ברצוננו להודות לקרן קנדית עבור חדשנות, קולומביה הבריטית ידע ופיתוח הקרן, הגנום קולומביה הבריטית ואת קולומביה הבריטית משרד יערות טווח לתמיכה במחקרים מתמשך של פוריות הקרקע ביער. SL נתמך על ידי מענק ממרכז טולה היסוד במימון עבור גיוון התפתחות חיידקים.

אני חלק: הפקת DNA נוהל 1. 8 שעות נדרשים, לעיבוד 6 דגימות כולל כימות של ה-DNA. לפני שתתחיל החילוץ, יהיה עליך ועלי מראש צמרמורת מרגמה, ו מרית מקפיא -20 ° C או באמצעות חנקן נוזלי. כמו כן, מראש צמרמורת 50 צינורות מ&quot;ל המכיל 20 מ&quot;ל כלורופורם isoamyl אלכוהול (24:1) על קרח. הגדר את התנור הכלאה עד 65 מעלות צלזיוס מראש לחום. בדוק פתרון CTAB, אם הוא התגבש חמים 60 ° C כדי להמיס את הגבישים. השלם את הפתרון denaturing ו חיץ החילוץ על ידי הוספת מרכיבים האחרון ממש לפני שאתה מתחיל את החילוץ (ראו מתכון בהמשך). התנהגות מיצוי כל ההליכים במנדף קטר. 2. הכן את החיץ denaturing ו חיץ החילוץ. הערה: כדי למקסם את התשואה ה-DNA, הוא קריטי כדי לעשות בדיוק מאגרים ההוראות. 3. מקום 2 גרם של אדמה במכתש מראש צונן. הערה: קרקע שנאספו בשטח צריך להיות קפוא על קרח יבש הובלה המאוחסן ב -80 ° C. להפשיר קרקע מסננת באמצעות מסננת 2 מ&quot;מ לפני מיצוי DNA. אתה יכול להגדיל את כמות המוצא של אדמה עד 10 גרם 4. הוסף 1 מ&quot;ל של denaturing פתרון הקרקע. 5. הקפאת וטוחנים את האדמה N נוזלי 2 באמצעות העלי עד חלקיקי אדמה להסתכל אבקתי ו הומוגנית. חזור מקפיא שחיקה פעמיים. הערה: שמור את דגימת אדמה קפואים במהלך שחיקה, באמצעות חנקן נוזלי מספיק כדי לכסות באופן מלא את המדגם אדמה. התכה קלה במהלך שחיקה מקובל. 6. העברת הקרקע קרקע על צינור חרוטי 50 מ&quot;ל בעזרת מרית מראש צונן. הערה: דגימת קרקע קרקע יכול להיות מאוחסן ב -80 ° C, בשלב זה, במידת הצורך. 7. הוסף 9 מ&quot;ל של מיצוי המאגר. כדי לערבב את הפתרון ואדמה, בקצרה מערבולת במהירות נמוכה. הערה: כדי להבטיח למאגר היא הומוגנית, לחמם אותו על 60 מעלות צלזיוס במשך 10-15 דקות לפני השימוש. שמור את שאר חוצץ ב 60 ° C בכל החילוץ. וורטקס במהירות 8 (בסולם שבו 10 הוא הציון המקסימלי). 8. דגירה של 40 דקות ב 65 מעלות צלזיוס בתנור הכלאה. במהלך הדגירה, ברציפות לסובב את שפופרות במהירות הנמוכה ביותר, או בעדינות להפוך את צינורות כל 10 דקות. הערה: הניחו את הצינור אופקית בתנור הכלאה לאפשר חיץ לפנות קרקע על פני שטח פנים גדול. הפתרון עשוי להיראות קצת צמיג במהלך הדגירה. 9. צנטריפוגה ב 1800 x גרם, 10 דקות בשעה 10-14 ° C. העברת supernatant לתוך צינור מראש צינן את חרוטי 50 מ&quot;ל המכיל 20 מ&quot;ל כלורופורם-isoamyl אלכוהול (24:1), לשמור על הקרח. הערה: כאשר אתה מעביר supernatant, להיזהר לא להפריע את השכבה האורגנית (השכבה התחתונה). השאירו 1-2 מ&quot;ל של supernatant אם זה הכרחי על מנת לאסוף רק supernatant נקי. לעתים קרובות אתה יכול לראות שכבה בצבע בז&#39; (1-3 מ&quot;מ עובי