我々は1 - Dゲルの調製および染色のために博士ニコラWiethölterに感謝。 この作品は、ドイツ学術振興（NDとSMへのGRK 1089/project 5）からの助成金によって資金を供給され、NDに財団ユルゲンManchotから研究フェローシップによってサポートされていました。

パート1：カップローディングを使用して二次元（2 - D）ゲル電気泳動<ol><li> IPGストリップの水和と等電点電気泳動（IEF） <ul><li> 125μlの補液でイモビのDryStripゲル、pHが6-11（7 cm）の水和する[7 M尿素、2 Mチオ尿素、4％CHAPS、50 mMリンhydroxyethyldisulfideと2％IPGの緩衝液pH 6月11日]のためにイモビDryStrip Reswellingトレイを使用して少なくとも10時間。 </li><li> [7 M尿素、2 Mチオ尿素、2％CHAPS、2％ASB - 14、50mMリンhydroxyethyldisulfideと2％IPGの緩衝液pH 6月11日]を100μl当たり60から100μgのタンパク質に対応するIEFサンプル緩衝液中で沈殿したタンパク質試料を溶かす。 </li><li>可溶化（室温で少なくとも30分間）した後、サンプルカップを使用してカップローディング陽極を介してタンパク質のサンプルを適用する。カップの容量は100μlである（マニホールドのコップは150μLまでできます）。 注：あなたが焦点を当てプロトコルと詰め替えの先頭にカップを低電圧ステップを挿入するとカップの液膜が残っている間に、より大きなサンプルの量を読み込むことができます！ </li><li> Multiphor II電気泳動ユニットの勾配モードで11.1 KVHのために等電点電気泳動法を実行します。 </li></ul></li><li>平衡とSDS - PAGE <ul><li> IEF後、IPGストリップを平衡化溶液中でそれぞれ1％ジチオスレイトール、2.5％のヨードアセトアミドを使用して、シェーカーにするたびに、減少してアルキル化するために15分を行った[50 mMのTris-HCl/pH 8.8、6 M尿素、30％グリセロールと2％SDS]。 </li><li> H 2 Oで平衡化したストリップをリンスし、余分な平衡化バッファーを削除するにはワットマンのペーパーにそれらを覆い隠す。その後、SDSランニングバッファー（1X）のストリップを浸し。 </li><li>二次元目は12％の総アクリルアミド濃度の垂直電気泳動システムでSDS - PAGEによって実行されます。平衡化したIPGストリップは、[ブロモフェノールブルーを含むバッファ動作し、0.5％アガロース]を分離ゲルの上に置かれ、熱いアガロース溶液で固定した。 </li><li>タンパク質は、色素フロントがゲルカセットの底に達するまで、120 Vに続いて15分間80 Vから始まる、2.5時間のために分離した。 </li></ul></li></ol>パート2：CBB G - 250コロイドCoomassie染色 1。染色液 注：ミリポアシステム（Milli - Q水）から取得として染色溶液の調製のために、このような分析グレード（PA）と高純度の水のような高品質で化学品を使用。 <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2">クマのソリューション： </td><td>広告2000ミリリットルH 2 O </td></tr><tr><td> 0.02％（w / v）の</td><td> CBB G - 250 </td><td> 0,4グラム</td></tr><tr><td> 5％（w / v）の</td><td>硫酸アルミニウム-（14-18） - 水和物</td><td> 100グラム</td></tr><tr><td> 10％（v / v）の</td><td>エタノール（96％） </td><td> 200ミリリットル</td></tr><tr><td> 2％（v / v）の</td><td>オルトリン酸（85％） </td><td> 47ミリリットル</td></tr></tbody></table> 注：染色溶液の調製のために、次の順序でコンポーネントを逐次添加を維持する必要がある。 <ol><li>第一Milli - Q水に硫酸アルミニウムを溶解する</li><li>その後、エタノールを追加してホモジナイズし、解決するためにCBB G - 250を混在させる</li><li>ソリューションが完全に溶解されているように、最近、リン酸を（アルコールのメディアへの酸の取り込みは、そのコロイド状態に集約し、クマシー分子をすることができます）を追加</li><li>最終的にMilli - Q水でいっぱいに</li></ol> 注：最終的な染色液は濃い緑、青味のある外観をして泳ぐの粒子に満ちている： <ul><li>ろ液は、このソリューションはいけない！ </li><li>あなたが準備の順序を変更した場合、あなたは、機密性の低い、よりバイオレット-青みがかったソリューションになるだろう。 </li></ul><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2">ソリューションを脱染： </td><td>広告2000ミリリットルH 2 O </td></tr><tr><td> 10％（v / v）の</td><td>エタノール（96％） </td><td> 200ミリリットル</td></tr><tr><td> 2％（v / v）の</td><td>オルトリン酸（85％） </td><td> 47ミリリットル</td></tr></tbody></table> 2。染色手順<ul><li>二次元目の分離後、慎重にガラス板からゲルを取り出して、Milli - Q水で満たされた染色皿にそれらを転送する。 </li><li>水平シェーカーで10分間ゲルをMilli - Q水で3回洗浄し（ゲル上の残りのSDSは、タンパク質への染料の境界を乱すので、不十分な洗浄は貧しい感受性を引き起こす）​​。 </li><li>均等にコロイド粒子を分散させるために使用する前に、クマシーソリューションを振る。 </li><li>よく2月12日時間シェーカー上で攪拌によってクマシーソリューションで覆われたゲルをインキュベートする。あなたが間に染色の進行状況を監視できるように、この染色は、マージナルな背景を生成します。 注：10分後には、インキュベーションの2時間以内に約80％がそれに染色、最初に表れるの蛋白質スポットを見ることができますsの最大レベルは完了です。ほぼ100％の染色の場合は、一晩インキュベーションすることをお勧めします。いくつかのケースでは、染色されるタンパク質の量は膨大であり、解決策が明るい青色に変わるときに、染色液のリフレッシュは必要です。 </li><li>染色手順の後にクマの液を除去し、Milli - Q水で二回ゲルをすすぐ。 注：粒子が依然として残っているように限り、染色液を再利用できる、そうでなければ（あなたの研究室では廃棄物処理のための特別な規制があるかもしれないことに注意して）それを捨てる。 </li><li>糸くずの出ないペーパータオルで染色皿から染料粒子を付着取り外し、10秒間汚れを除く - 60分。 注：またばかりMilli - Q水でゲルを洗浄することができますが、スキャン手順中に発生する予定ゲルで不規則な、弱いクマの映画をそこに続くので、これは我々が取ゲルのためにのみお勧めします。 </li><li>最後にMilli - Q水で二回ゲルをすすぎ：ゲルは、元の厚さに達する（アルコール酸のメディアは、ゲルの縮小を行う）と中和水に加えてクマの色の強度を高めるでしょう。 </li></ul>パート3：代表的な結果あなたが上記のプロトコルに従うのであれば、あなたの2次元ゲル独特の解決と同様ステンドダークブルーの蛋白質スポットを取得します。にもシェフチェンコら 5、質量分析との良好な感度との互換性を主張するプロトコルに応じて銀で染色した2 - Dゲルと比較して、我々は同じ染色の結果を達成する。 <img src="/files/ftp_upload/1431/fig1.jpg" alt="図1" /> 図1：上記の実験の最終結果。カン氏のクマシープロトコル（）シェフチェンコらによれば、銀染色のように強く行います。（B）2 - Dゲル電気泳動後にタンパク質を検出する。 パート4：ヒントとテクニック<ul><li>独自のサンプルを処理する前にいくつかのテストstainingsを実行します。説明のつかない理由のため私たちはミリグラムが適用された場合でも、目的のタンパク質が正常に検出できないことが時々報告。このケースでは、感度をテストするための希釈系列を用意することをお勧めします。 </li><li>あなたがゲル内の一般のタンパク質の検出（の）低いがある場合は、SDS - PAGE中に分離ゲルにスタッキングから失敗の転送は、おそらく理由になります。あなたは、スタッキングエリアを含む完全なゲルを染色することによってそのような粘着性のタンパク質を確認することができます。 </li><li>あなたの等電点電気泳動結果の高速な検証では、直接それ以上の二次元分離することなくIPGストリップを染色することができます。 </li><li>彼らは（あなたがゲルに心を動かされない続ければ、色素がちょうどゲルの片側に結合する）両側から均等に染色されるので、時々染色手順の実行中にゲルを回します。 </li><li>私たちは、暗い瓶の中に染色液のその記憶を経験し、その寿命を（透明ボトルで、最大4ヶ月間まで）増加する。 </li><li>染色と文書化した後に、（あなたが酸性溶液を追加する場合には菌類による汚染を避けるために）数年間冷蔵庫でゲルを保つことができます。 </li><li>トリプシン消化物をゲルプラグの脱色は、ブロックヒーターで温暖化によって加速することができる。 </li></ul>

