このプロトコルは、特定のタイプの一次ニューロンを精製し、培養するための簡単で再現可能な方法を記述する。これらの培養は、電気生理学的、形態学的および生存解析に適している。精製されたニューロンの培養は、神経生理学の基礎、シナプスの形成、およびニューロンネットワークの発達方法を研究するために使用することができます。
皮質グルタミン酸主細胞およびGABAergicインターニューロンに焦点を当てていますが、この手順は、蛍光タンパク質を発現する神経細胞を研究するために簡単に変更することができます。ガラスカバーリップを調製するために、最初に5ミリリットルのアリコートを解凍して、1ミリリットルPLL溶液あたり200マイクログラムを取り出します。このストック溶液を、45ミリリットルの純噴射等水を加えて、1ミリリットル当たり20マイクログラムに希釈します。
次に、新しい50ミリリットルの円錐管に溶液を殺菌し、このチューブをPLL滅菌としてラベル付けします。次に、滅菌PLL溶液に100個の無菌丸12ミリメートルガラスカバーリップを入れます。チューブを5~10分に2~3分攪拌してコーティングを確実にします。
PLLコーティングの40分後、ティッシュペーパーを2枚取り、フローキャビネットに平らに置きます。70%エタノールを使用して紙を殺菌し、折り目を取り除くために平らにし、乾燥させます。PLLで1時間ガラスカバーリップをコーティングした後、余分なPLL溶液を除去し、滅菌注入グレードの水を追加します。
カバーリップを2〜3秒間静かに攪拌して余分なPLLを取り除きます。このすすいのステップをさらに2回繰り返します。余分な水を取り除き、その後、滅菌ティッシュペーパーにカバーリップを転送します。
乾燥したら、カバーリップを24ウェルカルチャープレートに移します。細胞培養液を調製するために、細胞培養バッファーの12ミリリットルを15ミリリットルの円錐チューブに測定し、BSAとしてラベルを付ける。異なる15ミリリットルチューブに細胞培養バッファーの5ミリリットルを測定し、パパインとしてラベル.
その後、両方のチューブを摂氏37度で15分間インキュベートします。BSAとラベル付けされたチューブに120ミリグラムのBSAを加えます。その後、溶液を溶解するためにチューブを反転させます。
その後、パパインとラベル付けされたチューブに7ミリグラムのパパインを加えます。両方のチューブを15分間水浴に戻します。フィルターは、新鮮な円錐管にBSA溶液を殺菌します。
滅菌BSA溶液を3つのチューブに分割し、各チューブにBSA滅菌とラベルを付け、1つ、2つ、または3つ。今フィルターは、パパインチューブを殺菌し、パパイン滅菌としてチューブをラベル付けします。すべてのチューブを水浴に戻し、使用するまで摂氏37度でインキュベートを続けます。
組織解剖の準備のために、海馬と皮質の解剖に必要なメス、はさみ、鉗子、およびへらをレイアウトする。フローキャビネットに35ミリメートルのペトリ皿2個と滅菌フィルターペーパーを含む100ミリメートルのペトリ皿を置きます。トランスジェニックNexCreを収集します。;Ai9またはベシクラルGABAトランスポーターヴィーナスマウスは、野生のタイプのリットルの仲間から蛍光パプを識別するために適切な励起および発光フィルタを備えた蛍光ランプを使用して解剖される。
動物を解剖する直前に、各ペトリ皿に冷たい無菌細胞培養バッファーを充填します。解剖後、トランスジェニックの子犬の脳を滅菌濾紙に慎重に移す。まず、小脳を解剖し、2つの半球を分離します。
その後、各半球から海馬と皮質を慎重に分離します。解剖した組織を、冷蔵細胞培養バッファーを含む35ミリメートルのペトリ皿に移します。その後、解剖された海馬と皮質を別の35ミリメートルのペトリ皿の蓋に移します。
メスの刃の平らな端を使用して、小片だけが残るまで慎重に十字架の動きで組織を刻みます。次に、ペトリ皿蓋から滅菌パパインチューブに少量のパパイン溶液で切り刻んだ組織を移す。25分間摂氏37度で組織をインキュベートします。
パパインインキュベーション後、滅菌パパインチューブと無菌BSAチューブをフローキャビネットに移します。その後、1ミリリットルのパスツールピペットを使用して、ペパパインチューブからBSAチューブ1にコルチコヒッポカンピ組織のみを移送します。組織の大きな塊を分割するために、1ミリリットルパスツールピペットを使用して組織を数回トリチュレートします。