כ) על גבי supernatant. נא לא להפריע שכבה זו בעת לקיחת supernatant. נסו להחליק את קצה הצינור לאורך הקיר כדי למנוע שבירה של שכבה זו בז&#39;. אם supernatant הוא עכור מדי, לחזור על מיצוי כלורופורם-isoamyl אלכוהול עוד פעם אחת על supernatant. אין להשתמש pipettes פלסטיק חד פעמיות בעת העברת כלורופורם, כלורופורם יתמוססו הפלסטיק. השתמש פיפטה כוס, או כוס סיימה גליל, או לשפוך כלורופורם ישירות לתוך צינורות חרוטי 50 מ&quot;ל. 10. חלץ את כדורי אדמה 2 יותר פעמים; 10.1. הוסף 5 מ&quot;ל מיצוי חיץ את כדורי אדמה, לערבב בעדינות בעזרת טיפ 1 מ&quot;ל ואחריו vortexing קצר במהירות נמוכה. הערה: Shake ומערבבים החיץ לפני השימוש. 10.2. לדגור על 65 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות בתנור הכלאה. צנטריפוגה ב 1800 x גרם, 10 דקות בשעה 10-14 ° C. העברת supernatant אל הצינור בשלב 9. שמור את הצינור עם אסף supernatant כלורופורם ו-isoamyl אלכוהול על הקרח במהלך החילוץ. הערה: ודא שאתה מוסיף את supernatant אל הצינור אותו מבלי לחצות ערבוב בין הדגימות. 10.3. חזור על 9.1 ו 9.2 עוד פעם אחת. 11. בעזרת צלחת מסתובבת, בעדינות רבה הסלע שפופרת המכילה את supernatant אסף (14-19 מ&quot;ל) ו-כלורופורם isoamyl אלכוהול בסל&quot;ד 1.25 עבור 10 דקות. הערה: סגור את המכסה בחוזקה כדי למנוע דליפה. הניחו מגבת נייר על הצלחת נדנדה לפני המקום הצינור ולכן כל ההדלפות ניתן לאתר בקלות. 12. צנטריפוגה ב 1800 x גרם, במשך 20 דקות בשעה 10-14 ° C. 13. העברת השלב מימית לצינור חדש. הערה: אין להפריע את שלבי הביניים בין השלב מימית (השכבה העליונה) לבין שכבת אורגני (התחתוןהשכבה) בעת העברת supernatant. השאר כ 1.5-2 מ&quot;ל supernatant כדי להבטיח אוסף של supernatant רק נקי. 14. לשחזר את ה-DNA באמצעות איזופרופיל אלכוהול (צעד 15.a - 21.a). לחלופין, להשתמש Amicon ® Ultra-15 התקנים מסנן צנטריפוגלי (שלב 15.b - 21.b) אם אתה מצפה כמות נמוכה מאוד של ביומסה במדגם שלך, אשר ייצרו גלולה בקושי נראו על ידי משקעים אלכוהול איזופרופילי שקשה להתאושש. 15.a. מניחים את supernatant כדי ultracentrifuge צינור חדש. 16.a. הוספת אלכוהול איזופרופילי כדי supernatant שנאסף ביחס נפח של 0.6:1. היפוך הצינורות בעדינות כמה פעמים כדי לערבב. 17.a דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. 18.a. צנטריפוגה ב 16000 x גרם, במשך 20 דקות בשעה 20-25 ° C. ודא את המשקולות של כל הצינורות מאוזנים היטב לפני הצעד צנטריפוגה. הערה: סמן את כיוון הכוח הצנטריפוגלי ברכבת התחתית, כך שאתה יכול לזהות את ה-DNA גלולה ביתר קלות כאשר התשואה DNA הוא נמוך. 19.a. הסר אלכוהול איזופרופילי באמצעות אחסון או שאיבת אבק. היזהר לא להפריע גלולה DNA. הערה: הסרה של אלכוהול איזופרופילי בהקדם צנטריפוגה הושלמה. תיזהר מאוד לא לאבד את גלולה DNA. גודלו של ה-DNA גלולה יכול להשתנות במידה רבה בהתאם לסוג הקרקע, מתוך