我々は、イノベーションのためのカナダの財団、ブリティッシュコロンビア州ナレッジ開発基金、ゲノムブリティッシュコロンビア州と森林土壌の生産性の継続的な研究をサポートするための森林との範囲のブリティッシュコロンビア州省に感謝します。 SLは、微生物の多様性と進化のためのトゥーラ基礎資金センターからのフェローシップでサポートされていました。

パートI：DNAの抽出 手順 1。 8時間は、DNAの定量を除く6つのサンプルを処理するために、必要とされています。 もし抽出を開始する前に、プレチル乳鉢、乳棒と-20℃の冷凍庫でへらまたは液体窒素を使用してする必要があります。また、氷上で20 mlのクロロホルムイソアミルアルコール（24:1）を含むプレチル50mlチューブ。 65にハイブリダイゼーションオーブンを設定° Cに予熱。それが℃の結晶を溶かすために60に暖かい結晶化されている場合、CTAB溶液を確認してください。ただ、抽出を開始する前に、最後の成分を添加することにより変性溶液と抽出緩衝液を完了します（下のレシピを参照）。ヒュームフード内のすべての抽出手順を行う。 2。変性緩衝液と抽出緩衝液を準備します。 注：DNA収量を最大にするために、それは正確に指示に従って、バッファを作成することが重要です。 3。あらかじめ冷却した乳鉢で土壌2gを置きます。 注：フィールドで採取した土壌は、輸送用のドライアイス上で凍結し、-80℃で保存してください。前のDNA抽出〜2 mmのふるいを使用して解凍し、ふるいの土壌。あなたは、最大10 gに土壌の開始量を増やすことができます 4。土壌へのソリューションを変性液1mlを追加。 5。土壌粒子は、粉末状と均質に見えるまで、乳棒を用いて2液Nの土壌を凍結して挽く。凍結と二回研削を繰り返します。 注意：完全に土壌試料をカバーする十分な液体窒素を用いて、研削中にフリーズ土壌のサンプルを保管してください。研削時のわずかな融解は許容されます。 6。あらかじめ冷却したスパチュラを用いて50 mlコニカルチューブにグラウンドの土を移す。 注：グランド土壌試料は-80℃この時点で、必要に応じてで保存できます。 7。抽出緩衝液9mlのを追加。ソリューションと土壌、低速で渦を簡単に混合する。 注：バッファが均質であることを確認するには、60℃に温め° Cを使用前に10-15分ほど。抽出全体で60 ° Cでバッファの残りをしてください。速度8でボルテックス（10が最大のスケールで）。 8。ハイブリダイゼーションオーブンで65℃で40分間インキュベートする。インキュベーションの間、連続して最低速度でチューブを回転させ、または軽くチューブを10分ごとに反転。 注：バッファが大きい表面積にわたって土壌に連絡できるように、ハイブリダイゼーションオーブンで水平にチューブを置きます。解決策は、インキュベーションの間に少し粘性が見えるかもしれません。 9。 14℃ - 10℃10分間、1800 × gで遠心する20ミリリットルのクロロホルム - イソアミルアルコール（24:1）を含む予備冷却50 mlコニカルチューブに上清を移す、氷上に置きます。 注：上清転送するとき、有機層（最下層）を妨害しないように注意してください。それはクリーンな上清を収集するために必要がある場合上清の1〜2 mlのままにします。あなたは多くの場合、上清の上にベージュ層（厚さは約1-3 mm）を見ることができます。上清を収集するときにこの層を邪魔しないでください。このベージュ層の破損を防ぐために、管壁に沿って先端をスライドしてみてください。上清はあまりに濁っている場合は、クロロホルム - イソアミルアルコール抽出上清の1つのより多くの時間を繰り返す。クロロホルムを転送する際にクロロホルムがプラスチックを溶かすので、使い捨てのプラスチック製のピペットを使用しないでください。ガラスピペットを使用して、またはガラスのメスシリンダー、または50 mlコニカルチューブに直接クロロホルムを注ぐ。 10。土壌のペレットを2回以上を抽出する。 10.1。土壌のペレットを5 mlの抽出緩衝液を加え、穏やか低速で簡単にボルテックスに続いて1 mlの先端を使って混ぜる。 注意：使用前にバッファを振って混ぜる。 10.2。 65℃のハイブリダイゼーションオーブンで10分間インキュベートする。 14℃ - 10℃10分間、1800 × gで遠心する ステップ9でチューブに上清を移す。チューブ回収した上清とクロロホルム - イソアミルアルコールで抽出中に氷上にしてください。 注：サンプル間混合クロスすることなく、同じチューブに上清を追加することを確認してください。 10.3。 9.1と9.2つのより多くの時間を繰り返します。 11。