私はロナルドL.カラブレーゼ、ディーターイエガー（エモリー大学）および有用な技術的な議論のための病棟Yuhas（アクソンインスツルメンツ）に感謝しています。

<ol><li>視床下部の脳切片を調製し、インキュベートし、GnRHニューロンのGnRHペプチドのプロモーター（10）の制御下に緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現動物で（9）以前に詳細な記録室に転送されます。動物からの脳を除去した後、脳は関心のない地域をなくすためにカミソリの刃を使用してブロックされます。視床下部は、可視化できるよう、削除する領域を決定するために、脳はその背面に配置されます。冠状および矢状スライスの方向の両方に、小脳は削除されます。冠状スライス標本の場合は、皮質の吻側部分が削除されます。このスライスの向きで、皮質の外側の領域は、脳をスライスするためのサポートを提供し、録音室内の脳を保護するために銀線を配置するための脳の十分な領域を提供しています。矢状スライスの準備に、脳の外側の領域を除去し、皮質の吻側部分は、スライス脳のためともレコーディングで脳を保護するために銀線の配置のためのサポートを提供している。ブロッキングの手順では、脳が継続的にガラスピペットを用いてコールド人工脳脊髄液（ACSF）で湿らせている。 </li><li>スーパー接着剤に少量の最先端のプラットフォーム上に配置されます。脳は、スパチュラで解除されます。過剰ACSFは、ヘラの表面にキムワイプを持参し、脳から過剰なACSFを描画することによって除去される。脳を穏やかに接着剤の上に前方にスライドさせる。それを確保するために脳に触れたり、その上にプッシュダウンしないすることが重要です。脳自体の重量は、通常、それが安全であることを確認するのに十分です。 </li><li>脳と最先端プラットフォームは、振動ミクロトームに固定され、切断はよく風邪ACSFで満たされている。冷溶液には、両方の企業の脳を、切削作業中に損傷から保護するかもしれない。異なる脳の領域は、品質のスライスを最適化する寒さの度合いが異なります。視床下部スライスの調製のためのACSFの温度は、通常0℃です。 </li><li>スライスは徐々にカットする必要があり、各スライスは脳から離れて自由にフロートしてください。スライスは、切削時のカールを開始する場合、ブレードが進んでいる速度が遅くなることがあります。一つは、スライスを真っすぐにするために、小さなペイントブラシを使用することができますが、これはスライスのリスクを傷めるおそれがないので、避けるべきである。ゆっくりとブレードの事前の速度は、ペイントブラシを使用してより優先されます。 </li><li>各スライスは脳から切断されると、それはカッティングチャンバから引き出され、温水浴（約32℃）でのスライスのインキュベーションチャンバー内に配置されます。スライスインキュベーターは、連続して95％O 2および5％CO 2の混合物を用いて酸素が ​​供給されている。一般に、プリレコーディングスライスのインキュベーションは、30分から2時間の範囲である。 </li><li>前述のようにガラスピペット（MΩ3-6）垂直プーラーを使用して（9）製造される。引っ張りの温度と持続時間は、ピペットプラー目のものの種類、ガラスのいずれかを入力使用と引き手の加熱フィラメントの寿命に基づいて異なります。ピペットの先端の形状はまた、ユーザの好みによって異なります。我々は、0.1 mmの開口部を均一にテーパ状の先端との良好な成功を達成している。ピペットの大きな開口部が小さい開口部は、長時間録音につながることに失敗しながら神経細胞を損傷する傾向がある。 </li><li>ピペットは、静電容量を減らすためにSylgardでコーティング。プルピペットチップは軽くSylgard 184は第二ピペットを使用してでコーティングされています。 Sylgardedのヒントは、ヒートガンを使用して熱硬化しています。これらのピペットは、バスの灌流液で満たされている。ピペットチップの可視化を向上させるために、アレクサ- 568少量のピペットを充填する前に、ピペット溶液として使用する浴溶液の部分に追加されます。我々はAlexa - 568の重量を量るのではなく、目でソリューションのピンクをオンにするのに十分使用しないでください。ピペットチップは、テキサスレッドフィルターで可視化することができる。 </li><li>我々は、低抵抗のシールを（説明を参照）を使用して活動電位の検出のための現在のクランプ記録を取得するためのアプローチを開発しました。録音はない適用される現在使用して軸索のインストゥルメントの2B Axoclampと細胞の内因性の静止電位で実行されます。しかしながら、低抵抗のシールに、一つだけ2Bアンプで活動電位を検出できませんでした。