우리는 산림 토양의 생산성의 지속적인 연구를 지원하기위한 혁신, 브리티시 컬럼비아 기술 개발 기금, 게놈 브리티시 컬럼비아과 숲의 브리티시 컬럼비아 교육부와 범위에 대한 캐나다 재단 감사드립니다. SL은 미생물 다양성과 발전을위한 기초 자금 툴라 센터에서 화목에 의해 지원되었다.

부품 I : DNA의 추출 절차 1. 8시간는 DNA의 양을 정함을 제외한 6 샘플 처리를 위해, 필요합니다. 당신이 추출을 시작하기 전에, 당신은 사전 진정 박격포, 유봉 및 -20 ° C의 냉동고에 주걱이나 액체 질소를 사용해야합니다. 또한, 얼음 20 ML 클로로포름 isoamyl 알콜 (24:1)를 포함하는 사전 진정 50 ML 튜브. 65 하이브 리다이 제이션 오븐을 설정 ° C 미리 열 수 있습니다. 그것 ° C 크리스탈을 녹일 60 따뜻한 크리스털 경우, CTAB 솔루션을 확인하십시오. 당신이 추출 (아래 제조법 참조)을 시작하기 직전 마지막으로 재료를 추가하여 denaturing 솔루션 및 추출 버퍼를 완료하십시오. 펌 후드의 모든 추출 절차를 실시합니다. 2. denaturing 버퍼와 추출 버퍼를 준비합니다. 참고 : DNA의 수율을 최대화하기 위해서는 정확하게 지침에 따라 버퍼를 만들기 위해 중요합니다. 3. 미리 차게 절구에 흙 2g를 놓습니다. 참고 : 현장에서 수집된 토양은 전송을 위해 드라이 아이스를 동결하고 -80 ° C.에 보관해야 해동 사전 DNA 추출에 2mm의 체 체를 사용하여 토양. 당신이 10 G.까지 토양의 시작 양을 증가시킬 수 4. 흙에 솔루션을 denaturing 1 ML을 추가합니다. 5. 고정과 토양 입자 가루와 동질적인 모양까지 유봉을 사용하여 두 액체 N에있는 흙을 분쇄. 동결 두 번 연삭를 반복합니다. 참고 : 동안 냉동 토양 샘플을 보관, 연삭 완전히 토양 샘플을 커버하기에 충분한 액체 질소를 사용합니다. 연삭 중에 약간 녹아이 허용됩니다. 6. 미리 차게 주걱을 사용하여 50 ML 원뿔 관에 지상 토양을 전송합니다. 참고 : 지상 토양 샘플은 -80 ° C이 시점에서, 필요한 경우에 저장될 수 있습니다. 7. 추출 버퍼 9 ML을 추가합니다. 솔루션 및 토양, 낮은 속도로 소용돌이를 간략하게 혼합합니다. 참고 : 버퍼가 균질되도록하려면 60을 따뜻한 ° C를 사용하기 전에 10~15분하십시오. 추출을 통해 60 ° C에서 버퍼의 나머지 부분을 유지. 속도 8 소용돌이 (10이 최대입니다 규모). 8. 하이브 리다이 제이션 오븐에 65 ° C 40 분 품어. 부화 기간 동안 지속적으로 가장 낮은 속도로 튜브를 회전하거나, 부드럽게 튜브를 매일 10 분 반전. 참고 : 버퍼가 큰 표면적을 통해 흙을 문의할 수 있도록 하이브 리다이 제이션 오븐에 수평으로 튜브를 삽입합니다. 이 솔루션은 부화하는 동안 약간의 점성을 보일 수 있습니다. 9. 14 ° C. - 10 10 분 1,800 X g에서 원심 분리기 20 ML 클로로포름 - isoamyl 알콜 (24:1)이있는 미리 차게 50 ML 원뿔 관에 뜨는 전송, 얼음 계속. 참고 : 뜨는 전송할 때, 유기 층 (바닥 층)을 방해하지 않도록주의합니다. 그것은 깨끗한 표면에 뜨는를 수집하기 위해 필요한 경우 뜨는 1-2 ML 둡니다. 당신은 자주 뜨는 위에 베이지색 레이어를 (두께 약 1-3밀리미터)을 볼 수 있습니다. 뜨는를 수집 때이 레이어를 방해하지 마십시오. 이 베이지색 레이어의 파손을 방지하기 위해 튜브 벽을 따라 팁을 슬라이드보십시오. 뜨는 너무 흐린 경우 뜨는에서 클로로포름 - isoamyl 알콜 추출 한 더 많은 시간을 반복하십시오. 클로로포름를 전송할 때 클로로포름가 플라스틱을 녹일하므로, 일회용 플라스틱 pipettes를 사용하지 마십시오. 유리 피펫을 사용하여, 또는 유리 실린더 졸업 또는 50 ML 원뿔 튜브에 직접 클로로포름을 따라줘. 10. 토양 알약에게 두 번 이상의 압축을 풉니다; 10.1. 토양 알약 5 ML 추출 버퍼를 추가 부드럽게 낮은 속도로 짧은 vortexing 다음 1 ML 팁을 사용하여 섞는다. 참고 : 흔들 어서 사용하기 전에 버퍼를 섞는다. 10.2. 65 ° C 하이브 리다이 제이션 오븐에서 10 분 알을 품다. 14 ° C. - 10 10 분 1,800 X g에서 원심 분리기 9 단계에서 튜브에 뜨는 전송합니다. 튜브 수집 뜨는 및 클로로포름 - isoamyl 알콜로 추출하는 동안 얼음 계속. 참고 : 교차는 샘플 사이에 혼합하지 않고 같은 튜브에 뜨는를 추가하십시오. 10.3. 9.1 및 9.2 한 번 더 반복합니다. 11. 회전 접시를 사용하여 매우 부드럽게 수집 뜨는 (14-19 ML) 10 분 1.25 RPM에서 클로로포름 - isoamyl 알콜이 들어있는 튜브를 바위. 