回転プレートを使用して、非常に静かに採取した上清（14〜19ミリリットル）と10分は1.25 rpmでクロロホルム - イソアミルアルコールを含むチューブを揺らし。 注意：漏れを防ぐために非常にしっかりと蓋を閉じてください。の漏れを容易に検出できるように、チューブを配置する前にロッキングプレート上にペーパータオルを置きます。 12。 14℃ - 10で20分間1800 × gの遠心 13。新しいチューブに水相を移す。 注：水相（上部層）と有機層（底部との間の相間を邪魔しないでください。層）に、上清を移す。唯一のクリーンな上清のコレクションを確保するために上清約1.5 2mlを残す。 14。イソプロピルアルコールを（ - 21.aステップ15.a）を使用してDNAを回収する。あなたが回復することは困難であるイソプロピルアルコール沈殿によりほとんど見えないペレットを生成するサンプル内のバイオマスの非常に低い金額を、予想される場合 - あるいは、アミコン®ウルトラ- 15遠心フィルターデバイス（21.bステップ15.b）を使用します。 15.a.新しいチューブの超遠心上清を置きます。 16.a. 0.6:1の容積比で上清を回収するためにイソプロピルアルコールを追加。ミックスに軽く数回チューブを反転。 室温で30分間17.aインキュベートする。 18.a. 20℃20分間16000 × gで遠心分離、 - 25℃遠心分離のステップの前によくバランスされているすべてのチューブの重みを確認してください。 注：チューブの遠心力の方向をマーク、そのDNAの収量が低いときに、より簡単にDNAペレットを検出することができます。 19.a.吸引デカントまたは吸引により、イソプロピルアルコールを削除します。 DNAペレットを乱さないように注意してください。 注意：できるだけ早く遠心分離が完了するとイソプロピルアルコールを削除します。 DNAペレットをなくさないように十分注意してください。 DNAペレットのサイズは（〜9 mmの直径）はっきり見えるからほとんど見えないため、土壌の種類に応じて大きく異なる場合があります。それは慎重になるようではないDNAペレットから吸引チューブの壁に沿って吸引によるイソプロピルアルコールの残留物を除去することをお勧めします。 20.a. 5室温で乾燥したDNAペレット - 20分。 注：乾燥したDNAペレット以上しないでください、それ以外の場合はDNAを再溶解が困難になる。 21.a. 200μlのTEにDNAペレットを再懸濁します。穏やかなタッピングで混ぜる。 1.5 mlチューブにDNA溶液を移す。 ℃で一晩完全にDNAを溶解させるために4でチューブを保持します。 注：ペレットのサイズに応じて、追加するTEの音量を調整することができます。通常、200 - TE 400μlのが適しています。 21.b. - *あるいは手順15.bに従ってください 15.b.アミコン®ウルトラ- 15遠心フィルターデバイスを事前に洗浄、10分間、3500 × gでデバイスと遠心に15ミリリットルTEを追加。フロースルーを捨てる。 16.b.ステップ13からプレ洗浄アミコンフィルターにDNA溶液を置きます。 DNA量が200に減少するまで3500 × gで遠心する- 500μlを。フロースルーを捨てる。 17.b.二回TEにDNAを洗浄する。アミコンフィルターデバイスに10ミリリットルTEを追加。 DNA量は約200μlに減少するまで3500 × gで遠心します。フロースルーを捨てる。複数の時間を繰り返す。 18.b.新しい1.5 mlチューブにフィルターにDNA溶液を移す。 19.b.アミコンフィルターに40μlのTEを追加。フィルター上の任意のDNAの残留物を回収するためにピペッティングすることにより、フィルタ膜の両方の側面を洗ってください。ステップ18.b.でチューブにこの洗浄液を追加 20.b.必要に応じて、DNAをさらにマイクロコン® Ultracel YM - 30遠心フィルターユニットにより濃縮することができます。200μlのTEを加えると7分には、10000 × gで遠心分離することにより、フィルタを事前に洗ってください。 1分間5000 × gでフィルターや遠心分離にDNA溶液を追加。フィルター上のDNA溶液の量は約50μlに減少するまで遠心操作を繰り返します。 注：マイクロコンフィルターの最大初期サンプル容量は500μlです。 14000 × gでオーバースピードで遠心分離していないメンブレンを完全に乾くまで遠心以上しないでください。いくつかの液体がまだ遠心分離後にフィルタをカバーしていることを確認してください。あなたが以上の遠心分離や膜が乾燥して、その後、15μlのTEを追加する場合、30秒間静かに撹拌し、21.b.