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	<li>Fazekas de St Groth, S., Webster, S. R. G., Datyner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+new+staining+procedures+for+quantitative+estimation+of+proteins+on+electrophoretic+strips.">Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips.</a> Biochim. Biophys. Acta. 71, 377-391 (1963).</li><li>Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels+including+isoelectric+focusing+gels+with+clear+background+at+nanogram+sensitivity+using+Coomassie+Brilliant+Blue+G-250+and+R-250.">Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.</a> Electrophoresis. 9, 255-262 (1988).</li><li>Candiano, G., Bruschi, M., Musante, L., Santucci, L., Ghiggeri, G. M., Carnemolla, B., Orecchia, P., Zardi, L., Rigetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+Silver:+A+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis.">Blue Silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).</li><li>Kang, D., Gho, S. G., Suh, M., Kang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Sensitive+and+Fast+Protein+Detection+with+Coomassie+Brilliant+Blue+in+Sodium+Dodecyl+Sulfate-Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis.">Highly Sensitive and Fast Protein Detection with Coomassie Brilliant Blue in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis.</a> Bull. Korean Chem. Soc. 11, 1511-1512 (2002).</li><li>Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+sequencing+of+proteins+silver-stained+polyacrylamide+gels.">Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels.</a> Anal. Chem. 68, 850-858 (1996).</li></ol>

革新的なまたは単に別のクマのプロトコル？ 現時点ではクマシーブリリアントブルーで手続きを染色するための複数のプロトコルが存在する。それらのほとんどはNeuhoffと同僚2で最も一般的に使用されるプロトコルのいずれかのマイナーまたはメジャーの変更に起因する。また、カンのプロトコルは、Neuhoffの式に基づいた。しかし、それは本当にプロテオミクス...

<table border="1" ><tr><td> 製品の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> IEFとSDS - PAGE用： </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>イモビDryStripゲル</td><td> GEヘルスケア</td><td> 17-6001-94 </td><td>さらに有効期限を2年後に使用することができます。 </td></tr><tr><td>イモビDryStrip Reswellingトレイ</td><td> GEヘルスケア</td><td> 80-6371-84 </td><td>有機溶剤で洗浄しないでください。 7〜18センチメートルIPGストリップのために設計されています。 </td></tr><tr><td>イモビDryStripキット</td><td> GEヘルスケア</td><td> 18-1004-30 </td><td>トレイ、電極ホルダー、アノードとカソード電極、アライナーとサンプルカップバーとサンプルカップを含みます。 </td></tr><tr><td> EPS 3501 XLの電源</td><td> GEヘルスケア</td><td> 18-1130-05 </td><td>消耗品は、3500までの電圧V </td></tr><tr><td> Multiphor II電気泳動ユニット</td><td> GEヘルスケア</td><td> 18-1018-06 </td><td>可動電極は、すべての長さのIPGストリップにIEFを有効にする（7〜24センチメートルはストリップをIPG） </td></tr><tr><td> PerfectBlueゲルシステムツインS </td><td> Peqlab </td><td> 45から1010 - C </td><td> 10 × 10センチメートルミニゲルフォーマットでSDS - PAGE。ゲルチャンバーは、冷却システムが含まれています。 </td></tr><tr><td> コロイドクマG - 250染色の場合： </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>蓋付染色皿</td><td> VWR </td><td> 216-3412 </td><td>ミニゲルのはめあい。シェーカーでスタッカブル。 </td></tr><tr><td>硫酸アルミニウム- 18 -水和物</td><td>メルク</td><td> 1.01102.5000 </td><td>我々は、メルクとの最高の体験をしました。 5kgのパッケージでだけ利用できる。 </td></tr><tr><td>オルトリン酸</td><td> Prolabo </td><td> 20 624.295 </td><td>ガラスびんで販売。 </td></tr></table>

fast and sensitive colloidal coomassie g-250 staining for proteins in polyacrylamide gels