참고 : 누출을 방지하기 위해 매우 단단히 뚜껑을 닫습니다. 어떤 누출이 쉽게 감지 수 있도록 당신이 튜브를 삽입하기 전에 흔들어 대 접시에 종이 타월을 놓는다. 12. 14 ° C. - 10 20 분 1,800 X g에서 원심 분리기 13. 새로운 튜브에 수성 단계를 전송합니다. 참고 사항 : 수성 단계 (위 계층)과 유기 계층 (하단 사이의 계면을 방해하지 마십시오층)은 표면에 뜨는를 전송할 때. 오직 깨끗한 뜨는 수집을 보장하기 위해 약 1.5-2 ML이 뜨는 둡니다. 14. 이소 프로필 알코올 (- 21.a 15.a 단계)를 사용하여 DNA를 복구합니다. 또는 Amicon를 사용하여 ® 울트라 - 15 원심 필터 장치 (단계 15.b - 21.b)는 복구하기가 어렵습니다 이소 프로필 알코올 석출에 의해 거의 볼 수 펠렛을 생산합니다 샘플에서 바이오 매스의 매우 낮은 금액을 기대하는 경우. 15.a. 새로운 관 초원 심 분리기에 뜨는를 놓습니다. 16.a. 0.6:1의 음량 비율에서 수집한 뜨는에 이소 프로필 알코올을 추가합니다. 튜브 반전 부드럽게 몇 번 혼합합니다. 실온에서 30 분 17.a의 알을 품다. 18.a. 25 ° C. - 20 20 분 16,000 X g에서 원심 분리기 모든 튜브의 가중치는 원심 분리 단계 전에 잘 균형을 수 있도록. 참고 : 튜브에 원심력의 방향을 표시하므로 DNA 수율이 낮은 때보다 쉽게​​ DNA 펠렛를 검색할 수 있습니다. 19.a. decanting 또는 진공 suctioning에 의해 이소 프로필 알코올을 제거합니다. DNA 펠렛을 방해하지 않도록주의하십시오. 참고 사항 : 즉시 원심 분리가 완료되면 이소 프로필 알코올을 제거합니다. DNA 펠렛을 잃지 않도록 매우주의하십시오. DNA 펠렛의 크기는 거의 공개 (~ 9mm 지름) 명확하게 표시에서, 토양 유형에 따라 크게 달라질 수 있습니다. 그것은 DNA 펠릿 밖으로 흡입에주의 때문에 튜브의 벽을 따라하는 것도 suctioning에 의해 이소 프로필 알코올의 찌꺼기를 제거하는 것이 좋습니다. 20.a. 5 상온에서 건조 DNA 펠릿 - 20 분. 참고 : 건조 DNA 펠렛 이상하지 마십시오, 그렇지 않으면 그것은 DNA를 redissolve하기 어려울 것입니다. 21.a. 200 μl TE에서 DNA 펠렛을 Resuspend. 부드러운 감청하여 섞는다. 1.5 ML 튜브에 DNA 솔루션을 전송합니다. 4 튜브를 유지 ° C 완벽한 DNA를 해산하기 위해 하룻밤. 참고 : 펠렛의 크기에 따라 추가 TE의 볼륨을 조정할 수 있습니다. 보통 200 - TE 400 μl 잘 작동합니다. * 또는 단계를 수행하십시오 15.b - 21.b. 15.b. Amicon ® 울트라 - 15 원심 필터 장치를 미리 씻고, 10 분 동안 3,500 X g에서 장치와 원심 분리기 15 ML TE를 추가합니다. 흐름 -을 통해 폐기하십시오. 16.b. 단계 13에서 미리 씻어 Amicon 필터로 DNA 솔루션을 놓습니다. DNA의 볼륨이 200 감소까지 3,500 X g에서 원심 분리기 - 500 μl합니다. 흐름 -을 통해 폐기하십시오. 17.b. 두 TE와 DNA를 세척하고, Amicon 필터 장치 10 ML TE를 추가합니다. DNA의 볼륨이 약 200 μl로 감소까지 3,500 X g에서 원심 분리기. 흐름 -을 통해 폐기하십시오. 한 번만 더 반복합니다. 18.b. 새로운 1.5 ML 튜브에 필터의 DNA 솔루션을 전송합니다. 19.b. Amicon 필터 40 μl TE를 추가합니다. 필터에있는 DNA 성분을 회수하기 위해 최대 pipetting 아래로 필터 세포막의 두 측면을 씻으십시오. 단계 18.b.에서 관이 세척 솔루션 추가 20.b. 필요한 경우, DNA가 Microcon ® Ultracel YM - 30 원심 필터 단위로 더욱 집중 할 수 있으며, 7분에 대한 10,000 X g에서 200 μl TE 및 centrifuging을 추가하여 필터를 미리 씻는다. 1 분 5000 X g에서 필터와 원심 분리기에 DNA 솔루션을 추가합니다. 필터에 DNA 솔루션의 금액은 약 50 μl로 감소 때까지 원심 분리를 반복합니다. 참고 : Microcon 필터에 대한 최대 초기 샘플 볼륨 500 μl입니다. 14,000 X G. 이상의 속도로 원심 분리기하지 마십시오 완전히 막 증발까지 원심 분리기를 통해하지 마십시오. 어떤 액체가 계속 원심 분리 후 필터를 다루고 있는지 확인하십시오. 당신은 이상 centrifuged 및 멤브레인가 건조되면 15 μl TE를 추가 30 초 동안 부드럽게 선동하고, 21.b. 