我々は、議論や助言のためにトロント大学のロンデイビス、アダムDeutschbauer、および全体のHIP HOPの研究室に感謝します。 CNは、米国立ヒトゲノム研究所（助成番号HG000205）、RO1 HG003317、CIHR MOP - 84305、およびカナダの癌協会（＃020380）からの補助金によってサポートされています。 JOは、スタンフォードゲノムのトレーニングプログラム（米国立ヒトゲノム研究所から助成番号T32 HG00044）と国立衛生研究所（助成番号P01 GH000205）によってサポートされていました。 GGは、博士へのイノベーションのためのカナダの財団からの助成金によって部分的にサポートされているNHGRI RO1 HG003317とカナダの癌協会、グラント＃020380、TDとドネリーシーケンシングセンターによってサポートされています。ブレンダアンドリュースとジャックグリーンブラット。 AMSは、トロントオープンフェローシップの大学によってサポートされています。

<ol>
	<li>Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+profiling+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome.">Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 418, 387-391 (2002).</li><li>Baba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+the+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Molecular systems biology. 2, 2006.0008-2006.0008 (2006).</li><li>Claus, H., Frosch, M., Vogel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+hotspot+for+transformation+of+Neisseria+meningitidis+by+shuttle+mutagenesis+using+signature-tagged+transposons.">Identification of a hotspot for transformation of Neisseria meningitidis by shuttle mutagenesis using signature-tagged transposons.</a> Mol Gen Genet. 259, 363-371 (1998).</li><li>Hava, D. 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利害の衝突は宣言されません。

ここでは、簡単にタグ付けされた変異体のコレクションを作成するためにさまざまな微生物のバーコード変異体コレクションの既存のコレクションの広い範囲に適合させることができる、ささやかな変更で、プロトコルを概説。我々は病原性酵母C.のタグトランスポゾン突然変異誘発のプロトコルを報告している間、我々はそれを強調するアルビカンス 、非常によく似たプロトコルは、単細胞の菌類の多様なに適応することができます。変更された、このプロトコルは、細菌13には適切に動作し、現在追加の真菌や細菌ゲノムの数のコレクションが建設中です。現時点では、このアッセイは、遺伝子-小分子の相互作用のための唯一の包括的な、ゲノムワイドな画面を提供します。アッセイの一つ、特に魅力的な機能は、遺伝子や低分子化合物の事前知識を必要としないことです。これらのアッセイの範囲とパワーにもかかわらず、他のラボへの譲渡は、結果の分析のための初期設備投資と情報ツールによって幾分妨げられてきた。分析のための堅牢なツールと組み合わせて次世代シーケンスの読み出しの採用により、我々は彼らの採用が増加すると予想。