クマシーブリリアントブルー（CBB）は、一般的にシンプルな染色法と高い定量を提供し、SDS - PAGEにより分離されたタンパク質の可視化のために使用される色素です。さらに、質量分析、タンパク質の同定と完全に互換性があります。しかし、これらの利点にもかかわらず、CBBは、銀や蛍光stainingsよりも感度が低いとみなされるため、分析用ゲル電気泳動ベースのプロテオミクスのアプローチ中のタンパク質の検出に用いることはめったにありません。 オリジナルのクマプロトコル1のいくつかの改良がCBBの感度を高めるために行われています。二つの主要な変更は、コロイド粒子に色素分子を変換することにより、低濃度タンパク質の検出を強化するために導入されました：1988年、Neuhoffらは、CBB G - 250ベースの染色液2に20％メタノールおよび硫酸アンモニウムの高濃度を適用し、そして2004年にCandiano ら 。硫酸アンモニウムとメタノール3の存在下でリン酸とCBB G - 250を使用して確立されたブルーシルバー 。それにもかかわらず、これらすべての修正はわずか約10 ngのタンパク質の検出を可能にする。コロイドクマシー染色のための広くfamelessプロトコルは、Kang らによって出版された。彼らは錯化物質に関するNeuhoffのコロイドCBB染色のプロトコルを変更した2002年。代わりに硫酸アンモニウムを彼らは硫酸アルミニウムとメタノールが毒性の少ないエタノール4によって置き換えられたために使用。小説アルミベースのカンの研究では染色はタンパク質によって若干の感度のばらつきとは1 ng /バンド（ホスホリラーゼb）のように低い検出する優れた感度を示した。 ここでは、分析目的のタンパク質の迅速かつ高感度コロイドクマシー染色のためのカンのプロトコルのアプリケーションを示しています。我々は日常的に私たちのワーキンググループで行われる二次元のゲルを使って素早く簡単にプロトコルを説明します。

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Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels

このビデオでは、カンによるとコロイドクマG - 250染色プロトコールを普及するものと<em&gt;ら。</em&gt;ゲルの平均4 ngのタンパク質の検出のための。染色は2時間以内と何の努力もせずに完了します。我々は日常的にゲルベースの​​プロテオミクス、分析目的のためにカンのプロトコルを使用してください。

ポリアクリルアミドゲルでのタンパク質の迅速かつ高感度コロイドクマG - 250染色

Coomassie Brilliant Blue (CBB) is a dye commonly used for the visualization of proteins separated by SDS-PAGE, offering a simple staining procedure and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

40.0K ビュー.  University Duesseldorf. このビデオでは、カンによるとコロイドクマG - 250染色プロトコールを普及するものとら。ゲルの平均4 ngのタンパク質の検出のための。染色は2時間以内と何の努力もせずに完了します。我々は日常的にゲルベースの​​プロテオミクス、分析目的のためにカンのプロトコルを使用してください。

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Staining Proteins in Gels

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for detecting proteins by four popular methods. Coomassie blue staining is an easy and rapid method. Silver staining, while more time consuming, is considerably more sensitive and can thus be used to detect smaller amounts of protein. Fluorescent staining is a popular alternative to traditional staining procedures, mainly because it is more sensitive than Coomassie staining, and is often as sensitive as silver staining. Staining of proteins with SYPRO Orange and SYPRO Ruby are also demonstrated here.

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. Staining of proteins with Coomassie Blue, Silver Staining, SYPRO Orange, SYPRO Ruby are demonstrated in this video.

ゲルでタンパク質を染色

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

生物学

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

チックの全マウントの抗体染色のための方法

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

クーマシー有機溶媒および酢酸のないG - 250でゲル中のタンパク質の染色

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their separation in a polyacrylamide gel matrix based on the molecular weight. Fragments between 2 to 500 bases, with length differences as small as a single nucleotide, can be separated using this method1. The migration of the sample is dependent on the chosen acrylamide concentration. A higher percentage of polyacrylamide resolves lower molecular weight fragments. The combination of urea and temperatures of 45-55 &deg;C during the gel run allows for the separation of unstructured DNA or RNA molecules.
In general this method is required to analyze or purify single stranded DNA or RNA fragments, such as synthesized or labeled oligonucleotides or products from enzymatic cleavage reactions.
In this video article we show how to prepare and run the denaturing urea polyacrylamide gels. Technical tips are included, in addition to the original protocol 1,2.