信号を高めるために、第2増幅器（AMシステムズ3000）Axoclampの2Bと直列に使用されています。このアプローチは、長期的な録音の緩いシールとユーティリティの使いやすさを持っています。技術的に、人は直接それによって電圧クランプ記録モード（説明を参照）のアプローチで問題を回避して、活動電位を測定することができます。 </li><li>一つは、全細胞記録設定のためのアプローチとして、同様の方法で、同時に二つの以前に選択されたニューロンの表面に2つのピペットを取ります。両方のNEへのアプローチ同時にuronsは独立してペアのそれぞれのニューロンを試みるよりもデュアル録音を得ることに成功している。細胞全体の記録のためのアプローチの間に行われているようにこの時間の間に、電流注入パルスが2Bアンプから渡されます。 </li><li>正圧は、先端の目詰まりを防ぐために両方のピペットで維持する必要があります。デュアル録音のための肯定的な圧力は、最高のチューブの部分の長さによってピペットホルダーに取り付けられた充填されていない3ミリリットル空のシリンジを使用して生成されます。注射器を使用することで、1つは、両方のピペットへの圧力を維持することができます。正圧は、すぐにピペットが録音室の浴溶液に配置されているように適用する必要があります。一つは、順番にピペットで選択されたニューロンに近づく。ニューロンの最大の表面上に直接最初のピペットを配置した後、一つの場所に注射器を残すことによって正の保持して、この位置でピペットを残します。一つは、録音室の上部に戻り、位置に第2の記録ピペットを低下させる。選択されたニューロンは、スライスの異なるレベルで、しばしばです。第一ピペットは、スライスと位置で、より表面的なニューロンの第二ピペット深いですニューロンを介して配置する必要があります。これは、ピペットはスライスを入力すると、スライスは垂直面で若干移動するように、第2ピペットの位置をシフトから二番目ピペットの位置を防ぎます。 </li><li>ルースシール（MΩ18〜30）が使用されます。正圧は、それぞれの細胞の表面に小さなくぼみが誘発される。一つは、正圧を解放し、非常にわずかな負圧を印加して、最初のニューロンを封印しようとします。正圧は、注射器を除去することによって解除されます。口による吸引は、チューブの自由端に適用されます。健康的なニューロンの膜は、すぐに正圧のリリースに対応し、ピペットを遵守します。わずかな吸引は、健康な神経細胞の適切な抵抗を持つシールを形成します。 </li> <li>膜は非常にきれいなガラスにシール以来一ニューロンと障害が発生した場合を封印しようとすると、ピペットは再使用できません。その代わりに、人はよく灌流の上に離れてスライスの表面からピペットを（と顕微鏡対物）が発生、バスからピペットを削除する、クリーンなピペットに変更し、別のセルを封止するために試みるようにスライスして返します。 。これらの理由から、それは録音のための複数の潜在的な神経細胞を選択することが重要です。選択可能な以下の4月6日録音品質のニューロンとスライスの場合は、デュアル録音を得るための成功は限られている。 </li><li>抵抗に基づいて、緩いシールを確立した後、2Bアンプからの電流注入パルスが終端されます。 2Bのampliferは、3000シリーズのampliferと直列に配置されています。この構成では、2Bのampliferの出力は、3000シリーズのampliferのための入力として機能します。後者ampliferは、データ取得のための信号を提供します。 </li><li>シール（ステップ4）とamplifersの再構成（ステップ5）、2番目のニューロンごとに繰り返されます。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1678/1678fig1tmb.jpg" alt="図1" border="0" /> 図1の期間は、矢状スライス標本で緩いシール添付の録画設定を使用して、2つのGnRHニューロンの発火を増加した。スライスは、去勢された男性から派生した。それぞれ上向きたわみは活動電位を示している。第二のGnRHニューロンは、断続的なバーストを示す、一方のGnRHのニューロン（上部トレース）がほぼ連続的な発火を示すことに注意してください。単一のGnRHニューロンからの活動のこのパターンは、 生体内でホルモンの分泌（7）中に、マルチユニット記録から抽出された単一のユニットのものと似ています。してください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1678/1678fig1.jpg">ここをクリックして</a>図1の拡大バージョンを参照すること。

