in kidney research.

Here, we present a protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mouse kidneys that improve the representation of medullary kidney cell types and avoids the gene expression artifacts from enzymatic tissue dissociation.