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis Urea PAGE

Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis is used to separate single-stranded DNA or RNA up to a limit of 500 nucleotides. Urea in combination with heat denatures samples and unstructured single strands migrate within the gel matrix according to their molecular weight.

変性尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動（尿素PAGE）

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their ...

Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to extracellular agents is predominantly regulated by the phospholipase C&beta;- G&alpha;q pathway localized on the plasma membrane which is stimulated by agents such as acetylcholine 3,4. We have recently found that plasma membrane protein domains called caveolae5,6 can entrap activated G&alpha;q 7. This entrapment has the effect of stabilizing the activated state of G&alpha;q and resulting in prolonged Ca2+ signals in cardiomyocytes and other cell types8. We uncovered this surprising result by measuring dynamic calcium responses on a fast scale in living cardiomyocytes. Briefly, cells are loaded with a fluorescent Ca2+ indicator. In our studies, we used Ca2+ Green (Invitrogen, Inc.) which exhibits an increase in fluorescence emission intensity upon binding of calcium ions. The fluorescence intensity is then recorded for using a line-scan mode of a laser scanning confocal microscope. This method allows rapid acquisition of the time course of fluorescence intensity in pixels along a selected line, producing several hundreds of time traces on the microsecond time scale. These very fast traces are transferred into excel and then into Sigmaplot for analysis, and are compared to traces obtained for electronic noise, free dye, and other controls. To dissect Ca2+ responses of different flux rates, we performed a histogram analysis that binned pixel intensities with time. Binning allows us to group over 500 traces of scans and visualize the compiled results spatially and temporally on a single plot. Thus, the slow Ca2+ waves that are difficult to discern when the scans are overlaid due to different peak placement and noise, can be readily seen in the binned histograms. Very fast fluxes in the time scale of the measurement show a narrow distribution of intensities in the very short time bins whereas longer Ca2+ waves show binned data with a broad distribution over longer time bins. These different time distributions allow us to dissect the timing of Ca2+fluxes in the cells, and to determine their impact on various cellular events.

We present a method to isolate rapid (microsecond) calcium events from slower fluxes in living cells using laser scanning confocal microscopy. The method measures fluorescence intensity fluctuations of calcium indicators by recording line scans of several hundred pixels in a cell. Histogram analysis allows us to isolate the time scales of different calcium fluxes.

心筋細胞における高速カルシウムフラックスの測定

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting factors, such as labor intensive sample preparations, low detection limits, slow scan speeds, intensive method optimization for each metabolite, and the inability to measure both positively and negatively charged ions in single experiments. Therefore, a novel metabolomics protocol could advance metabolomics studies. Amide-based hydrophilic chromatography enables polar metabolite analysis without any chemical derivatization. High resolution MS using the Q-Exactive (QE-MS) has improved ion optics, increased scan speeds (256 msec at resolution 70,000), and has the capability of carrying out positive/negative switching. Using a cold methanol extraction strategy, and coupling an amide column with QE-MS enables robust detection of 168 targeted polar metabolites and thousands of additional features simultaneously.&#160; Data processing is carried out with commercially available software in a highly efficient way, and unknown features extracted from the mass spectra can be queried in databases.

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. Utilizing normal-phased liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry with polarity switching and a rapid duty cycle, we describe a protocol to analyze the polar metabolic composition of biological material with high sensitivity, accuracy, and resolution.

敏感な、大規模定量的メタボロームのための戦略

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

Development of a Colloidal Gold-based Immunochromatographic Test Strip for Detection of Cetacean Myoglobin