לעין (~ בקוטר 9 מ&quot;מ) כדי לראות בקושי. מומלץ להסיר את שאריות של אלכוהול איזופרופילי על ידי שאיבה לאורך הקיר של הצינור בזהירות כדי לא היניקה את גלולה DNA. 20.a. יבש DNA גלולה בטמפרטורת החדר למשך 5-20 דקות. הערה: אל על יבש DNA גלולה, אחרת זה יהיה קשה redissolve את ה-DNA. 21.a. Resuspend גלולה דנ&quot;א TE 200 μl. מערבבים אותו על ידי הקשה עדינה. מעבירים את פתרון ה-DNA לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל. שמור את הצינור ב 4 ° C למשך הלילה כדי לפזר באופן מלא DNA. הערה: בהתאם לגודל של גלולה, אתה יכול להתאים את עוצמת הקול של TE להוסיף. בדרך כלל 200-400 μl של TE עובד היטב. * לחילופין, בצע את השלבים 15.b - 21.b. 15.b. טרום לשטוף Amicon ® Ultra-15 התקנים מסנן צנטריפוגלי, מוסיפים 15 מ&quot;ל TE למכשיר צנטריפוגות ב 3500 x גרם, במשך 10 דקות. מחק את הזרימה דרך. 16.b. מניחים את פתרון ה-DNA משלב 13 לסנן מראש הדיחה את Amicon. צנטריפוגה ב 3500 x גרם עד נפח DNA מצטמצם 200-500 μl. מחק את הזרימה דרך. 17.b. לשטוף את ה-DNA עם TE פעמיים, מוסיפים 10 מ&quot;ל TE להתקנים לסנן Amicon. צנטריפוגה ב 3500 x גרם עד נפח DNA מצטמצם μl כ 200. מחק את הזרימה דרך. חזור עוד פעם אחת. 18.b. מעבירים את פתרון ה-DNA על הפילטר לצינור 1.5 חדש מ&quot;ל. 19.b. הוסף 40 μl TE לסנן את Amicon. לשטוף הן בצד של ממברנות סינון לפי pipetting למעלה ולמטה כדי להתאושש שאריות DNA על המסנן. הוסף את הפתרון הזה כדי לשטוף את הצינור ב 18.b. צעד 20.b. אם יש צורך, הדנ&quot;א יכול להיות מרוכז יותר על ידי Microcon יחידת ® Ultracel-30 י&quot;מ מסנן צנטריפוגלי; מראש לשטוף את המסנן על ידי הוספת 200 TE μl ו centrifuging ב 10000 x גרם במשך 7 דקות. מוסיפים את פתרון ה-DNA כדי לסנן את ו צנטריפוגות ב 5000 x g דקות 1. חזור צנטריפוגה עד סכום של פתרון ה-DNA על המסנן מופחת μl 50 בערך. הערה: המדגם הראשוני מרבי בנפח של Microcon המסנן 500 μl. אל צנטריפוגות במהירויות מעל 14,000 x ז אל על צנטריפוגות עד מתייבש קרום לחלוטין. ודא כי נוזל כלשהו עדיין מכסה את המסנן לאחר צנטריפוגה. אם אתם מעל centrifuged ואת קרום יבש, ולאחר מכן להוסיף 15 TE μl, להתסיס בעדינות למשך 30 שניות, המשך לשלב 21.b. 21.b. הנח את יחידת המסנן הפוך בצינור Microcon צנטריפוגה חדשה ב 1000 XG 3 דקות לשחזר את ה-DNA. 22. לכמת ה-DNA על ידי טה ג&#39;ל (0.8%, 0.5xTAE, 50 V 4 שעות), ועל ידי ספקטרופוטומטר Nanodrop או פיקו ירוק assay והקורא צלחת. הערה: כמות ה-DNA יכול להיות מוערך על ידי השוואת הלהקה מדגם ללהקה סמן עם ריכוז ידוע (DNA גבוהה סמן מולקולרי או λHindIII) על הג&#39;ל. 23. בדוק את שלמות ה-DNA משקל מולקולרי גבוה באמצעות שדה פעמו ג&#39;ל אלקטרופורזה (PFGE) עם 1%, 1xTAE ג&#39;ל (לפרטים נוספים ראה את שלב II, part2 ב <a href="https://www.jove.com/index/details.stp?id=1387">https://www.jove.com/index/details.stp?id = 1387</a> , doi: 10.3791/1387 ידי Taupp et al 2009).. הערה: ניתן להשתמש בג&#39;ל רגיל agarose למטרה זו QC במקום נמוך ההיתוך agarose. בקיצור, תנאי אלקטרופורזה הן כדלקמן: 2-250 קילו, 6 וולט, זמן המעבר הראשונית: 5 שניות, זמן המעבר הסופי: 15 שניות, לרוץ במשך 12 שעות ב 14 ° C. זהב SYBR מכתים במשך שעה אחת כדי להמחיש את הדנ&quot;א על ​​הג&#39;ל. 24. אם המשקל המולקולרי של הדנ&quot;א חילוץ הם משביעי רצון, ולאחר מכן להמשיך את הצעד הבא צנטריפוגות CsCl הדרגתי. לחילופין, ה-DNA יכול להיות מאוחסן ב -20 ° C או -80 ° C לפני בצנטריפוגה CsCl. הגודל הממוצע של ה-DNA צריכה להיות שווה או עולה על 36 KB, אם אתה רוצה לבנות להכניס גדול metagenomic ספריית ה-DNA. חלק II. ה-DNA טיהור באמצעות ultracentrifugation צזיום כלוריד שיפוע הכנת צנטריפוגה: 1.5 - 2 שעות צעד צנטריפוגה: 18 שעות הסרת ethidium ברומיד (EtBr) לבין ריכוז ה-DNA לאחר צנטריפוגה: 3 שעות נוהל לפרטים, עיין רייט et al. . 2009 <a href="https://www.jove.com/index/details.stp?id=1352">https://www.jove.com/index/details.stp?id=1352</a> , doi: 10.3791/1352 תוצאות נציג / תוצאה הסכום הכולל של הדנ&quot;א הגנומי מבודד 2 גרם של יער אדמה אורגני (אופק O) אופקים מינרלים (AE, AB, ו Bt אופקים) (שנדגמו פוריות הקרקע ארוך טווח (LTSP) באתר הממוקם Skulow האגם, BC, קנדה ומנוהל על ידי משרד לפנה&quot;ס יערות טווח) נע בין 10 מ&quot;ג עד 180 מ&quot;ג. הגודל הממוצע של ה-DNA בודד היה בדרך כלל בין 40-60 kb (איור 1). יחס ספיגת ב 260 ננומטר nm/280 היה בין 1.3-1.6 והיתה לשיא 230 ננומטר, אשר עשוי להצביע על זיהום חומצה humic נצפה לעיתים קרובות דגימות קרקע. צנטריפוגה שיפוע CsCl מופחת באופן דרסטי את זיהום גם הגדילה את יחס של 260/280 ל 1.8-1.9 כפי שמוצג באיור 2a ו 2b. <img src="/files/ftp_upload/1569/1569fig1.jpg" alt="איור 1" /> 1. איור PFGE תמונות של ה-DNA הגנומי חילוץ לפני ultracentrifugation CsCl. lane1: 1 kb סמן 100 ננוגרם, מסלול 2: λHind III סמן 100 ננוגרם, מסלול 3: λHind III סמן 250 ננוגרם, מסלול 4: λHind III סמן 500 ננוגרם, lane5: Fosmid 36 kb סמן 100 ננוגרם, מסלול 6 ו -7: גנומית ה-DNA שבודד את האדמה מינרלים האופק AE, מסלול 8 ו -9: הדנ&quot;א הגנומי מבודדים מן א.ב. אדמה מינרלים האופק באתר LTSP ממוקם Skulow האגם, BC <img src="/files/ftp_upload/1569/1569fig2tmb.jpg" alt="איור 2" border="0" /> איור 2. Chromograms של הדנ&quot;א הגנומי זוהה על ידי ספקטרופוטומטר לפני (א) ואחרי ultracentrifugation CsCl (B). שימו לב ירידת הערך ספיגת באורך גל 230 ננומטר לאחר ultracentrifugation CsCl, דבר שמצביע על שיפור באיכות הדנ&quot;א הגנומי. אנא <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/1569/1569fig2.jpg">לחץ כאן</a> כדי לראות גרסה גדולה יותר של הדמות 2.