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	<li>Silverman, A. J., Knobil, E., Neill, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gonadotropin+releasing-hormone+(GnRH)+neuronal+systems:+immunocytochemistry.">The gonadotropin releasing-hormone (GnRH) neuronal systems: immunocytochemistry.</a> The Physiology of Reproduction. , (1994).</li><li>Freeman, M. E., Knobil, E., Neill, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuroendocrine+control+of+the+ovarian+cycle+of+the+rat.+In:+The+physiology+of+reproduction.">The neuroendocrine control of the ovarian cycle of the rat. In: The physiology of reproduction.</a> The Physiology of Reproduction. , (1994).</li><li>Belchetz, P. E., Plant, T. M., Nakai, Y., Keogh, E. J., Knobil, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypophysial+responses+to+continuous+and+intermittent+delivery+of+hypopthalamic+gonadotropin-releasing+hormone.">Hypophysial responses to continuous and intermittent delivery of hypopthalamic gonadotropin-releasing hormone.</a> Science. 202, 631-633 (1978).</li><li>Maurer, J. A., Wray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luteinizing+hormone-releasing+hormone+quantified+in+tissues+and+slice+explant+cultures+of+postnatal+rat+hypothalami.">Luteinizing hormone-releasing hormone quantified in tissues and slice explant cultures of postnatal rat hypothalami.</a> Endocrinology. 140, 791-799 (1999).</li><li>Harris, G. C., Levine, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pubertal+acceleration+of+pulsatile+gonadotropin-releasing+hormone+release+in+male+rats+as+revealed+by+microdialysis.">Pubertal acceleration of pulsatile gonadotropin-releasing hormone release in male rats as revealed by microdialysis.</a> Endocrinology. 14, 163-171 (2003).</li><li>Sisk, C. L., Richardson, H. N., Chappell, P. E., Levine, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gonadotropin-releasing+hormone+secretion+in+female+rats+during+peripubertal+development+and+on+proestrus.">In vivo gonadotropin-releasing hormone secretion in female rats during peripubertal development and on proestrus.</a> Endocrinology. 142, 2929-2936 (2001).</li><li>Cardenas, H., Ordog, T., O'Byrne, K. T., Knobil, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+unit+components+of+the+hypothalamic+multiunit+electrical+activity+associated+with+the+central+signal+generator+that+directs+the+pulsatile+secretion+of+gonadotropic+hormones.">Single unit components of the hypothalamic multiunit electrical activity associated with the central signal generator that directs the pulsatile secretion of gonadotropic hormones.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 9630-9634 (1993).</li><li>Silverman, A. J., Wilson, R., Kesner, J. S., Knobil, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothalamic+localization+of+multiunit+electrical+activity+associated+with+pulsatile+LH+release+in+the+rhesus+monkey.">Hypothalamic localization of multiunit electrical activity associated with pulsatile LH release in the rhesus monkey.