단계로 진행 21.b. DNA를 복구 3 분 XG 1000에서 새 Microcon 튜브와 원심 분리기에 거꾸로 필터 장치를 놓습니다. 22. 태 젤로 DNA (0.8 %, 0.5xTAE 4 시간 50 V)를 계량하고, Nanodrop 분광 광도계 또는 피코 - 녹색 분석 및 플레이트 판독기에 의해. 참고 : DNA 금액이 젤에 알려진 농도 (고분자 DNA 마커 또는 λHindIII)와 마커 밴드에 대한 샘플 밴드를 비교하여 추정 수 있습니다. 23. (자세한 내용은 단계 II를 참조하십시오에서 파트 1 %, 1xTAE 젤과 함께 펄스 필드 겔 전기 영동 (PFGE)를 사용하여 높은 분자량의 DNA의 무결성 확인 <a href="https://www.jove.com/index/details.stp?id=1387">https://www.jove.com/index/details.stp?id을 = 1387</a> , 도이 : Taupp 외 의해 10.3791/1387 2009).. 참고 : 대신 낮은 용해 아가로 오스의 QC 목적을 위해 정기적으로 아가로 오스 젤을 사용할 수 있습니다. 다음과 같이 간단히, 전기 영동 조건은 다음과 같습니다 2-250킬로바이트, 6 볼트, 초기 전환 시간 : 5 초, 최종 전환 시간 : 15 초, 14에서 12 시간 동안 실행 ° C. SYBR 골드가 젤에서 DNA를 시각화 한 시간 염색법. 24. 추출된 DNA의 분자 가중치를 만족하는 경우, 다음 CsCl 기울기 원심 분리기 단계로 진행합니다. 또는 DNA는 -20 ° C 또는 -80에 저장할 수 있습니다 ° C CsCl 원심 전에. 당신은 큰 삽입 metagenomic의 DNA 라이브러리를 구축하려는 경우 DNA의 평균 크기는 동일 또는 36 KB을 초과해야합니다. 부 II. 세슘 염화물 기울기 ultracentrifugation을 사용하여 DNA의 정화 원심 분리기의 준비 : 1.5 - 이시간 원심 분리 단계 : 18시간 ethidium 브로마이드 (EtBr)를 제거하고 원심 분리 후 DNA 집중 : 3 시간 절차 자세한 내용은 라이트 외를 참조하십시오. . 2009 <a href="https://www.jove.com/index/details.stp?id=1352">https://www.jove.com/index/details.stp?id=1352</a> , 도이 : 10.3791/1352 대표 결과 / 결과 이 숲 토양 유기의 g (O 수평선)과 미네랄 호라이즌 (AE, AB, 그리고 BT 호라이즌) (장기 토양 생산성 (LTSP) Skulow 호수, BC, 캐나다에있는 사이트에서 샘플에서 격리 게놈 DNA의 총액 과) 숲 범위 BC 교육부에서 관리하는 10 밀리그램에서 180 밀리그램였다. 60킬로바이트 (그림 1) - 절연 DNA의 평균 크기는 40 사이에 일반적으로되었다. 260 nm/280 NM에서 흡광도의 비율은 1.3-1.6 사이 종종 토양 샘플에서 관찰 humic 산성 오염을 나타낼 수 있습니다 230 NM에서 최고가있었습니다. CsCl 기울기 원심 분리가 대폭이 오염을 감소하며 1.8 280분의 260의 비율을 증가 - 1.9을 그림 2A와 2B와 같이. <img src="/files/ftp_upload/1569/1569fig1.jpg" alt="그림 1" /> CsCl ultracentrifugation 전에 추출한 게놈의 DNA의 그림 1. PFGE 사진. lane1 : 1킬로바이트 마커 100 NG, 레인 2 : λHind III 마커 100 NG, 레인 3 : λHind III 마커 250 NG, 레인 4 : λHind III 마커 500 NG, lane5 : Fosmid 36킬로바이트 마커 100 NG, 레인 6과 7 : 게놈 미네랄 토양 수평선 애, 레인 8 9 절연 DNA : Skulow 호수, BC에 위치한 LTSP 사이트의 광물 토양 호라이즌 AB으로부터 격리 게놈 DNA <img src="/files/ftp_upload/1569/1569fig2tmb.jpg" alt="그림 2" border="0" /> 게놈 DNA의 그림 2. Chromograms 전에 분광 광도계에 의해 감지 (A) 및 CsCl ultracentrifugation의 (B) 후. 게놈 DNA의 품질 향상을 나타냅니다 CsCl의 ultracentrifugation, 후 230 nm의 파장에서 흡광도 값의 감소에 유의하십시오. 하시기 바랍니다 <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/1569/1569fig2.jpg">여기를 클릭</a> 그림 2의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