<ol>
	<li>Hurt, R. A., Qiu, X., Wu, L., Roh, Y., Palumbo, A. V., Tiedje, J. M., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+recovery+of+RNA+and+DNA+from+soils+and+sediments.">Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments.</a> AEM. 67 (10), 4495-4503 (2001).</li><li>Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+extraction+from+0.22+&#956;M+Sterivex+filters+and+cesium+chloride+density+gradient+centrifugation.">DNA extraction from 0.22 &#956;M Sterivex filters and cesium chloride density gradient centrifugation.</a> JoVE. , (2009).</li><li>Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+insert+environmental+genomic+library+production.">Large insert environmental genomic library production.</a> J Vis Exp. , (2009).</li></ol>

מתכון * Denaturing פתרון 4 M isothiocyanate Guanidine 10 mM טריס-HCl (pH 7.0) 1 mM EDTA 0.5% 2-mercaptoethanol <table border="0" style="font-size:9pt; width:400px;;text-align:right;direction:rtl"><tr><td colspan="2"> פתרון Denaturing: 10 מ&quot;ל בסך הכל </td></tr><tr><td> Guanidine isothiocyanate (MW 118.16) </td><td> 4.73 גר &#39; </td></tr><tr><td> טריס-1M HCl (pH 7.0) </td><td> 100 μl </td></tr><tr><td> 0.5m EDTA </td><td> 20 μl </td></tr><tr><td colspan="2"> מוסיפים מים כדי מ&quot;ל 9.95 בסך הכל. </td></tr><tr><td colspan="2"> החיטוי. </td></tr><tr><td colspan="2"> הוסף 50 μl 2-mercaptoethanol רק לפני השימוש. (5 μl של mercaptoethanol-2 פתרון לכל 1 מ&quot;ל Denaturing) הערה: שמור את הפתרון Denaturing ב 4 ° C. אין להשתמש חיץ מבוגרת בשבוע אחד. אם אפשר, לעשות חיץ טרי לשימוש. </td></tr></table> ** הפקת הצפת נתרן 100 mM חיץ פוספט [pH 7.0] 100 מ&quot;מ טריס-HCl [pH 7.0] 100 mM EDTA [pH 8.0] 1.5 M NaCl Hexadecyltrimethylammonium ברומיד 1% (CTAB) 2% SDS <table border="0" style="font-size:9pt; width:400px;;text-align:right;direction:rtl"><tr><td colspan="2"> הפקת הצפת עבור L 1 בסך הכל </td></tr><tr><td> סודיום פוספט 1M חיץ [pH 7.0] * </td><td> 100 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> טריס-1M HCl [pH 7.0] </td><td> 100 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 0.5m EDTA [pH 8.0] </td><td> 200 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> 300 מ&quot;ל </td></tr><tr><td colspan="2"> החיטוי ולשמור אותו בטמפרטורת החדר. </td></tr><tr><td colspan="2"> מוסיפים 200 מ&quot;ל, ברומיד Hexadecyltrimethylammonium 5% (CTAB, autoclaved) ו 100 מ&quot;ל, 20% SDS (autoclaved) רק לפני השימוש. אם CTAB היתה מגובשת, להמיס אותו על 60 ° C. * סודיום פוספט 1M חיץ: 57.7 מ&quot;ל, סודיום פוספט 1M monobasic (לאא 2 PO 4) ו - 42.3 מ&quot;ל, 1M פוספט נתרן dibasic (לאא 2 PO 4). התאם ל-pH 7.0 הערה: אין להשתמש SDS 20% אם יש משקעים. זה נורמלי לראות ההשעיה חלבי כאשר אתה מוסיף SDS לפתרון. לאחר שתוסיף SDS, המקום חיץ מיצוי ב 60 ° C כדי להבטיח SDS הוא מושעה היטב. </td></tr></table>

