<img src="/files/ftp_upload/1746/1746fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。パパインとシスタチンB複合体（青）（黄）の三次元構造。変異シスタチンBの残基は赤で表示されます。 1。ビアコアシステムを用いたラベルフリー相互作用解析の原理ビアコアシステムを用いた典型的なラベルフリーの結合実験では、生体分子は、&quot;配位子が&quot;センサーチップの表面に取り付けられていると呼ばれる。フローチャネルのシステムでは検出が行われるチップ表面に接触する、&quot;分析物&quot;と呼ばれるその結合パートナーを、もたらす。分析物がリガンドに結合すると、表面での質量の蓄積の結果としての変化は、表面プラズモン共鳴（SPR）により検出される。 SPRの応答は、結合分析物の量に比例します。 バインディングがリアルタイムで測定されるため、特定の相互作用の速度論的会合および解離速度定数を決定することができます。これらの定数から、それは一定の平衡解離と親​​和性を計算することが可能です。それは、定常状態のデータバインディングの親和性を計算することも可能です。同様の方法論はまた、特に表面にリガンドに結合するタンパク質の濃度を決定するために使用することができます。 2。タンパク質 - タンパク質相互作用の動力学的特性の分析ビアコアX100では、速度論的解析は、シングルサイクルカイネティクスを使用して実行することができます。シングルサイクルカイネティクスの実験では、分析物の濃度系列は、注射の間に表面の再生をすることなく、単一の分析サイクルに注入されます。それは適切な再生条件を見つけることが困難な場合そのため、シングルサイクルカイネティクスは、動態解析を可能にします。 運動実験のデータが収集されたら、ビアコアX100の評価ソフトウェアは、相互作用モデルにデータをフィッティングすることによりK A、K D、およびK Dの値を生成します。 3。タンパク質濃度を測定するためのアプローチ生体分子間の相互作用を分析すると、その機能を理解する上で重要である。核酸に、他のタンパク質へのタンパク質の結合を特徴づける、または小分子には、生化学研究の基本となるものである、と創薬を含む他の多くの分野での使用を検出します。 対話する2つのタンパク質間の相互作用のカイネティクスの正確な測定のためには、検体として使用される実験サンプルに特異的に結合するタンパク質の濃度を知ることが不可欠です。 280やのような比色アッセイの分光光度計の読みは、ブラッドフォード試薬を採用するものが一般的に総タンパク質濃度を決定するために使用されます。しかし、タンパク質の不純物は、結果に影響を与えます。さらに重要なことは、タンパク質の両方のアクティブおよび非アクティブなフォームは、総タンパク質濃度に含まれています。特に誤った折り畳みに起因する非アクティブになる可能性があります換えタンパク質の場合には、サンプル中の特異的結合タンパク質の割合を決定することが重要です。 ビアコアX100で、特異的結合活性に関連する濃度は、いずれかの既知の標準から派生した検量線との結合反応のレベルの比較によって、以上の最近導入された方法論キャリブレーションフリーの濃度分析（シミュレーションプロジェクト）を使用して決定することができます。シミュレーションプロジェクトでは、標準に依存しません。したがって、シミュレーションプロジェクトでは、基準が通常利用できないタンパク質の変異体を、勉強の場合に特に便利です。 シミュレーションプロジェクトの実験では、初期結合率は、チップ表面へのサンプルの拡散が律速される条件下での異なる流量で測定されます。分析物の拡散係数、初期結合速度の1,2から特異的結合濃度を計算するときに、フローセルと流量の大きさが考慮されます。 動力学の実験では、分析物の濃度は、運動の会合速度定数と実験データから親和性の計算に使用されています。シミュレーションプロジェクトとビアコアシステムの動力学的測定は、両方とも同じ相互作用の性質に依存しています。したがって、ビアコア分析によって決定される特異的な結合の濃度ではなく、総タンパク質濃度を使用して、結果の信頼性を向上させます。 4。シスタチンBと​​パパインの相互作用を特徴づけるビアコア分析を使用して、 哺乳類シスタチンBはこれらのタンパク質は、主にnonsに関与している主にパパインのようなシステインプロテアーゼ、カテプシンB、H、K、LとSの可逆的、競争とタイト結合蛋白質の阻害剤です。選択科目細胞内タンパク質分解。 Cystatinsは、これらの酵素によって不適当なタンパク質分解から細胞や組織を保護するためと推定されています。彼らはまた、寄生虫やウイルスからシステインプロテイナーゼを不活性化し、そのような感染性病原体の侵入に対する防御に参加することができます。さらに、cystatinsは頻繁に構造機能研究におけるモデル酵素として使用されるパパインのようないくつかの植物のシステインプロテイナーゼを、抑制する。 N -およびC末端二ヘアピンループ（によって提供される、阻害剤の側から、2つのタンパク質間相互作用は疎水性接触によって支配されているパパイン3に示すように、とシスタチンBの複合体の三次元構造図1）。本研究では、我々は、C -末端の重要性とパパインの相互作用の分野で点突然変異を含むウシシスタチンBのバリアントを使用してパパインにバインドするためのシスタチンBの第二の結合ループを調べます。我々は、最初の特異的結合使用される4つのシスタチンBの亜種の濃度だけでなく、野生型タンパク質のことを決定する。アクティブシスタチンBの特異的結合濃度が決定されると、野生型およびパパインへの結合シスタチンBの突然変異体の速度と親和性定数はBiacore X100を使用して測定する。 5。楽器と試薬<ol><li>シスタチンBの亜種はCys3Ser/His75Gly、Cys3Ser/Leu73Gly、Cys3Ser/Tyr97AlaとCys3Serは、前述の4として生産されています。