<table border="1"><tbody><tr><td> 抗生物質 </td><td> ベンダーとカタログ番号 </td></tr><tr><td>カルベニシリン</td><td>シグマ、一部＃C1613 </td></tr><tr><td>カナマイシン</td><td>シグマ、一部＃K1876 </td></tr><tr><td>スペクチノマイシン</td><td>シグマ、一部＃S0692 </td></tr><tr><td>クロラムフェニコール</td><td>シグマ、一部＃C0378 </td></tr><tr><td> DNAクリーンアップと濃縮キット </td><td></td></tr><tr><td> QIAprep Spin Miniprepキット</td><td>キアゲン、一部＃27106 </td></tr><tr><td>ハイスピー​​ドプラスミドマキシキット</td><td>キアゲン、一部＃12663 </td></tr><tr><td> QIAクイックPCR精製キット</td><td>キアゲン、一部＃28106 </td></tr><tr><td> QIAquickゲル抽出キット</td><td>キアゲン、一部＃28704 </td></tr><tr><td> PCRと電気泳動試薬 </td><td></td></tr><tr><td> Taq DNAポリメラーゼ（MG -フリー）バッファ</td><td>ニューイングランドバイオラボ、一部＃M0320L </td></tr><tr><td>デオキシヌクレオチド溶液のミックス</td><td>ニューイングランドバイオラボ、一部＃N0447L </td></tr><tr><td> 25 mMのMgCl 2の </td><td>シグマ、一部＃63036 </td></tr><tr><td>アガロース、ローディング色素、および核酸は、ゲル電気泳動に適した染色</td><td>様々な</td></tr><tr><td> 10X TAEバッファー</td><td>シグマ、一部＃T8280 </td></tr><tr><td> 1 KBプラスDNAラダー</td><td>インビトロジェン、一部＃10787026 </td></tr><tr><td> YPD培養液 </td><td></td></tr><tr><td>酵母エキス10 gの</td><td>シグマ、一部＃Y1625 </td></tr><tr><td> 20グラムバクトペプトン</td><td> BDバイオサイエンス、一部＃211677 </td></tr><tr><td>デキストロース20gの</td><td>シグマ、一部＃D9434 </td></tr><tr><td> 実験機器 </td><td></td></tr><tr><td>マルチチャンネルピペット（1000、200、および20μL） </td><td>様々な</td></tr><tr><td>使い捨てピペット貯水池</td><td>様々な</td></tr><tr><td> 15〜50 mLの遠心管</td><td>様々な</td></tr><tr><td> 96 - と384ウェルディープウェルプレート</td><td> Axygen科学、一部＃P - 2ML - SQ - CS＆P - 384240SQCS </td></tr><tr><td> 96ウェルおよび384ウェルPCRプレートとシールのフィルム</td><td>様々な</td></tr><tr><td>マルチウェルプレートをシールするためのプレートのローラー</td><td>シグマ、一部＃R1275 </td></tr><tr><td> 30℃と37℃のプレート上に細菌や酵母の成長のために、チューブのインキュベーターを揺すって</td><td>様々な</td></tr><tr><td> in vitroでトランスポゾン変異誘発の </td><td></td></tr><tr><td> EZ - Tn5が知られトランスポザーゼ</td><td>シャーロットのバイオテクノロジー、一部＃TNP92110 </td></tr><tr><td> ハイスループット変換 </td><td></td></tr><tr><td> Seqprep 96 HTプラスミドプレップキット</td><td>エッジバイオシステムズ、一部＃84359 </td></tr><tr><td>ポリエチレングリコール、分子量3350 </td><td>様々な</td></tr><tr><td>リチウム酢酸</td><td>シグマ、一部＃517992 </td></tr><tr><td> 6ウェルプレート、滅菌</td><td>コー​​ニング、一部＃3335 </td></tr><tr><td> 50 mg / mLのウリジン</td><td>シグマ、一部＃U3750 </td></tr><tr><td> 100Xトリス- EDTA緩衝液</td><td>シグマ、一部＃T9285 </td></tr><tr><td> 1X TE/0.1M LiOAc </td><td>様々な</td></tr><tr><td>サケ精巣DNA </td><td>シグマ、一部＃1626 </td></tr><tr><td> バーコードのコレクションの成長 </td><td></td></tr><tr><td> 48ウェルプレート、プレート中で培養を成長した場合</td><td>グレイナー、一部＃M9437 </td></tr><tr><td>粘着板のシール</td><td> ABgene、一部＃AB - 0580 </td></tr><tr><td> 200mLの培養フラスコ</td><td>様々な</td></tr><tr><td>吸光度が可能な分光光度計</td><td>様々な</td></tr><tr><td> 250mlのフラスコや揺れ分光光度計用の温度制御シェーカー</td><td>様々な</td></tr><tr><td>セイフ - ロック微量遠心チューブに、2 mLの</td><td>エッペンドルフ、一部＃0030 120.094 </td></tr><tr><td> ハイブリダイゼーション装置 </td><td></td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーションオーブン640 </td><td>アフィメトリクス、一部＃800138 </td></tr><tr><td>搭載されたGeneChip流体駅450 </td><td>アフィメトリクス、部分＃00から0079 </td></tr><tr><td> GeneArrayスキャナ3000 </td><td>アフィメトリクス、部分＃00から0212 </td></tr><tr><td>フローティングラックと沸騰水浴</td><td>様々な</td></tr><tr><td> ハイブリダイゼーションの消耗品 </td><td></td></tr><tr><td> Genflexタグ16K配列v2の</td><td> Affymetrix、一部＃511331 </td></tr><tr><td>デンハルト溶液、50倍濃縮</td><td>シグマ、一部＃D2532 </td></tr><tr><td>ストレプトアビジン、R -フィコエリスリン共役（SAPE） </td><td>インビトロジェン、一部＃S866 </td></tr><tr><td>セイフ - ロックマイクロ遠心チューブ、0.5 mLの</td><td>エッペンドルフ、一部＃0030 123.301 </td></tr><tr><td>小さなタフスポット</td><td>多様なバイオテック、一部＃LTTM - 1000 </td></tr><tr><td> 0.5 M EDTA </td><td>バイオラッド、一部＃161-0729 </td></tr><tr><td> 10％のTween </td><td>シグマ、一部＃T2700 </td></tr><tr><td> MES遊離酸一水和物</td><td>シグマ、一部＃M5287 </td></tr><tr><td> MESのナトリウム塩</td><td>シグマ、一部＃M5057 </td></tr><tr><td> 5 M NaClを</td><td>シグマ、一部＃71386 </td></tr><tr><td> 20X SSPE </td><td>シグマ、一部＃S2015 </td></tr><tr><td>分子生物学グレードの水</td><td>シグマ、一部＃W4502 </td></tr><tr><td> ハイブリダイゼーションのプライマー </td><td> 様々なサプライヤー（標準脱塩） </td></tr><tr><td> Uptag </td><td> 5&#39;GATGTCCACGAGGTCTCT 3&#39; </td></tr><tr><td> Buptagkanmx4 </td><td> 5&#39;ビオチン- GTCGACCTGCAGCGTACG 3&#39; </td></tr><tr><td> Dntag </td><td> 5&#39;CGGTGTCGGTCTCGTAG 3&#39; </td></tr><tr><td> Bdntagkanmx4 </td><td> 5&#39;ビオチン- GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3&#39; </td></tr><tr><td> B213 </td><td> 5&#39;ビオチン- CTGAACGGTAGCATCTTGAC 3&#39; </td></tr><tr><td> Uptagkanmx </td><td> 5&#39;GTCGACCTGCAGCGTACG 3&#39; </td></tr><tr><td> Dntagkanmx </td><td> 5&#39;GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3&#39; </td></tr><tr><td> Uptagcomp </td><td> 5&#39;AGAGACCTCGTGGACATC 3&#39; </td></tr><tr><td> Dntagcomp </td><td> 5&#39;CTACGAGACCGACACCG 3&#39; </td></tr><tr><td> Upkancomp </td><td> 5&#39;CGTACGCTGCAGGTCGAC 3&#39; </td></tr><tr><td> Dnkancomp </td><td> 5&#39;CGATGAATTCGAGCTCGTTTTC 3&#39; </td></tr><tr><td> シーケンシングプライマー：イルミナのプラットフォーム </td><td> 様々なサプライヤー </td></tr><tr><td> UpTagフォワード（100uM） </td><td> 5&#39;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG ATC T GAT GTC CAC GAG GTC TCT 3&#39; </td></tr><tr><td> UpTagリバース（100uM） </td><td> 5&#39;AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T NNNNN GTC GAC CTG CAG CGT ACG 3&#39; </td></tr><tr><td> DownTagフォワード（100uM） </td><td> 5&#39;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG ATC T GAA AAC GAG CTC GAA TTC ATC G 3&#39; </td></tr><tr><td> DownTagリバース（100uM） </td><td> 5&#39;AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T NNNNN CGG TGT CGG TCT CGT AG 3` </td></tr><tr><td> 1を読んUP -タグ配列のプライマー（100uM） </td><td> 5&#39;GTC GAC CTG C​​AG CGT ACG 3&#39; </td></tr><tr><td> 1 DOWN -タグ配列のプライマー（100uM）をお読みください</td><td> 5&#39;CGG TGT CGG TCT CGT AG 3&#39; </td></tr><tr><td> 2インデックスシーケンスプライマー（標準イルミナR1のプライマー）（100uM）をお読みください</td><td> 5&#39;AC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T 3&#39; </td></tr><tr><td> 追加のシークエンシング試薬/装置 </td><td></td></tr><tr><td>キアゲンアプライ96 UF PCR精製キット</td><td>キアゲン、一部＃29051 </td></tr><tr><td>真空ポンプ</td><td>任意のベンダー</td></tr><tr><td>マシュレ-ナーゲル真空マニホールド</td><td>マシュレ-ナーゲル、一部＃740 681 </td></tr><tr><td>インビトロジェンクワント- ITのdsDNA BRアッセイキット</td><td>インビトロジェン、一部＃Q32853 </td></tr><tr><td>インビトロジェン量子ビットのアッセイチューブ</td><td>インビトロジェン、一部＃Q32856 </td></tr><tr><td> 40％アクリルアミドプラス1％N、N&#39; -メチレン - ビス - アクリルアミド、37.5:1 </td><td>バイオラッド、一部＃161-0148 </td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>シグマ、一部＃T1503 - 1KG </td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>シグマ、一部＃B6768 - 500G </td></tr><tr><td> 0.5M EDTA、pH8.0の</td><td> Teknova、一部＃E0306 </td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム</td><td>シグマ、一部＃A3678 - 25G </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> Bioshop、一部＃TEM001.25 </td></tr><tr><td>臭化エチジウム溶液</td><td> Bioshop、一部＃ETB444.10 </td></tr><tr><td> 0.5M酢酸アンモニウム</td><td> Teknova、一部＃A2000 </td></tr><tr><td> 10mMの酢酸マグネシウム四水和物</td><td>シグマ、一部＃M0631 - 100G </td></tr><tr><td> 1mMのEDTA、pH8.0の</td><td> 0.5M EDTA、pHが8.0を参照してください。 </td></tr><tr><td>エタノール</td><td>様々な</td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム、pH 5.2 </td><td> Teknova、一部＃S0297 </td></tr><tr><td>速度の真空</td><td>様々な</td></tr><tr><td>シングルリードクラスタ生成キット</td><td>イルミナ、一部＃GD - 300 - 1001 </td></tr><tr><td> v4の36Cシークエンシングキット</td><td>イルミナ、一部＃FC - 104 - 4002 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table> 10X TBEのレシピ<table border="1"><tbody><tr><td>額</td><td>試薬</td></tr><tr><td> 108グラム</td><td>トリスベース</td></tr><tr><td> 55グラム</td><td>ホウ酸</td></tr><tr><td> 40mlの</td><td> 0.5M EDTA（pH 8.0）を</td></tr><tr><td colspan="2"> 1LのマークにのdH 2 Oを追加</td></tr></tbody></table> 12％ポリアクリルアミドゲルのレシピ<table border="1"><tbody><tr><td>ボリューム</td><td>試薬</td></tr><tr><td> 5.8ミリリットル</td><td> 40％アクリルアミドプラス1％N、N&#39; -メチレン - ビス - アクリルアミド、37.5:1 </td></tr><tr><td> 12ミリリットル</td><td>のdH 2 O </td></tr><tr><td> 2ミリリットル</td><td> 10X TBE </td></tr><tr><td> 140μL </td><td> 10％の過硫酸アンモニウム</td></tr><tr><td>総量：20ミリリットル</td><td></td></tr></tbody></table>プライマーミックスをUptag： その後再懸Uptagと100μMでのddH 2 OでBuptagkanmx4それぞれ、50μMの各終濃度に対して1:1の比率で混合する。 -20℃で保存プライマーミックスをDowntag： 再懸​​DntagとBdntagkanmx4100μMでのddH 2 Oのそれぞれは、その後50μMの各終濃度に対して1:1の比率で混ぜる。 -20℃で保存混合オリゴヌクレオチド： 100μMでのddH 2 Oで次の8つのオリゴ（標準脱塩）のそれぞれを再懸濁します。 Uptag、Dntag、Uptagkanmx、Dntagkanmx、Uptagcomp、Dntagcomp、Upkancomp、Dnkancomp。 12.5μM各終濃度8つのオリゴヌクレオチドの等量を混ぜる。 12X MES在庫： 10ミリリットルの場合は、8ミリリットル分子生物学グレードの水に0.7グラムMES遊離酸一水和物と1.93グラムMESのナトリウム塩を溶かす。よく混合した後、pHをチェックし、pHを6.5から6.7に、必要に応じて調整します。 10ミリリットルの合計体積に水を追加。滅菌濾過し、4℃での光（例えば、ホイルで管を包む）から保護。解決策が目に見え黄色または6ヶ月後になった場合に交換してください。 2Xハイブリダイゼーション緩衝液： 50ミリリットルの場合は、12X MES株式の8.3ミリリットル（2.9.14から）、5 M NaClを、0.5 M EDTA、10％Tween 20を0.1 mlの（vol / vol）の4.0 mlおよび19.9ミリリットルのddHフィルタリングの17.7 mlを混ぜて2 O滅菌フィルタします。 ミックス300ミリリットル20X SSPE、1 mlの10％トゥイーン（vol / vol）の、699ミリリットルのddH 2 O：ウォッシュ滅菌フィルタします。 ウォッシュB：ミックス150ミリリットル20X SSPE、1 mlの10％トゥイーン（vol / vol）の、849ミリリットルのddH 2 O滅菌フィルタします。 バーコードシーケンシングプライマー UP -タグのプライマー配列の5&#39;末端には、（ 太字 ）FとRプライマーに組み込まイルミナ特定のアダプターの配列である。変数の配列（ イタリック体）インデックス/多重読み出しに使用される5 - merのインデックス作成のタグを表します。 3&#39;末端には（下線）uptagのバーコードを隣接の一般的なプライマーを表しており、酵母のバーコードを増幅するために必要です。 DOWN - tag内のプライマーは5しかし、3&#39;末端が（下線）を増幅するために使用される共通のプライマーで置き換えられる、UP -タグプライマー（イルミナ特定のシーケンス）の尾&quot;尾は5と同一である&#39;配列DOWNをタグのバーコード。