extraction of high molecular weight genomic dna from soils and sediments

Microbiome אדמה הוא מאגר עצום נחקרו יחסית של גיוון גנטי וחדשנות מטבולית קשורה באופן הדוק עם מזין ואת זרימת האנרגיה בתוך המערכות האקולוגיות של כדור הארץ. טיפוח עצמאית גנומית סביבתי, המכונה גם metagenomic, גישות מבטיח גישה חסרת תקדים למידע זה גנטי לגבי שחזור מסלול ההקרנה פונקציונלי טיפולית ערך גבוה המרה תהליכים ביומסה. עם זאת, microbiome אדמה עדיין אתגר בעיקר בשל הקושי בהשגת משקל מולקולרי גבוה DNA באיכות מספיק לייצור להכניס ספריה גדולה. כאן אנחנו מציגים פרוטוקול לחילוץ משקל מולקולרי גבוה, ה-DNA הגנומי של חיידקים הקהילה מקרקעות ו משקעים. איכות של הדנ&quot;א הגנומי מבודד אידיאלי לבניית סביבתי גדול להכניס ספריות גנומית עבור במורד הזרם יישומים רצף ההקרנה. ההליך מתחיל עם תמוגה התא. קירות התא ממברנות של חיידקים הם lysed על ידי שני כוחות מכניים (שחיקה) וכימיות (β-mercaptoethanol). הדנ&quot;א הגנומי מבודד מכן באמצעות חיץ החילוץ, כלורופורם, isoamyl אלכוהול אלכוהול איזופרופילי. מאגרים מועסק תמוגה ואת הצעדים החילוץ כוללים isothiocyanate guanidine ו ברומיד hexadecyltrimethylammonium (CTAB) כדי לשמור על שלמות ה-DNA גנומי מולקולרי גבוה במשקל. בהתאם ליישום הזרם שלך, ה-DNA הגנומי מבודד יכול להיות מטוהרים נוסף באמצעות צזיום כלוריד (CsCl) ultracentrifugation שיפוע, אשר מפחית זיהומים כולל חומצות humic. הליך השאיבה הראשונה, לוקח כ 8 שעות, למעט שלב כימות DNA. Ultracentrifugation שיפוע CsCl, הוא תהליך יומיים. במהלך ההליך כולו, הדנ&quot;א הגנומי יש לנהוג בעדינות כדי למנוע גז, להימנע vortexing חמורים, pipetting קשים חוזרים.

Watch this Scientific Journal Video about Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments at JoVE.com

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

מתודולוגיה לבודד משקל מולקולרי גבוה גבוה DNA הגנומי איכות מהקהילה חיידקים בקרקע מתואר.

הפקת DNA גבוהה מולקולרית משקל הגנום מקרקעות ו משקעים

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

extraction-high-molecular-weight-genomic-dna-from-soils

Research

JoVE Journal

Biology

25.5K Views.  University of British Columbia - UBC. מתודולוגיה לבודד משקל מולקולרי גבוה גבוה DNA הגנומי איכות מהקהילה חיידקים בקרקע מתואר.

Video: Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

בידוד של הדנ&quot;א הגנומי של זנבות עכבר

DNA Extraction from 0.22 &mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

This method is used to extract high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;M Sterivex filters that have been treated with storage/lysis buffer and archived at -80&deg;C, and to purify this DNA using a cesium chloride density gradient.  The protocol begins with two one-hour incubation steps to liberate DNA from cells and remove RNA.  Next, a series of Phenol:Chloroform and Chloroform extractions are performed followed by centrifugation to remove proteins and cell membrane components, collection of the aqueous DNA extract, and several buffer exchange steps to wash and concentrate the extract.  Part Five describes the optional purification via cesium chloride density gradient.  It is recommended to work with less than 15 samples at one time to avoid confusion and cut down protocol time. The total time required for this protocol depends on the number of samples to be extracted. For 10-15 samples and assuming the proper centrifugation equipment is available, this entire protocol should take 3 days. Make sure you have the hybridization ovens set to temperature at the outset of the process.

DNA Extraction from 0.22 &amp;mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

We describe a method for extraction of high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;m Sterivex filters, followed by cesium chloride density gradient centrifugation for purification.

הפקת DNA של 0.22 מיקרומטר מסננים Sterivex ו כלוריד צסיום צפיפות צנטריפוגה Gradient

This method is used to extract high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;M Sterivex filters that have been ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in their nucleotide composition and consist of a complex mosaic of sequence patterns. These patterns include so-called Mid-Range Inhomogeneity (MRI) regions -- sequences 30-10000 nucleotides in length that are enriched by a particular base or combination of bases (e.g. (G+T)-rich, purine-rich, etc.). MRI regions are associated with unusual (non-B-form) DNA structures that are often involved in regulation of gene expression, recombination, and other genetic processes (Fedorova &amp; Fedorov 2010). The existence of a strong fixation bias within MRI regions against mutations that tend to reduce their sequence inhomogeneity additionally supports the functionality and importance of these genomic sequences (Prakash et al. 2009).
Here we demonstrate a freely available Internet resource -- the Genomic MRI program package -- designed for computational analysis of genomic sequences in order to find and characterize various MRI patterns within them (Bechtel et al. 2008). This package also allows generation of randomized sequences with various properties and level of correspondence to the natural input DNA sequences. The main goal of this resource is to facilitate examination of vast regions of non-coding DNA that are still scarcely investigated and await thorough exploration and recognition.