すべての変異体は、シスタチンBのジスルフィド結合不活性な二量体の形成を防止するため、位置3番目のセリン、システインの追加の置換が含まれています</li><li>パパインのターゲットは、前述の5として用意されています。それは、プロテアーゼは触媒的に不活性レンダリング、アクティブ溝にCys25に接続されたメチルチオ基を有するS -（メチルチオ）パパイン（MMTS -パパイン）です。 </li><li>ビアコアX100プラスパッケージとビアコアX100は、特異的結合の濃度と結合速度を測定し解析するために使用されます。 </li><li> MMTS -パパインはBiacoreアミンカップリングキットを使用してセンサーチップCM5に固定化されている。 </li><li>ランは、25℃で行われ、バッファは、pH7.4の0.01 MのHepes、0.15MのNaCl、0.0034 M EDTA、および0.05％ポリソルベート20ですされています。 </li><li>シスタチンBの各バリアント間、センサー表面を10μl/分の流量で30秒間の20mM NaOHで再生成されます。 </li></ol>リガンドMMTS -パパインの6.Immobilization シミュレーションプロジェクト分析のためのMMTS -パパインの共有結合シミュレーションプロジェクトでは、速度が表面に検体分子の拡散（大量輸送の制限）によって制限される条件下では結合率の測定に依存しています。これは、リガンドの高い固定化レベルで愛用されています。 MMTS -パパインの固定化を設定し、ビアコアX100 Controlソフトウェアの固定化ウィザードを使用して実行した。 <ol><li> 10μL/分の流量で7分間スクシンイミド（NHS）とカルボジイミド（EDC）の混合物の注入により、フローセル2の表面を活性化する。フローセル1を基準面として使用するために変更されません。 </li><li> 5μl/分の流量で15分間pH4.5中で酢酸ナトリウム緩衝液に50μg/mlでMMTS -パパインを注入する。 </li><li>エタノールアミンは、残りの活性エステルを無効にするには10μL/ minの流量で7分間噴射される。 </li></ol>全体のカップリング方法は、フローセル2に固定化〜3000 RU MMTS -パパインになるはずです。 動態解析のためのMMTS -パパインの共有結合同じ手順は、速度論的解析では、固定化のレベルが拡散によって制限になって結合率を避けるために低くする必要があることを除いて、実際の速度論的解析のためにMMTS -パパインの固定化に使用されます。フローセル1を基準面として使用するためにもこのステップで変更されません。 <ol start="4"><li> 7.1のようにNHSとEDCの混合物で表面の活性化した後、MMTS -パパインは、50秒のために1μg/mlので注入される。その後、表面は、ステップ7.3のようにエタノールの注入で非アクティブ化されます。 </li></ol>カップリングするノイズレベルは、この手順の後に約50 RUでなければなりません。 7。シミュレーションプロジェクトのアッセイを使用してシスタチンBの濃度の決定<ol><li>シミュレーションプロジェクトの実験はBiacore X100をプラスパッケージのシミュレーションプロジェクトウィザードに従って設定されています。約10nmの蛋白質は10〜100μL/分48秒重複の流量で注入されます。表面は各サイクルの間に20 mMのNaOHで再生成されます。 </li><li>各流量のための空白の注射などがあります。 </li><li>タンパク質濃度は、その後、目を使ってデータバインディング（図3）から決定されますビアコアX100プラスパッケージの評価版ソフトウェアの電子シミュレーションプロジェクトの評価機能。 <img src="/files/ftp_upload/1746/1746fig2.jpg" alt="図2" /> 図2野生型シスタチンBの特異的結合濃度データのシミュレーションプロジェクトの分析からの結果が10と100μL/分の流量で得られたセンサーグラムから抽出された。 <img src="/files/ftp_upload/1746/1746fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。280測定（N = 3）とシミュレーションプロジェクト（N = 2）を用いて決定した変異体の濃度は、。標準エラーは、エラーバーで示されます。 （6）で説明されているようにモル吸光係数を算出した。二つの方法によって決定されるCys3Ser/Leu73Gly変異体の濃度の値には大きな差が観察することができます。 </li><li>シミュレーションプロジェクトでその280の測定によって決定された濃度を比較するとき、それは（図3）ほとんどの場合、タンパク質が完全にアクティブな間、Cys3Ser/Leu73Glyバリアントのために、活性タンパク質の割合が非常に低いことは明らかである。下の表は、280で合計濃度に関連したシスタチンBの亜種の活動を示しています。 <table border="0"><tbody><tr><td>サンプル</td><td> 280（％）との関係でシミュレーションプロジェクト</td></tr><tr><td>野生型</td><td> 94 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/His75Gly </td><td> 101 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/Leu73Gly </td><td> 9 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/Tyr97Ala </td><td> 99 </td></tr><tr><td> Cys3Ser </td><td> 83 </td></tr></tbody></table></li></ol> 8。