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	<li>Hurt, R. A., Qiu, X., Wu, L., Roh, Y., Palumbo, A. V., Tiedje, J. M., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+recovery+of+RNA+and+DNA+from+soils+and+sediments.">Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments.</a> AEM. 67 (10), 4495-4503 (2001).</li><li>Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+extraction+from+0.22+&#956;M+Sterivex+filters+and+cesium+chloride+density+gradient+centrifugation.">DNA extraction from 0.22 &#956;M Sterivex filters and cesium chloride density gradient centrifugation.</a> JoVE. , (2009).</li><li>Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+insert+environmental+genomic+library+production.">Large insert environmental genomic library production.</a> J Vis Exp. , (2009).</li></ol>

조리법 * 솔루션을 Denaturing 4 M 구아니딘의 isothiocyanate 10 MM 트리스 - HCL (산도 7.0) 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 0.5 % 2 - 메르 캅 토 에탄올 <table border="0" style="font-size:9pt; width:400px;"><tr><td colspan="2"> Denaturing 솔루션 : 총 10 ML </td></tr><tr><td> 구아니딘의 isothiocyanate (MW 118.16) </td><td> 4.73 g </td></tr><tr><td> 1M 트리스 - HCL (산도 7.0) </td><td> 100 μl </td></tr><tr><td> 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 20 μl </td></tr><tr><td colspan="2"> 총 9.95 ML 물을 추가합니다. </td></tr><tr><td colspan="2"> 압력솥. </td></tr><tr><td colspan="2"> 바로 사용하기 전에 50 μl 2 - 메르 캅 토 에탄올을 추가합니다. (1 ML Denaturing 솔루션 당 2 - 메르 캅 토 에탄올 5 μl) 참고 : 4 Denaturing 솔루션을 유지 ° C. 일주 이상의 버퍼가 이상 사용하지 마십시오. 가능하면 신선한 버퍼 사용합니다. </td></tr></table> ** 추출 버퍼 100 MM 나트륨 인산염 버퍼 [산도 7.0] 100 MM 트리스 - HCL [산도 7.0] 100 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) [산도 8.0] 1.5 M NaCl 1 % Hexadecyltrimethylammonium의 브로마이드 (CTAB) 2퍼센트 SDS <table border="0" style="font-size:9pt; width:400px;"><tr><td colspan="2"> 총 1 L에 대한 추출 버퍼 </td></tr><tr><td> 1M 나트륨 인산염 버퍼 [산도 7.0] * </td><td> 100 ML </td></tr><tr><td> 1M 트리스 - HCL [산도 7.0] </td><td> 100 ML </td></tr><tr><td> 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) [산도 8.0] </td><td> 200 ML </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> 300 ML </td></tr><tr><td colspan="2"> 압력솥과 실온에서 보관. </td></tr><tr><td colspan="2"> 200ml, 5 % Hexadecyltrimethylammonium의 브로마이드 (CTAB, autoclaved) 100 ML, 20 % SDS (autoclaved) 바로 사용하기 전에를 추가합니다. CTAB가 크리스털 경우, 60을 용융 ° C. * 1M 인산 나트륨 완충액 : 57.7 ML, 1M 인산 나트륨 일염기의 (아니 2 PO 4) 42.3 ML, 1M 인산 나트륨 이염 (아니 2 PO 4). 7.0 산도를 조정 참고 :이 석출이있다면 20% SDS를 사용하지 마십시오. 당신이 솔루션에 SDS를 추가할 때 밀키 정학을 볼 정상입니다. 일단, SDS를 추가 60 추출 버퍼를 배치 ° C는 SDS가 잘 일시 중지되도록합니다. </td></tr></table>