</a> Neuroendocrinology. 44, 168-171 (1986).</li><li>Roberts, C. B., O'Boyle, M. P., Suter, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrites+determine+the+contribution+of+after+depolarization+potentials+(ADPs)+to+generation+of+repetitive+action+potentials+in+hypothalamic+gonadotropin+releasing-hormone+(GnRH)+neurons.">Dendrites determine the contribution of after depolarization potentials (ADPs) to generation of repetitive action potentials in hypothalamic gonadotropin releasing-hormone (GnRH) neurons.</a> J Comput Neurosci. 26, 39-53 (2009).</li><li>Spergel, D. J., Kruth, U., Hanley, D. F., Sprengel, R., Seeburg, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA-+and+glutamate-activated+channels+in+green+fluorescent+protein-tagged+gonadotropin-releasing+hormone+neurons+in+transgenic+mice.">GABA- and glutamate-activated channels in green fluorescent protein-tagged gonadotropin-releasing hormone neurons in transgenic mice.</a> J Neurosci. 19, 2037-2050 (1999).</li><li>Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+longitudinal+study+of+estrous+cyclicity+in+aging+C57BL/6J+mice:+I.+Cycle+frequency,+length+and+vaginal+cytology.">A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology.</a> Biol Reprod. 27, 327-339 (1982).</li><li>Gee, D. M., Flurkey, K., Finch, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+the+regulation+of+luteinizing+hormone+in+C57BL/6J+mice:+impaired+elevations+after+ovariectomy+and+spontaneous+elevations+at+advanced+ages.">Aging and the regulation of luteinizing hormone in C57BL/6J mice: impaired elevations after ovariectomy and spontaneous elevations at advanced ages.</a> Biol Reprod. 28, 598-607 (1983).</li><li>Anson, B. D., Roberts, W. M., Walz, W., Boulton, A. A., Baker, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loose-patch+voltage-clamp+technique.">Loose-patch voltage-clamp technique.</a> Neuromethods, Patch-clamp analysis: Advanced techniques. 35, 265-286 (2002).</li><li>Calabrese, B., Tabarean, T., Juranka, P., Morris, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitivity+of+N-type+calcium+channel+currents.">Mechanosensitivity of N-type calcium channel currents.</a> Biophys J. 83, 2560-2574 (2002).</li><li>Higure, Y., Katayama, Y., Takeuchi, K., Ohtubo, Y., Yoshii, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+killing+of+single+neurons+by+irradiation+of+intracellularly+injected+dye.">Rapid killing of single neurons by irradiation of intracellularly injected dye.</a> Science. 206, 702-704 (1979).</li><li>Higure, Y., Katayama, Y., Takeuchi, K., Ohtubo, Y., Yoshii, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lucifer+Yellow+slows+voltage-gated+Na++current+inactivation+in+a+light-dependent+manner+in+mice.">Lucifer Yellow slows voltage-gated Na+ current inactivation in a light-dependent manner in mice.</a> J Physiol. 550, 159-167 (2003).</li></ol>