competitive genomic screens of barcoded yeast libraries

次世代シーケンシング技術の進歩のおかげで、我々は、ほぼ毎日新しいゲノム配列へのアクセス権を持っている。これらの進歩のテンポがより大きな深さと幅広さを約束し、加速しています。これらの飛躍的進歩を踏まえて、遺伝子の機能を定義するために、高速、並​​列メソッドの必要性がますます重要になります。酵母やE.におけるゲノムワイドな欠失変異体のコレクション大腸菌の遺伝子の機能の機能解析のための主力を務めているが、この方法はスケーラブルではない、現在の遺伝子欠失のアプローチは、ゲノムを構成する数千の遺伝子のそれぞれを削除し、検証する必要があります。この作業が完了した後にのみ、我々は、高スループットの表現型解析を挟むこともできます。過去10年間で、私たちの研究室では競争力のある、小型化、ハイスループットのゲノムワイドな並列実行できるアッセイのポートフォリオを改良しました。この並列化では、バーコードは、突然変異のプロキシとして機能しているためDNA&quot;タグ&quot;、または各変異体に&quot;バーコード&quot;を含めることが可能であり、1は変異型フィットネスを評価するためにバーコードの存在量を測定することができます。本研究では、我々はDNA配列やバーコード変異体コレクションの間のギャップを埋めるために求めている。これを達成するために我々は、新たに配列決定するまでのパラレルバーコードのアッセイを開きますが、悪い微生物を特徴とする複合トランスポゾン混乱 - バーコードのアプローチを紹介する。我々は新しいカンジダバーコード混乱のコレクションを発表し、どのように両方のマイクロアレイベースの、次世代シーケンシングベースのプラットフォームを記述するこのアプローチを説明するために10,000を集めるために使用することができます-一回の実験で1,000,000遺伝子-遺伝子と薬剤遺伝子の相互作用。

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Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

我々は包括的、公平なゲノムワイドな遺伝子薬剤と遺伝子 - 環境相互作用を理解するために画面を開発しました。これらの変異体のコレクションをスクリーニングするための方法が提示されます。

バーコード酵母ライブラリーの競争力のあるゲノム画面

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

competitive-genomic-screens-of-barcoded-yeast-libraries

Research

JoVE Journal

Biology

18.0K ビュー.  University of Toronto. 我々は包括的、公平なゲノムワイドな遺伝子薬剤と遺伝子 - 環境相互作用を理解するために画面を開発しました。これらの変異体のコレクションをスクリーニングするための方法が提示されます。