extraction of high molecular weight genomic dna from soils and sediments

토양 microbiome이 속속들이 지상파 생태계 내에서 영양과 에너지 흐름과 관련된 게놈 다양성과 신진 대사 혁신의 광대한 상대적으로 미개척 저수지입니다. 또한 metagenomic로 알려진 육성 독립 환경 게놈, 접근 방식은 높은 가치 치료 및 바이오 매스 변환 프로세스에 대한 경로 재건 및 기능 검사와 관련이 유전 정보에 대한 전례없는 접근을 약속드립니다. 그러나, 토양 microbiome은 여전히​​ 큰 삽입 라이브러리 생산을위한 충분한 품질의 높은 분자량의 DNA를 얻는의 어려움으로 인해 크게 도전 남아있다. 여기 우리는 토양과 퇴적물에서 높은 분자량, 미생물 지역 사회 게놈 DNA를 추출하기위한 프로토콜을 소개합니다. 절연 게놈의 DNA의 품질은 하류 시퀀싱 및 심사 애플 리케이션을위한 대형 삽입 환경 게놈 라이브러리를 구축에 이상적입니다. 절차는 세포 용해와 함께 시작합니다. 세포 벽 및 미생물의 세포막은 두 기계 (연삭)와 화학 세력 (β - 메르 캅 토 에탄올)에 의해 lysed 있습니다. 게놈 DNA는 다음 추출 버퍼, 클로로포름 - isoamyl 알콜과 이소 프로필 알코올을 사용하여 격리됩니다. 용해와 추출 단계에 대한 고용 버퍼는 구아니딘의 isothiocyanate 및 높은 분자량의 게놈의 DNA의 무결성을 유지 hexadecyltrimethylammonium의 브로마이드 (CTAB)를 포함합니다. 귀하의 다운 스트림 응용 프로그램에 따라 분리된 게놈의 DNA가 더 세슘 염화물 (CsCl) humic 지방산을 포함하여 불순물을 감소 기울기 ultracentrifugation을 사용하여 정화 수 있습니다. 첫 번째 절차, 추출, DNA의 양을 정함 단계 제외한 약 8 시간 정도 소요됩니다. CsCl ultracentrifugation 기울기는 이틀 과정입니다. 전체 절차를 수행하는 동안, 게놈 DNA는 전단을 방지하기 위해 부드럽게 다루어야하는, 심각한 vortexing을 방지하고, 거칠 반복적인 pipetting.