に進みます 21.b. DNAを回収するために3分間1000 × gで新しいマイクロコンチューブと遠心分離機で逆さまにフィルターユニットを置きます。 22。 TAEゲル（0.8％、0.5xTAE、4時間50 V）によって、及び光度計分光光度計またはピコグリーンアッセイとプレートリーダーでDNAを定量化する。 注：DNAの量は、ゲル上に既知濃度（高分子DNAマーカーまたはλHindIII）とマーカーのバンドにサンプルのバンドを比較することによって推定することができます。 23。 （詳細については、ステップIIを参照して、少なくともその2 1％、1xTAEゲルでパルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）を用いて高分子量のDNAの完全性チェック<a href="https://www.jove.com/index/details.stp?id=1387">https://www.jove.com/index/details.stp?idを= 1387年</a> 、土井：Taupp ら 10.3791/1387 2009）。。 注：代わりに低融点アガロースのこのQCの目的のために、通常のアガロースゲルを使用することができます。簡単に言うと、電気泳動条件は以下の通りである：2-250キロバイト、6ボルト、初期の切り替え時間：5秒、最終的なスイッチング時間：15秒、14で12時間実行℃にゲルでDNAを可視化するために1時間SYBRゴールド染色。 24。抽出したDNAの分子量が十分であれば、次のCsCl勾配遠心分離のステップに進みます。また、DNAをCsCl遠心する前に-20℃または-80℃で保存することができます。 DNAのメジアン径が同じであるか、大規模な挿入のメタゲノムDNAライブラリーを構築する場合、36 KBを超えている必要があります。 パートII。塩化セシウム密度勾配超遠心分離を用いてDNA精製遠心分離機の調製：1.5 - 2時間 遠心分離のステップ：18時間 遠心分離後にエチジウムブロマイド（EtBrを）除去し濃縮したDNA：3時間 手順 詳細については、Wright らを参照してください。 、2009年<a href="https://www.jove.com/index/details.stp?id=1352">https://www.jove.com/index/details.stp?id=1352</a> 、DOI：10.3791/1352 代表的な結果/成果森林土壌有機物（O地平線）とミネラルの地平を2g（AE、AB、およびBtの地平線）から単離されたゲノムDNAの合計量（Skulow湖、BCにある長期の土壌の生産性（LTSP）のサイトからサンプリングされた、カナダと）森林との範囲のBC省によって管理さは10mgから180mgの範囲であった。 60キロバイト（図1） - 単離したDNAのメジアン径は40との間で普通であった。 260 nm/280 nmでの吸光度の比は1.3から1.6の間であったとしばしば土壌のサンプルで測定されたフミン酸の汚染を示す可能性のある230 nmにおけるピークがあった。 CsCl密度勾配遠心分離は、大幅にこの汚染を削減し、さらに280分の260〜1.8の割合の増加 - 図2a及び2bに示すように1.9。 <img src="/files/ftp_upload/1569/1569fig1.jpg" alt="図1" /> 塩化セシウム超遠心分離の前に抽出したゲノムDNAの図は、1。PFGE画像。 lane1：1キロバイトのマーカーは100 ng、レーン2：λHindIIIマーカーは100 ng、レーン3：λHindIIIマーカー250 ngの、レーン4：λHindIIIマーカー500ngの、lane5：フォスミド36キロバイトマーカーは100 ng、レーン6および7：ゲノムミネラル土壌地平線AE、レーン8および9から単離されたDNA：Skulow湖、BCのあるLTSPのサイトで鉱質土壌の地平線のABから単離したゲノムDNA <img src="/files/ftp_upload/1569/1569fig2tmb.jpg" alt="図2" border="0" /> 図2の前に（）およびCsCl超遠心（B）の後に分光光度計によって検出されたゲノムDNAのChromograms。ゲノムDNAの質の改善を示す塩化セシウム超遠心法、後の230nmの波長での吸光度値の減少に注意してください。してください<a href="http://jove.com/files/ftp_upload/1569/1569fig2.jpg">ここをクリックして</a>図2の拡大バージョンを参照すること。

