この方法により、天然および人工の多孔質媒体のバイオフィルム発生に対する細孔径と流量の影響を体系的に研究することができ、それによって多孔質媒体のバイオクラッシングの基本的なメカニズムを解明することができます。この技術の主な利点は、変更の最高の空間的および時間的解像度、およびさまざまな実験条件および要件へのプラットフォームの適応性です。実験の3時間前に顕微鏡のボックスインキュベーターの電源を入れて、摂氏25度の安定した温度を確保することから始めます。
入口チューブと出口チューブをマイクロ流体デバイスに接続します。外径0.6ミリメートルの針をインレットチューブに挿入して、チューブとシリンジの接続を固定します。マイクロ流体デバイス、30ミリリットルの脱イオン水、および30ミリリットルの培養液を真空デシケーターに入れ、少なくとも1時間脱気します。
完了したら、培養液と脱イオン水を2つの別々の30ミリリットルシリンジにゆっくりと引き込みます。次に、マイクロ流体デバイスを顕微鏡に取り付け、出口チューブを廃棄物容器に入れます。脱イオン水で満たされたシリンジをマイクロ流体チューブを介してマイクロ流体チャネルに接続し、圧力センサーの出口から出るまでゆっくりと水を注入します。
圧力センサーに水を入れ、マイクロ流体チャネルと圧力センサーを接続するチューブからすべての気泡を洗い流します。圧力センサー専用のネジで圧力センサーの出口を閉じます。マイクロ流体チャネルの残りの部分を脱イオン水で満たします。
次に、1.2マイクロメートルのフィルターを培地シリンジに置きます。ウォーターシリンジを取り外し、シリンジを入口マイクロ流体チューブに慎重に接続します。シリンジポンプにシリンジを取り付けた後、チャネルを培養液で毎時2ミリリットルの流量で1時間洗い流します。
その後、実験中にシリンジポンプを希望の流量に設定し、圧力センサーの圧力読み取り値をゼロに設定します。次に、光学密度0.1のバチルス・サブチルスNCIB 3610培養物を1.5ミリリットルの遠沈バイアルに600ナノメートルの波長でピペットで入れた。細菌培養物をマイクロ流体チャネルにロードするには、出口チューブを遠心分離機バイアルに入れ、チューブの出口から潜在的な気泡を取り除くために5分間待ちます。
完了したら、マイクロ流体チャネルが細菌培養物で満たされるまで、1時間あたり1ミリリットルの流速で150マイクロリットルの細菌溶液を回収します。次に、培地シリンジフィルターを慎重に取り外し、出口を廃棄物容器に入れます。細菌細胞をマイクロ流体チャネル内のゼロフロー条件で3時間放置し、多孔質媒体に表面を付着させます。
実験を開始するには、シリンジポンプを希望の流量に設定してフローを開始し、1ヘルツで圧力読み取りを開始してから、目的の時間間隔、光学構成、および倍率で成長するバイオフィルムの画像を取得します。バイオフィルム形成過程は明視野顕微鏡を用いて可視化され、細菌細胞とバイオフィルムがより暗いピクセルとして画像に現れた。24時間の実験中に、最初はランダムに成長したバイオフィルムが多孔質媒体のほぼ全体にコロニーを形成しました。
バイオフィルムの表面被覆率は、20時間で最大孔径よりも最小孔径で10%速く発生しました。バイオフィルムの表面被覆率と圧力上昇の相関は、細孔サイズの小さいマイクロ流体チャネルの目詰まりが、大きな細孔サイズよりも入口と出口の間の圧力差が大きいことを示しました。覚えておくべき最も重要な側面は、温度が安定した環境で実験を実行し、気泡の形成を避けるためにマイクロ流体デバイスと溶液を十分に脱気することです。
この方法により、流量と細孔径の影響に関して、工業用および天然の多孔質媒体の両方におけるバイオフィルム成長の基本的なメカニズムを体系的に解明することができます。