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Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

토양 미생물 커뮤니티의 높은 분자량과 높은 품질의 게놈 DNA를 분리하는 방법이 설명되어 있습니다.

소일스 및 세디먼츠에서 높은 분자량의 게놈의 DNA의 추출

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

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Research

JoVE Journal

Biology

25.5K 조회수.  University of British Columbia - UBC. 토양 미생물 커뮤니티의 높은 분자량과 높은 품질의 게놈 DNA를 분리하는 방법이 설명되어 있습니다.

비디오: Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

마우스 뒷면에서 게놈 DNA의 분리

연구

생물학

DNA Extraction from 0.22 &mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

This method is used to extract high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;M Sterivex filters that have been treated with storage/lysis buffer and archived at -80&deg;C, and to purify this DNA using a cesium chloride density gradient.  The protocol begins with two one-hour incubation steps to liberate DNA from cells and remove RNA.  Next, a series of Phenol:Chloroform and Chloroform extractions are performed followed by centrifugation to remove proteins and cell membrane components, collection of the aqueous DNA extract, and several buffer exchange steps to wash and concentrate the extract.  Part Five describes the optional purification via cesium chloride density gradient.  It is recommended to work with less than 15 samples at one time to avoid confusion and cut down protocol time. The total time required for this protocol depends on the number of samples to be extracted. For 10-15 samples and assuming the proper centrifugation equipment is available, this entire protocol should take 3 days. Make sure you have the hybridization ovens set to temperature at the outset of the process.

DNA Extraction from 0.22 &amp;mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

We describe a method for extraction of high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;m Sterivex filters, followed by cesium chloride density gradient centrifugation for purification.

0.22 μm의 Sterivex 필터 및 세슘 클로라이드 밀​​도 기울기 원심 분리 장치에서 DNA 추출

This method is used to extract high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;M Sterivex filters that have been ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in their nucleotide composition and consist of a complex mosaic of sequence patterns. These patterns include so-called Mid-Range Inhomogeneity (MRI) regions -- sequences 30-10000 nucleotides in length that are enriched by a particular base or combination of bases (e.g. (G+T)-rich, purine-rich, etc.). MRI regions are associated with unusual (non-B-form) DNA structures that are often involved in regulation of gene expression, recombination, and other genetic processes (Fedorova &amp; Fedorov 2010). The existence of a strong fixation bias within MRI regions against mutations that tend to reduce their sequence inhomogeneity additionally supports the functionality and importance of these genomic sequences (Prakash et al. 2009).
Here we demonstrate a freely available Internet resource -- the Genomic MRI program package -- designed for computational analysis of genomic sequences in order to find and characterize various MRI patterns within them (Bechtel et al. 2008). This package also allows generation of randomized sequences with various properties and level of correspondence to the natural input DNA sequences. The main goal of this resource is to facilitate examination of vast regions of non-coding DNA that are still scarcely investigated and await thorough exploration and recognition.

We present a public computational web site for the analysis of genomic sequences. It detects DNA sequence patterns with various non-random nucleotide compositions. This resource also generates randomized sequences with diverse levels of complexity.