GnRHニューロン（ホルモンの分泌に基づく）を含むいくつかのニューロンへの関心の活動は、時間の時間スケール（5-7）で発生します。したがって、全体のセル構成は、全細胞記録モードでの細胞内メッセンジャーの透析に起因するいくつかの実験的な目標のための最良の選択ではありません。二次的に、全細胞記録は、一般的に年齢の約120日未満の動物に制限されています。加齢とともに、神経細胞膜は高抵抗のシールを達成することが困難になり、堅くように見えます。さらに、一方のパッチがピペットと膜の間の穴を残して、シールを破壊する破裂、高抵抗のシールを取得します。これにより、使用不能の記録と迅速イオン不均衡が原因で死亡するニューロンにつながります。定期的な卵巣周期、および従って、GnRHのパルス発生器の安定的な活動は、その後の人生で（C57BL6女性の年齢の70から10ヶ月、11、12）まで発生していないものが合理的に細胞全体の記録を得ることが予想できるときに年齢を超えて、確実に。最後に、細胞全体の記録は、内部と外部のイオン濃度の内因性比を破壊する。全細胞記録と、どんなイオンの内部濃度は、 ピペット溶液中のイオンの濃度に等しい。 /は、セルの比較的小規模な内因性のボリュームを置き換えるとピペット溶液が比較的大量に迅速に平衡に達するためです。 緩いセル添付のアプローチは、全細胞記録の多くの制限を回避することができます。最初に、低抵抗のシール（MΩ15〜30）を使用することができます。これらは、さらに古い動物から神経細胞で形成することが比較的容易です。第二に、1は破裂膜の密封されたパッチをしません。したがって、緩いセル添付の録音は技術的に細胞全体の録音よりもはるかに簡単です。さらに、細胞膜が無傷であるため、細胞内成分の透析は発生しませんし、内因性のイオン比率が保持されます。一つは、シナプス電流を研究するための緩いセル添付のアプローチを使用することはできませんが、比較的非侵襲的に神経細胞からの長期的な録音に最適です。セルに接続された録音は、またピペット内の任意の標準的な細胞内液を用いて行うことができます。これは、長期の記録が完了すると、膜のパッチを破壊し、細胞内のマーカーでニューロンを標識する付加的な利点を提供しています。 緩い細胞添付アプローチは、 電圧クランプ記録モードで使用されています。しかし、緩いセル接続構成の電圧クランプ記録は、いくつかの手法上の問題があります。最初に、記録された信号は、活動の間接的な尺度です。 （いわゆるアクション現在のように）測定される信号は、 膜 （13） 充電する容量性の電流である。これは非常に重要な方法論の問題です。記録ピペットの容量と抵抗値が記録された信号をフィルタリングすることができます。それは、小さなアクションの電流が原因でヘッドステージの高抵抗に、適切に、ほとんどのアンプで補償することができない、ピペットの容量を充電するに失われる可能性が非常に高いです。これらの信号が検出されないままとする場合、ニューロンの見かけの発火パターンは、真の発火パターンを反映していません。同様に、補正されていないピペットとシールの抵抗は、このようなアクションの流れが表現されている場合など、変化（13）中の測定で大きな誤差を引き起こす。一部のアンプは、信号の損失を制限するピペットやシール、のための静電容量と抵抗&quot;補償&quot;を提供していますが、ほとんどのアンプの高抵抗ヘッドのステージは、最適な補償を妨げる。第二に、人工的な状況は、セルに課されている。電圧クランプモードでは、細胞膜の周辺には固定電位、これらの研究では、0 mVに保持されます。これは、細胞膜に適用される電流は存在しないという意味ではありません。電圧クランプで測定された信号は、実際には固定電位を維持するために膜に印加される電流の量です。したがって、この印加電流は、細胞の活動を変更することができます。 GnRHのシステムでのデュアル録音は特にGnRHニューロンとそれらの拡散分布の限られた数のために挑戦しています。デュアルレコーディングを成功させるには、マニピュレータは非常に安定している必要があります。電極のわずかな動きがニューロンから滑り落ち、録音を終了するにはピペットを引き起こす可能性があります。また、セル上にピペットの動きは（例えば、再配置の動きを補償するために）発火パターンを変更することができます。いくつかのイオンチャネルは、N型カルシウムチャネルは、機械的に敏感です：膜のストレッチは、全細胞と細胞接着型の記録の構成（14）の両方で反復的な活動を引き起こす。最後に、マニピュレータシステムは、非常に細かいと滑らかな動きに対応していなければなりません。デュアル録音で、前述のように、人は同じ時間と封印しようとする試みでいた2つの選択されたニューロンの表面に2つのピペットを取ります一つのニューロン。成功した場合は、一方の試みは、番目のセルをシールする。一般に、人はすべての試行で高品質の録音を密封していることを期待することはできません。これは、しかし、二重録音で、特定の問題を作成します。一方が、ニューロンと成功するが、2番目で失敗した場合、一つはピペットを変更し、別のセルを試みる必要があります。したがって、人は成功した密閉ニューロンを中断することなく、よく灌流（ピペットを変更する）の上に顕微鏡の浸対物レンズとピペットの両方を移動できるようにする必要があります。 デュアル録音のための緩いセルに接続されたアプローチの私たちの開発と利用は、GnRHニューロンを研究する上で主要な技術的な進歩です。それは、メカニズムが拍動性ホルモンの分泌の結果という協調活動の根底にあるものの重大な問題の文脈で前方にフィー​​ルドを移動するのに役立つ有用な結果を生成する可能性があります。