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	<li>Hurt, R. A., Qiu, X., Wu, L., Roh, Y., Palumbo, A. V., Tiedje, J. M., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+recovery+of+RNA+and+DNA+from+soils+and+sediments.">Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments.</a> AEM. 67 (10), 4495-4503 (2001).</li><li>Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+extraction+from+0.22+&#956;M+Sterivex+filters+and+cesium+chloride+density+gradient+centrifugation.">DNA extraction from 0.22 &#956;M Sterivex filters and cesium chloride density gradient centrifugation.</a> JoVE. , (2009).</li><li>Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+insert+environmental+genomic+library+production.">Large insert environmental genomic library production.</a> J Vis Exp. , (2009).</li></ol>

レシピ *変性溶液 4 Mグアニジンイソチオシアネート 10mMトリス- HCl（pH7.0）で 1mMのEDTA 0.5パーセント2 - メルカプトエタノール<table border="0" style="font-size:9pt; width:400px;"><tr><td colspan="2"> 変性溶液：合計で10ミリリットル </td></tr><tr><td>グアニジンイソチオシアネート（MW 118.16） </td><td> 4.73グラム</td></tr><tr><td> 1Mトリス- HCl（pH 7.0） </td><td> 100μlの</td></tr><tr><td> 0.5M EDTA </td><td> 20μlの</td></tr><tr><td colspan="2">合計で9.95ミリリットルに水を追加。 </td></tr><tr><td colspan="2">オートクレーブ。 </td></tr><tr><td colspan="2">使用直前に50μlの2 - メルカプトエタノールを追加。 （1ミリリットル変性溶液ごとに2 - メルカプトエタノールを5μl） 注：4で変性溶液℃以下でご使用ください。 1週間以上前のバッファを使用しないでください。可能であれば、新鮮なバッファーを使用すること。 </td></tr></table> **のExtraction Buffer 100mMリン酸ナトリウムリン酸緩衝液[pH 7.0の] 100mMトリス- HCl [pH7.0の] 100mMのEDTA [pH8.0の] 1.5 M NaClを 1％の臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（CTAB） 2％SDS <table border="0" style="font-size:9pt; width:400px;"><tr><td colspan="2"> 合計で1 Lの抽出バッファー </td></tr><tr><td> 1Mリン酸ナトリウム緩衝液[pH 7.0の] * </td><td> 100ミリリットル</td></tr><tr><td>の1M Tris - HCl [pH7.0の] </td><td> 100ミリリットル</td></tr><tr><td> 0.5M EDTA [pH8.0の] </td><td> 200ミリリットル</td></tr><tr><td> 5 M NaClを</td><td> 300ミリリットル</td></tr><tr><td colspan="2">オートクレーブ、室温で保管してください。 </td></tr><tr><td colspan="2"> 200ミリリットル、5％の臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（CTAB、オートクレーブ）し、100ml、20％SDS（オートクレーブ）は使用直前に追加します。 CTABが結晶化した場合、60でそれを溶かす℃に * 1Mリン酸ナトリウム緩衝液：57.7ミリリットル、1Mリン酸ナトリウム一塩基性（のNaH 2 PO 4）と42.3ミリリットル、1Mリン酸ナトリウム二塩基（のNaH 2 PO 4）。 pHを7.0に調整する 注：それが降水量を持っている場合は、20％SDSを使用しないでください。あなたが解決策にSDSを追加するときには、乳白色の懸濁液をするのは正常です。一度° CでSDSがよく中断されるように、SDSを追加して60℃、抽出バッファーを置きます。 </td></tr></table>

extraction of high molecular weight genomic dna from soils and sediments

土壌のmicrobiomeは密接に陸域生態系内の栄養とエネルギーフローに関連付けられているゲノムの多様性と代謝革新の広大な、比較的未踏の貯水池です。また、メタゲノムとして知られている耕作に依存しない環境ゲノム、、​​アプローチは、価値の高い治療とバイオマスの変換プロセスのための経路の再構築と機能的スクリーニングに関してこの遺伝情報への前例のないアクセスをお約束します。しかし、土壌のmicrobiomeは、まだ大規模な挿入ライブラリの生産のための十分な品質の高分子量のDNAを得ることが困難が主な原因課題である。ここでは、土壌や堆積物から高分子、微生物群集のゲノムDNAを抽出するためのプロトコルを導入する。単離したゲノムDNAの品質は、下流のシーケンシングとスクリーニングのアプリケーションに挿入する大規模な環境ゲノムライブラリーを構築するために最適です。 手順は、細胞溶解から始まります。微生物の細胞壁と膜は機械的（研磨）と化学力（β-メルカプトエタノール）の両方によって溶解されています。ゲノムDNAを抽出用緩衝液、クロロホルム - イソアミルアルコールとイソプロピルアルコールを用いて単離されている。溶解および抽出工程に用いる緩衝液は、高分子量のゲノムDNAの完全性を維持するためにグアニジンイソチオシアネートと臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（CTAB）などがあります。ダウンストリームアプリケーションに応じて、単離されたゲノムDNAをさらに塩化セシウム（CsCl密度）フミン酸を含む不純物を減少させる勾配超遠心を用いて精製することができる。最初の手順で、抽出は、DNAの定量化のステップを除く、約8時間かかります。 CsCl密度勾配超遠心分離、二日間のプロセスです。全体の手順の実行中に、ゲノムDNAが剪断を防ぐために優しく扱われるべき、重大なボルテックス、および反復的な過酷なピペッティングを避ける。