これに続いて、細かい先端パスツールピペットを使用して組織を7回トリチュレートする。30秒後、BSAチューブ1からBSAチューブ2に下液と組織の1ミリリットルを移す。BSAチューブ内の組織を、微細な先端パスツールピペットを使用して数回数回トリチュレートします。
トリアーレーション後、BSAチューブ1からBSAチューブ3に下側組織と溶液の1ミリリットルを移す。BSAチューブ内の組織を数回3回トリチュレートする。トリアージの後、すべての溶液と組織をチューブ2と3からBSAチューブ1に移します。
さらに2〜3回トリチュレートし、遠心分離機を3,000回gで3分間トリチュレートする。遠心分離後、ペレット化した組織から上清を慎重に除去し、P1000ピペットを使用して、完全な冬眠の2ミリリットルの低蛍光培地で細胞を再懸濁する。次いで、組織を20回トリチュレートして、組織溶液の完全な再懸濁を確実にする。
続いて、30マイクロメートルの細胞ふるいを通して細胞懸濁液をポリスチレンサンプルチューブにファイラーする。完全な冬眠Aメディアの300マイクロリットルを必要な数のポリプロピレンチューブにピペット処理して、細胞選別コレクションチューブを準備します。分類する蛍光セルの種類ごとに、適切な励起フィルターと発光フィルタを選択します。
488ナノメートルの励起波長を用いて金星タンパク質を励起し、530/40の発光フィルタセットを通して放出された光を検出します。531ナノメートルの励起波長を用いたTdTomatoタンパク質をエキサイトし、575/30の発光フィルタセットを通して発光した光を検出します。高純度の場合は、明るく標識された蛍光細胞を選別します。
細胞の選別後、収集した細胞を2ミリリットルの丸底遠心管に移す。その後、3,000回gで細胞を遠心分離し、3分間細胞ペレットを形成する。プリ温め完了NBA培地の必要量で細胞ペレットを再懸濁し、マイクロリットル当たり1,000細胞の細胞密度を達成する。
解像細胞の存在を確認するには、4Xまたは10X対物レンズを使用して顕微鏡下で細胞溶液をチェックします。細胞をめっきする前に、2〜3秒間中速で渦を発生させるため、細胞懸濁を確実にする。ボルテックスに続いて、各カバースリップの中央に細胞懸濁液の10マイクロリットルを素早くピペット。
1時間後、500マイクロリットルの事前温めた完全なNBA培地で細胞を供給し、摂氏37度でインキュベーターに戻ります。精製したニューロンとグリア細胞を共培養するために、グリア細胞を必要な数の細胞培養挿入物に通す。これは、完全なNBA培地の500マイクロリットルの液滴で40,000個のグリア細胞をめっきすることによって行われる。
1時間後、グリア細胞培養挿入物を精製ニューロンに移す。培養インサートから余分な培地を取り除き、培養用の培養器にプレートを戻します。正常な並べ替えに続いて、メッキされたニューロンは滑らかな膜で丸い形で現れるべきであり、体外で約1時間後に神経症を惜しむ必要があります。
インビトロで7日間までに、いくつかの細胞死が明らかであるが、生存可能な細胞はすべての培養条件に存在すべきである。精製培養物の分析は、グルタミン酸作動性ニューロンとGABAergicニューロンの両方が、細胞体から軸索および樹状突起を拡張し、超閾値脱分極電流注入に応答して作用電位を生成する能力を保持することができたことを明らかにした。特に精製に続いて、GABAERGICニューロンだけが大量の自発的シナプス伝達を受け、グルタミン酸ニューロンはグリア細胞の不在時にシナプス伝達をほとんど受け取らなかった。
重要なことに、グリア細胞で精製されたニューロンを培養すると、グルタミン酸細胞におけるシナプス伝達を促進するだけでなく、ニューロンの成長と生存を改善します。カバーリップの十分な偏光コーティングと、手順全体を通して培養培地の生理学的pHを維持することは、良好な細胞培養を確保するための鍵である。このプロトコルに従って、精製培養物にRNAシーケンシングおよびタンパク質量分析を行い、翻訳および転写プロセスを特定の神経細胞タイプで調査することが可能であるべきである。