We present a public computational web site for the analysis of genomic sequences. It detects DNA sequence patterns with various non-random nucleotide compositions. This resource also generates randomized sequences with diverse levels of complexity.

הגנום MRI - משאב ציבורי עבור לימוד דפוסי בתוך רצף הדנ&quot;א הגנומי

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

הפקת DNA מחומר פרפין Embedded עבור ניתוח גנטי epigenetic

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction of high-quality, high molecular weight (HMW) community DNA. However, environmental mat samples often pose difficulties to obtaining large concentrations of high-quality, HMW DNA. Hypersaline microbial mats contain high amounts of extracellular polymeric substances (EPS)1 and salts that may inhibit downstream applications of extracted DNA. Direct and harsh methods are often used in DNA extraction from refractory samples. These methods are typically used because the EPS in mats, an adhesive matrix, binds DNA2,3 during direct lysis. As a result of harsher extraction methods, DNA becomes fragmented into small sizes4,5,6.
The DNA thus becomes inappropriate for large-insert vector cloning. In order to circumvent these limitations, we report an improved methodology to extract HMW DNA of good quality and quantity from hypersaline microbial mats. We employed an indirect method involving the separation of microbial cells from the background mat matrix through blending and differential centrifugation. A combination of mechanical and chemical procedures was used to extract and purify DNA from the extracted microbial cells. Our protocol yields approximately 2 &mu;g of HMW DNA (35-50 kb) per gram of mat sample, with an A260/280 ratio of 1.6. Furthermore, amplification of 16S rRNA genes7 suggests that the protocol is able to minimize or eliminate any inhibitory effects of contaminants. Our results provide an appropriate methodology for the extraction of HMW DNA from microbial mats for functional metagenomic studies and may be applicable to other environmental samples from which DNA extraction is challenging.

We provide an improved protocol for extracting high molecular weight DNA from hypersaline microbial mats. Microbial cells are separated from the mat matrix prior to DNA extraction and purification. This enhances the concentrations, quality, and size of the DNA. The protocol may be used for other refractory samples.

הפקת DNA גבוהה מולקולרית משקל של מאטס מיקרוביאלית

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction  of high-quality, high molecular weight ...

A Practical and Novel Method to Extract Genomic DNA from Blood Collection Kits for Plasma Protein Preservation

Laboratory tests can be done on the cellular or fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes determines the portion of the blood that can be analyzed (whole blood, plasma or serum). Laboratories involved in studying the genetic basis of human disorders rely on anticoagulated whole blood collected in EDTA-containing vacutainer as the source of DNA for genetic / genomic analysis. Because most clinical laboratories perform biochemical, serologic and viral testing as a first step in phenotypic outcome investigation, anticoagulated blood is also collected in heparin-containing tube (plasma tube). Therefore when DNA and plasma are needed for simultaneous and parallel analyses of both genomic and proteomic data, it is customary to collect blood in both EDTA and heparin tubes. If blood could be collected in a single tube and serve as a source for both plasma and DNA, that method would be considered an advancement to existing methods. The use of the compacted blood after plasma extraction represents an alternative source for genomic DNA, thus minimizing the amount of blood samples processed and reducing the number of samples required from each patient. This would ultimately save time and resources.
The BD P100 blood collection system for plasma protein preservation were created as an improved method over previous plasma or serum collection tubes1, to stabilize the protein content of blood, enabling better protein biomarker discovery and proteomics experimentation from human blood. The BD P100 tubes contain 15.8 ml of spray-dried K2EDTA and a lyophilized proprietary broad spectrum cocktail of protease inhibitors to prevent coagulation and stabilize the plasma proteins. They also include a mechanical separator, which provides a physical barrier between plasma and cell pellets after centrifugation. Few methods have been devised to extract DNA from clotted blood samples collected in old plasma tubes2-4. Challenges from these methods were mainly associated with the type of separator inside the tubes (gel separator) and included difficulty in recovering the clotted blood, the inconvenience of fragmenting or dispersing the clot, and obstruction of the clot extraction by the separation gel.
We present the first method that extracts and purifies genomic DNA from blood drawn in the new BD P100 tubes. We compare the quality of the DNA sample from P100 tubes to that from EDTA tubes. Our approach is simple and efficient. It involves four major steps as follows: 1) the use of a plasma BD P100 (BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) tube with mechanical separator for blood collection, 2) the removal of the mechanical separator using a combination of sucrose and a sterile paperclip metallic hook, 3) the separation of the buffy coat layer containing the white cells and 4) the isolation of the genomic DNA from the buffy coat using a regular commercial DNA extraction kit or a similar standard protocol.