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Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

土壌微生物群集から、高分子量、高品質のゲノムDNAを単離する方法論が説明されています。

土壌と堆積物から高分子量のゲノムDNAの抽出

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

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Research

JoVE Journal

Biology

25.6K ビュー.  University of British Columbia - UBC. 土壌微生物群集から、高分子量、高品質のゲノムDNAを単離する方法論が説明されています。

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Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

マウスの尾からのゲノムDNAの単離

生物学

DNA Extraction from 0.22 &mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

This method is used to extract high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;M Sterivex filters that have been treated with storage/lysis buffer and archived at -80&deg;C, and to purify this DNA using a cesium chloride density gradient.  The protocol begins with two one-hour incubation steps to liberate DNA from cells and remove RNA.  Next, a series of Phenol:Chloroform and Chloroform extractions are performed followed by centrifugation to remove proteins and cell membrane components, collection of the aqueous DNA extract, and several buffer exchange steps to wash and concentrate the extract.  Part Five describes the optional purification via cesium chloride density gradient.  It is recommended to work with less than 15 samples at one time to avoid confusion and cut down protocol time. The total time required for this protocol depends on the number of samples to be extracted. For 10-15 samples and assuming the proper centrifugation equipment is available, this entire protocol should take 3 days. Make sure you have the hybridization ovens set to temperature at the outset of the process.

We describe a method for extraction of high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;m Sterivex filters, followed by cesium chloride density gradient centrifugation for purification.

0.22μmのSterivexフィルタおよび塩化セシウム密度勾配遠心分離からのDNA抽出

This method is used to extract high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;M Sterivex filters that have been ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

RNAを含むオリゴヌクレオチドを​​使用して変換によるゲノムDNAのRNA / DNAハイブリッドの世代

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in their nucleotide composition and consist of a complex mosaic of sequence patterns. These patterns include so-called Mid-Range Inhomogeneity (MRI) regions -- sequences 30-10000 nucleotides in length that are enriched by a particular base or combination of bases (e.g. (G+T)-rich, purine-rich, etc.). MRI regions are associated with unusual (non-B-form) DNA structures that are often involved in regulation of gene expression, recombination, and other genetic processes (Fedorova &amp; Fedorov 2010). The existence of a strong fixation bias within MRI regions against mutations that tend to reduce their sequence inhomogeneity additionally supports the functionality and importance of these genomic sequences (Prakash et al. 2009).
Here we demonstrate a freely available Internet resource -- the Genomic MRI program package -- designed for computational analysis of genomic sequences in order to find and characterize various MRI patterns within them (Bechtel et al. 2008). This package also allows generation of randomized sequences with various properties and level of correspondence to the natural input DNA sequences. The main goal of this resource is to facilitate examination of vast regions of non-coding DNA that are still scarcely investigated and await thorough exploration and recognition.

We present a public computational web site for the analysis of genomic sequences. It detects DNA sequence patterns with various non-random nucleotide compositions. This resource also generates randomized sequences with diverse levels of complexity.