게놈 MRI - 게놈 DNA 시퀀스 내의 패턴을 학습에 대한 공개 자료

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

유전과 Epigenetic 분석을위한 파라핀 임베디드 재료에서 DNA 추출

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction of high-quality, high molecular weight (HMW) community DNA. However, environmental mat samples often pose difficulties to obtaining large concentrations of high-quality, HMW DNA. Hypersaline microbial mats contain high amounts of extracellular polymeric substances (EPS)1 and salts that may inhibit downstream applications of extracted DNA. Direct and harsh methods are often used in DNA extraction from refractory samples. These methods are typically used because the EPS in mats, an adhesive matrix, binds DNA2,3 during direct lysis. As a result of harsher extraction methods, DNA becomes fragmented into small sizes4,5,6.
The DNA thus becomes inappropriate for large-insert vector cloning. In order to circumvent these limitations, we report an improved methodology to extract HMW DNA of good quality and quantity from hypersaline microbial mats. We employed an indirect method involving the separation of microbial cells from the background mat matrix through blending and differential centrifugation. A combination of mechanical and chemical procedures was used to extract and purify DNA from the extracted microbial cells. Our protocol yields approximately 2 &mu;g of HMW DNA (35-50 kb) per gram of mat sample, with an A260/280 ratio of 1.6. Furthermore, amplification of 16S rRNA genes7 suggests that the protocol is able to minimize or eliminate any inhibitory effects of contaminants. Our results provide an appropriate methodology for the extraction of HMW DNA from microbial mats for functional metagenomic studies and may be applicable to other environmental samples from which DNA extraction is challenging.

We provide an improved protocol for extracting high molecular weight DNA from hypersaline microbial mats. Microbial cells are separated from the mat matrix prior to DNA extraction and purification. This enhances the concentrations, quality, and size of the DNA. The protocol may be used for other refractory samples.

미생물 매트에서 높은 분자량의 DNA의 추출

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction  of high-quality, high molecular weight ...

A Practical and Novel Method to Extract Genomic DNA from Blood Collection Kits for Plasma Protein Preservation

Laboratory tests can be done on the cellular or fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes determines the portion of the blood that can be analyzed (whole blood, plasma or serum). Laboratories involved in studying the genetic basis of human disorders rely on anticoagulated whole blood collected in EDTA-containing vacutainer as the source of DNA for genetic / genomic analysis. Because most clinical laboratories perform biochemical, serologic and viral testing as a first step in phenotypic outcome investigation, anticoagulated blood is also collected in heparin-containing tube (plasma tube). Therefore when DNA and plasma are needed for simultaneous and parallel analyses of both genomic and proteomic data, it is customary to collect blood in both EDTA and heparin tubes. If blood could be collected in a single tube and serve as a source for both plasma and DNA, that method would be considered an advancement to existing methods. The use of the compacted blood after plasma extraction represents an alternative source for genomic DNA, thus minimizing the amount of blood samples processed and reducing the number of samples required from each patient. This would ultimately save time and resources.
The BD P100 blood collection system for plasma protein preservation were created as an improved method over previous plasma or serum collection tubes1, to stabilize the protein content of blood, enabling better protein biomarker discovery and proteomics experimentation from human blood. The BD P100 tubes contain 15.8 ml of spray-dried K2EDTA and a lyophilized proprietary broad spectrum cocktail of protease inhibitors to prevent coagulation and stabilize the plasma proteins. They also include a mechanical separator, which provides a physical barrier between plasma and cell pellets after centrifugation. Few methods have been devised to extract DNA from clotted blood samples collected in old plasma tubes2-4. Challenges from these methods were mainly associated with the type of separator inside the tubes (gel separator) and included difficulty in recovering the clotted blood, the inconvenience of fragmenting or dispersing the clot, and obstruction of the clot extraction by the separation gel.
We present the first method that extracts and purifies genomic DNA from blood drawn in the new BD P100 tubes. We compare the quality of the DNA sample from P100 tubes to that from EDTA tubes. Our approach is simple and efficient. It involves four major steps as follows: 1) the use of a plasma BD P100 (BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) tube with mechanical separator for blood collection, 2) the removal of the mechanical separator using a combination of sucrose and a sterile paperclip metallic hook, 3) the separation of the buffy coat layer containing the white cells and 4) the isolation of the genomic DNA from the buffy coat using a regular commercial DNA extraction kit or a similar standard protocol.