dual somatic recordings from gonadotropin-releasing hormone (gnrh) neurons identified by green fluorescent protein (gfp) in hypothalamic slices

ゴナドトロピン放出ホルモン（GnRH）は、黄体形成ホルモン（LH）と卵胞刺激ホルモン（FSH）の下垂体放出を制御する小さな神経ペプチドである。これらの性腺刺激ホルモンは生殖機能の調節に不可欠です。 GnRHの含有ニューロンは、彼らは下垂体ポータルシステム（1）にその軸索末端からのGnRHの放出正中隆起に視床下部と、プロジェクト全体にびまん性に分布している。ポータル毛細血管では、GnRHは全身循環に性腺刺激ホルモンの放出を刺激する脳下垂体前葉に移動。 GnRHの放出は連続ではなく、むしろエピソードパルスで発生します。それは、GnRH放出の断続的な方法は、再生（2、3）のために不可欠であることが十分に確立されている。 複数のおそらくのGnRHニューロンの基礎となるのGnRHのパルスの活動の調整。 GnRHニューロンの合計ペプチドの含有量は30％のカスタマーが、おそらく放出可能プールで構成され、そのうち、約1.0 PG /セル（4）です。パルス中のGnRHのレベル（5,6）は、複数のGnRHニューロンは、おそらく神経分泌に関与している示唆している。同様に、LH放出時の視床下部のマルチユニット記録から抽出された単一ユニットの活動は、複数のニューロンの活動の変化（7）を示している。 LHパルスの間に記録された活性を有する電極がGnRHのsomaの複数形や繊維（8）のいずれかと関連付けられます。したがって、少なくともこの活動の一部は、GnRHニューロンから生じます。 メカニズムは視床下部のGnRHニューロンの同期発火にその結果が不明です。 GnRHニューロンの発火の調整メカニズムを解明することは複雑な問題です。最初に、GnRHニューロンは数の比較的少ないです。げっ歯類では、800-2500 GnRHニューロンがあります。それはすべてのGnRHニューロンは、エピソードのGnRH放出に関与していることは明らかではない。また、GnRHニューロンは、びまん性（1）配布されます。これは、焼成の調整の我々の理解を複雑にしており、多くの技術的アプローチが手に負えないてきた。私たちは、活動電位の直接検出のための電流クランプモードでゆるいセルに接続されたレコーディングを最適化し、GnRHニューロンのペアからの同時録画を可能にする記録的なアプローチを開発しました。

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Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone GnRH Neurons Identified by Green Fluorescent Protein GFP in Hypothalamic Slices

神経系の活動は、しばしば特定の集団内のニューロンからの同期活動電位放電を必要とします。例えば、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（GnRH）のパルスはおそらくGnRHニューロンの間で協調活動を必要とする。我々は確実にびまん性に分布GnRHニューロンからの同時電気生理学的記録を得るために私たちの方法論的アプローチを提示する。

視床下部スライスに緑色蛍光タンパク質（GFP）によって識別されるゴナドトロピン放出ホルモン（GnRH）ニューロンから二重の体細胞の録音

Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) is a small neuropeptide that regulates pituitary release of luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating ...

dual-somatic-recordings-from-gonadotropin-releasing-hormone-gnrh

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neurons Identified by Green Fluorescent Protein (GFP) in Hypothalamic Slices

22.1K ビュー.  University of Texas San Antonio - UTSA. 神経系の活動は、しばしば特定の集団内のニューロンからの同期活動電位放電を必要とします。例えば、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（GnRH）のパルスはおそらくGnRHニューロンの間で協調活動を必要とする。我々は確実にびまん性に分布GnRHニューロンからの同時電気生理学的記録を得るために私たちの方法論的アプローチを提示する。

ビデオ: Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone GnRH Neurons Identified by Green Fluorescent Protein GFP in Hypothalamic Slices

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

暗順応スライス標本におけるマウス網膜神経細胞からパッチクランプ記録

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

神経科学

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

同定されたニューロンと摂食行動からカルシウム信号の同時記録キイロショウジョウバエ</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

逆行性蛍光標識は、特定された神経細胞から標的細胞外シングルユニット記録を可能にします<em生体内で&gt;</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

視床下部マウス脳スライスのGFPタグニューロンにおけるイメージングカルシウム応答

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

急性海馬スライスにおけるシナプス誘発アストログリアとニューロン活動の二重の電気生理学的記録

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

トランスジェニックフィッシュの無傷の脳内で識別ニューロンからの電気的活動を記録する

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Morphologically-と神経化学的に特定し海馬介在ニューロンからホールセルパッチクランプ記録

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

器官型海馬スライスにおけるペア全細胞記録

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

脳スライスにおける全細胞パッチクランプ記録

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

黒質ドーパミンニューロンの細胞体樹状突起のドメインからの亜細胞パッチクランプ記録

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...