ゲノムMRI - ゲノムDNA内の配列パターンを研究するためのパブリックリソース

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

遺伝学的およびエピジェネティクス解析のためのパラフィン包埋材料からのDNA抽出

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

バーコード酵母ライブラリーの競争力のあるゲノム画面

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction of high-quality, high molecular weight (HMW) community DNA. However, environmental mat samples often pose difficulties to obtaining large concentrations of high-quality, HMW DNA. Hypersaline microbial mats contain high amounts of extracellular polymeric substances (EPS)1 and salts that may inhibit downstream applications of extracted DNA. Direct and harsh methods are often used in DNA extraction from refractory samples. These methods are typically used because the EPS in mats, an adhesive matrix, binds DNA2,3 during direct lysis. As a result of harsher extraction methods, DNA becomes fragmented into small sizes4,5,6.
The DNA thus becomes inappropriate for large-insert vector cloning. In order to circumvent these limitations, we report an improved methodology to extract HMW DNA of good quality and quantity from hypersaline microbial mats. We employed an indirect method involving the separation of microbial cells from the background mat matrix through blending and differential centrifugation. A combination of mechanical and chemical procedures was used to extract and purify DNA from the extracted microbial cells. Our protocol yields approximately 2 &mu;g of HMW DNA (35-50 kb) per gram of mat sample, with an A260/280 ratio of 1.6. Furthermore, amplification of 16S rRNA genes7 suggests that the protocol is able to minimize or eliminate any inhibitory effects of contaminants. Our results provide an appropriate methodology for the extraction of HMW DNA from microbial mats for functional metagenomic studies and may be applicable to other environmental samples from which DNA extraction is challenging.

We provide an improved protocol for extracting high molecular weight DNA from hypersaline microbial mats. Microbial cells are separated from the mat matrix prior to DNA extraction and purification. This enhances the concentrations, quality, and size of the DNA. The protocol may be used for other refractory samples.

バイオマットから高分子量DNAの抽出

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction  of high-quality, high molecular weight ...

A Practical and Novel Method to Extract Genomic DNA from Blood Collection Kits for Plasma Protein Preservation

Laboratory tests can be done on the cellular or fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes determines the portion of the blood that can be analyzed (whole blood, plasma or serum). Laboratories involved in studying the genetic basis of human disorders rely on anticoagulated whole blood collected in EDTA-containing vacutainer as the source of DNA for genetic / genomic analysis. Because most clinical laboratories perform biochemical, serologic and viral testing as a first step in phenotypic outcome investigation, anticoagulated blood is also collected in heparin-containing tube (plasma tube). Therefore when DNA and plasma are needed for simultaneous and parallel analyses of both genomic and proteomic data, it is customary to collect blood in both EDTA and heparin tubes. If blood could be collected in a single tube and serve as a source for both plasma and DNA, that method would be considered an advancement to existing methods. The use of the compacted blood after plasma extraction represents an alternative source for genomic DNA, thus minimizing the amount of blood samples processed and reducing the number of samples required from each patient. This would ultimately save time and resources.
The BD P100 blood collection system for plasma protein preservation were created as an improved method over previous plasma or serum collection tubes1, to stabilize the protein content of blood, enabling better protein biomarker discovery and proteomics experimentation from human blood. The BD P100 tubes contain 15.8 ml of spray-dried K2EDTA and a lyophilized proprietary broad spectrum cocktail of protease inhibitors to prevent coagulation and stabilize the plasma proteins. They also include a mechanical separator, which provides a physical barrier between plasma and cell pellets after centrifugation. Few methods have been devised to extract DNA from clotted blood samples collected in old plasma tubes2-4. Challenges from these methods were mainly associated with the type of separator inside the tubes (gel separator) and included difficulty in recovering the clotted blood, the inconvenience of fragmenting or dispersing the clot, and obstruction of the clot extraction by the separation gel.
We present the first method that extracts and purifies genomic DNA from blood drawn in the new BD P100 tubes. We compare the quality of the DNA sample from P100 tubes to that from EDTA tubes. Our approach is simple and efficient. It involves four major steps as follows: 1) the use of a plasma BD P100 (BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) tube with mechanical separator for blood collection, 2) the removal of the mechanical separator using a combination of sucrose and a sterile paperclip metallic hook, 3) the separation of the buffy coat layer containing the white cells and 4) the isolation of the genomic DNA from the buffy coat using a regular commercial DNA extraction kit or a similar standard protocol.

We are describing a new method of isolating genomic DNA from whole blood collected for plasma/serology. After plasma collection, the compacted blood is usually discarded. Our novel method represents a significant improvement over existing methods and makes DNA and plasma available from a single collection, without requesting additional blood.

血漿タンパク保存用採血キットからゲノムDNAを抽出するために実用的で新手法

Laboratory tests can be done on the cellular or  fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes  determines the portion of the ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

ゲノムDNAから5  - ヒドロキシの選択的捕獲

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

レトロウイルス統合サイトの増幅、次世代シーケンシング、およびゲノムDNAのマッピング

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...