This protocol describes the development of a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format that can be used to differentiate the myoglobin (Mb) of cetaceans from that of seals and other animals. The strip provides rapid and on-the-spot screening for cetacean meat, thereby restraining its illegal trade and consumption. Two monoclonal antibodies (mAbs) with reactivity toward the Mb of cetaceans were developed. The amino acid sequences of Mb antigenic reactive regions from various animals were analyzed in order to design two synthetic peptides (a general peptide and a specific peptide) and thereafter raise the mAbs (subclass IgG1). The mAbs were selected from hybridomas screened by indirect ELISA, western blot and dot blot. CGF5H9 was specific to the Mbs of rabbits, dogs, pigs, cows, goats, and cetaceans while it showed weak to no affinity to the Mbs of chickens, tuna and seals. CSF1H13 can bind seals and cetaceans with strong affinity but showed no affinity to other animals. Cetacean samples from four families (Balaenopteridae, Delphinidae, Phocoenidae and Kogiidae) were used in this study, and the results indicated that these two mAbs have broad binding ability to Mbs from different cetaceans. These mAbs were applied on a sandwich-type colloidal gold immunochromatographic test strip. CGF5H9, which recognizes many species, was colloid gold-labeled and used as the detection antibody. CSF1H13, which was coated on the test zone, detected the presence of cetacean and seal Mbs. Muscle samples from tuna, chicken, seal, five species of terrestrial mammals and 15 species of cetaceans were tested in triplicate. All cetacean samples showed positive results and all the other samples showed negative results.

This protocol describes the development of two IgG class monoclonal antibodies (mAbs) strongly reactive to myoglobin of cetaceans. These mAbs are applied on a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format to differentiate the Mb of cetaceans from seal and other animals.

クジラミオグロビンの検出のための金コロイドベースのイムノクロマト法テストストリップの開発

This protocol describes the development of a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format that can be used to ...

Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC) are the recently discovered modified cytosine bases produced by enzymatic oxidation of 5mC, whose biological functions remain relatively obscure. A number of approaches ranging from biochemical to antibody based techniques have been employed to study the genomic distribution and global content of these modifications in various biological systems. Although some of these approaches can be useful for quantitative assessment of these modified forms of 5mC, most of these methods do not provide any spatial information regarding the distribution of these DNA modifications in different cell types, required for correct understanding of their functional roles. Here we present a highly sensitive method for immunochemical detection of the modified forms of cytosine. This method permits co-detection of these epigenetic marks with protein lineage markers and can be employed to study their nuclear localization, thus, contributing to deciphering their potential biological roles in different experimental contexts.

Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.

高感度免疫組織化学を使用してシトシンの修飾された形態の検出

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related disorders continue to be a major contributor of deaths around the world, necessitating the need for even greater understanding of their pathobiology. Traditional antibody-based techniques like western blotting or immunohistochemistry suffer from being low-throughput besides being labor-intensive and qualitative or semi-quantitative. Even conventional mass spectrometry-based shotgun approaches fail to provide conclusive evidence to support a certain hypothesis. Targeted proteomics approaches are largely hypothesis driven and differ from the conventional shotgun proteomics approaches that have been long in use. Multiple reaction monitoring is one such targeted approach that requires the use of a special mass spectrometer called the tandem quadrupole mass spectrometer or triple quadrupole mass spectrometer. In the current study, we have systematically highlighted the major steps involved in performing a successful tandem quadrupole mass spectrometry-based proteomics workflow using human brain tissue with an aim to introduce this workflow to a broader research community.

The protocol aims to introduce the use of a triple quadrupole mass spectrometer for Multiple Reaction Monitoring (MRM) of proteins from clinical samples. We have provided a systematic workflow starting from sample preparation to data analysis for clinical samples with all the necessary precautions to be taken.

ヒト脳組織からのタンパク質の多発反応モニタリングを用いた定量的プロテオミクスワークフロー

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role in a variety of basic biological structures and processes. As polymers, GAGs exist as a polydisperse mixture containing polysaccharide chains that can range from 4000 Da to well over 40,000 Da. Within these chains exists domains of sulfation, conferring a pattern of negative charge that facilitates interaction with positively charged residues of cognate protein ligands. Sulfated domains of GAGs must be of sufficient length to allow for these electrostatic interactions. To understand the function of GAGs in biological tissues, the investigator must be able to isolate, purify, and measure the size of GAGs. This report describes a practical and versatile polyacrylamide gel electrophoresis-based technique that can be leveraged to resolve relatively small differences in size between GAGs isolated from a variety of biological tissue types.

This report describes techniques to isolate and purify sulfated glycosaminoglycans (GAGs) from biological samples and a polyacrylamide gel electrophoresis approach to approximate their size. GAGs contribute to tissue structure and influence signaling processes via electrostatic interaction with proteins. GAG polymer length contributes to their binding affinity for cognate ligands.

ポリアクリルアミドゲル電気泳動と銀染色によるグリコサミノグリカンの検出

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role ...