We are describing a new method of isolating genomic DNA from whole blood collected for plasma/serology. After plasma collection, the compacted blood is usually discarded. Our novel method represents a significant improvement over existing methods and makes DNA and plasma available from a single collection, without requesting additional blood.

플라즈마 단백질 보존을위한 혈액 수집 장비로부터 게놈 DNA를 추출하는 실제적이고 새로운 방법

Laboratory tests can be done on the cellular or  fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes  determines the portion of the ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

게놈 DNA에서 도보로 5 hydroxymethylcytosine의 선택적 캡처

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

레트로 바이러스 통합 사이트의 증폭, 차세대 시퀀싱 및 게놈 DNA 매핑

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Mucin Agarose Gel Electrophoresis: Western Blotting for High-molecular-weight Glycoproteins

Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against invading pathogens. The main role of these macromolecules is to facilitate particle trapping and clearance while promoting lubrication of the mucosa. During protein synthesis, mucins undergo intense O-glycosylation and multimerization, which dramatically increase the mass and size of these molecules. These post-translational modifications are critical for the viscoelastic properties of mucus. As a result of the complex biochemical and biophysical nature of these molecules, working with mucins provides many challenges that cannot be overcome by conventional protein analysis methods. For instance, their high-molecular-weight prevents electrophoretic migration via regular polyacrylamide gels and their sticky nature causes adhesion to experimental tubing. However, investigating the role of mucins in health (e.g., maintaining mucosal integrity) and disease (e.g., hyperconcentration, mucostasis, cancer) has recently gained interest and mucins are being investigated as a therapeutic target. A better understanding of the production and function of mucin macromolecules may lead to novel pharmaceutical approaches, e.g., inhibitors of mucin granule exocytosis and/or mucolytic agents. Therefore, consistent and reliable protocols to investigate mucin biology are critical for scientific advancement. Here, we describe conventional methods to separate mucin macromolecules by electrophoresis using an agarose gel, transfer protein into nitrocellulose membrane, and detect signal with mucin-specific antibodies as well as infrared fluorescent gel reader. These techniques are widely applicable to determine mucin quantitation, multimerization and to test the effects of pharmacological compounds on mucins.

Mucins are high-molecular-weight glycoconjugates, with size ranging from 0.2 to 200 megadalton (MDa). As a result of their size, mucins do not penetrate conventional polyacrylamide gels and require larger pores for separation. We provide a detailed protocol for mucin agarose gel electrophoresis to assess relative quantification and study polymer assembly.

점액 아가로 오스 겔 전기 영동 : 높은 분자량 당 단백질에 대한 웨스턴 블로 팅


Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against ...

Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, host characteristics, and broader ecosystem functions. With this rapid increase in breadth and depth of sequencing capabilities have come methods to extract, amplify, analyze, and interpret environmental DNA successfully with maximum efficiency. Unfortunately, performing DNA extractions quickly can come at the cost of increasing the risk of contamination among samples. In particular, high-throughput extractions that are based on samples contained in a 96-well plate offer a relatively quick method, compared to single-tube extractions, but also increase opportunities for well-to-well cross-contamination. To minimize the risk of cross-contamination among samples, while retaining the benefits of high-throughput extraction techniques, we developed a new method for loading environmental samples into 96-well plates. We used pierceable PCR sealing films to cover each plate while loading samples and added samples first to PCR tubes before moving them into wells; together, these practices reduce the risk of sample drift and unintended double loading of wells. The method outlined in this paper provides researchers with an approach to maximize available high-throughput extraction techniques while reducing the risk of cross-contamination inherent to 96-well plates. We provide a detailed step by step outline of how to move from sample collection to DNA extraction while minimizing the risk of unwanted cross-contamination.

Current methods for loading 96-well plates for DNA extractions can be prone to contamination. We detail a new method for loading 96-well plates that reduces risk of cross-contamination among wells. Our method will help other researchers capitalize on the efficiency of high-throughput DNA extraction techniques and minimize risk of contamination.

고처리량 DNA 추출 플레이트의 로딩을 위한 수정된 방법은 오염 가능성을 감소시니다.

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, ...