We are describing a new method of isolating genomic DNA from whole blood collected for plasma/serology. After plasma collection, the compacted blood is usually discarded. Our novel method represents a significant improvement over existing methods and makes DNA and plasma available from a single collection, without requesting additional blood.

שיטה מעשית ורומן לחלץ הדנ&quot;א הגנומי מערכות דם אוסף לשימור חלבון פלזמה

Laboratory tests can be done on the cellular or  fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes  determines the portion of the ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

לכידה סלקטיבית של 5-hydroxymethylcytosine מהדנ&quot;א הגנומי

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

הגברה, רצף הדור הבא, ואת הגנום מיפוי ה- DNA של אתרי אינטגרצית retroviral

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Mucin Agarose Gel Electrophoresis: Western Blotting for High-molecular-weight Glycoproteins

Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against invading pathogens. The main role of these macromolecules is to facilitate particle trapping and clearance while promoting lubrication of the mucosa. During protein synthesis, mucins undergo intense O-glycosylation and multimerization, which dramatically increase the mass and size of these molecules. These post-translational modifications are critical for the viscoelastic properties of mucus. As a result of the complex biochemical and biophysical nature of these molecules, working with mucins provides many challenges that cannot be overcome by conventional protein analysis methods. For instance, their high-molecular-weight prevents electrophoretic migration via regular polyacrylamide gels and their sticky nature causes adhesion to experimental tubing. However, investigating the role of mucins in health (e.g., maintaining mucosal integrity) and disease (e.g., hyperconcentration, mucostasis, cancer) has recently gained interest and mucins are being investigated as a therapeutic target. A better understanding of the production and function of mucin macromolecules may lead to novel pharmaceutical approaches, e.g., inhibitors of mucin granule exocytosis and/or mucolytic agents. Therefore, consistent and reliable protocols to investigate mucin biology are critical for scientific advancement. Here, we describe conventional methods to separate mucin macromolecules by electrophoresis using an agarose gel, transfer protein into nitrocellulose membrane, and detect signal with mucin-specific antibodies as well as infrared fluorescent gel reader. These techniques are widely applicable to determine mucin quantitation, multimerization and to test the effects of pharmacological compounds on mucins.

Mucins are high-molecular-weight glycoconjugates, with size ranging from 0.2 to 200 megadalton (MDa). As a result of their size, mucins do not penetrate conventional polyacrylamide gels and require larger pores for separation. We provide a detailed protocol for mucin agarose gel electrophoresis to assess relative quantification and study polymer assembly.

Mucin Agarose ג&#39;ל אלקטרופורזה: מערבי סופג עבור גליקופרוטאינים גבוה בעל משקל מולקולרי


Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against ...

Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, host characteristics, and broader ecosystem functions. With this rapid increase in breadth and depth of sequencing capabilities have come methods to extract, amplify, analyze, and interpret environmental DNA successfully with maximum efficiency. Unfortunately, performing DNA extractions quickly can come at the cost of increasing the risk of contamination among samples. In particular, high-throughput extractions that are based on samples contained in a 96-well plate offer a relatively quick method, compared to single-tube extractions, but also increase opportunities for well-to-well cross-contamination. To minimize the risk of cross-contamination among samples, while retaining the benefits of high-throughput extraction techniques, we developed a new method for loading environmental samples into 96-well plates. We used pierceable PCR sealing films to cover each plate while loading samples and added samples first to PCR tubes before moving them into wells; together, these practices reduce the risk of sample drift and unintended double loading of wells. The method outlined in this paper provides researchers with an approach to maximize available high-throughput extraction techniques while reducing the risk of cross-contamination inherent to 96-well plates. We provide a detailed step by step outline of how to move from sample collection to DNA extraction while minimizing the risk of unwanted cross-contamination.

Current methods for loading 96-well plates for DNA extractions can be prone to contamination. We detail a new method for loading 96-well plates that reduces risk of cross-contamination among wells. Our method will help other researchers capitalize on the efficiency of high-throughput DNA extraction techniques and minimize risk of contamination.

שיטות ששונו לטעינת לוחות מיצוי DNA בתפוקה גבוהה להפחית את הפוטנציאל לזיהום

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, ...