パパインに結合シスタチンBの動態を測定<ol><li>シミュレーションプロジェクトの測定値に基づいて、2.5からシスタチンBの変異体のそれぞれに40 nmの範囲の2倍の濃度系列を調製する。 </li><li>動力学の実験は、単一サイクルのアプローチでビアコアのX100に速度ウィザードを使用して設定されています。表面は、注射の間に再生成されますが、各分析サイクルの終了後に再生溶液として20mMのNaOHを使用していません。 </li><li>サンプルを含む各サイクルは、バッファの代わりにサンプルを注入したブランクサイクル、によって挟まれるように実験を設定します。 </li><li>自動的に参照の空白の減算を実行するにはビアコアX100の動態の評価機能を使用するには、1:1の対話モデルを取り付ける場合は、その前に、データを減算。 </li><li>パパインにシスタチンB変異体の結合のために得られた実験データを図4に示されています。以下の表は、会合と解離の速度定数と反応速度解析で得られた平衡解離定数をまとめたものです。 <table border="0"><tbody><tr><td>サンプル</td><td> K A（M -1 s -1と ） </td><td> K D（S -1） </td><td> K D（M） </td></tr><tr><td>野生型</td><td> 1.8 × 10 6 </td><td> 0.41 × 10 -3 </td><td> 2.3 × 10 -10 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/His75Gly </td><td> 1.1 × 10 6 </td><td> 1.7 × 10 -3 </td><td> 1.5 × 10 -9 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/Leu73Gly </td><td> 1.1 × 10 6 </td><td> 23 × 10 -3 </td><td> 2.2 × 10 -8 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/Tyr97Ala </td><td> 1.7 × 10 6 </td><td> 12 × 10 -3 </td><td> 7.1 × 10 -9 </td></tr><tr><td> Cys3Ser </td><td> 0.9 × 10 6 </td><td> 0.53 × 10 -3 </td><td> 5.8 × 10 -10 </td></tr></tbody></table> <img src="/files/ftp_upload/1746/1746fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。MMTS -パパインに結合シスタチンBの変異体の動力学的プロファイルは、シングルサイクルカイネティクスを使用して決定。センサーグラムは空白と表示基準は、黒で重ねて1時01相互作用モデルのための運動フィットとデータを減算。 </li><li>変異体の組合率は野生型のタンパク質（図5、上のパネル）に匹敵するものですが、変異体の解離速度定数は平衡解離の増加に対応し、大きさの近い2桁高くすることができます定数（図5、下のパネル）。 <img src="/files/ftp_upload/1746/1746fig5.jpg" alt="図5" /> 図5は。率と親和性定数の計算は、シミュレーションプロジェクトから得られた濃度に基づいていた。変異と関連するK A、K dおよびK D、の変化がグラフに示されている。 </li><li>試料濃度は実験データから一定の会合速度の計算のパラメータなので、それはそれが正しいことが重要。代わりにシミュレーションプロジェクト280の測定に基づいて濃度を使用すると、Leu73、交換は他のシスタチンBの亜種に比べ約10倍遅く協会につながると思われる会合速度、のために重要であるという結論につながる。しかし、シミュレーションプロジェクトで測定された特異的結合濃度はこの場合の総タンパク質の約10％です。これは考慮に入れ、これを取られるとき、それはLeu73のための会合速度が他の変異体のそれに似ていることが明らかになる。したがって、シミュレーションプロジェクトは、このように相互作用のメカニズムの適切な解釈を可能に作るK AとK Dの正しい評価が可能になります。 </li></ol>

<ol>
	<li>Christensen, L. L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theoretical+analysis+of+protein+concentration+determination+using+biosensor+technology+under+conditions+of+partial+mass+transport+limitation.">Theoretical analysis of protein concentration determination using biosensor technology under conditions of partial mass transport limitation.</a> Anal. Biochem. 249, 153-164 (1997).</li><li>Sigmundsson, K., M&#226;sson, G., Rice, R., Beauchemin, N., &#214;brink, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+active+concentrations+and+association+and+dissociation+rate+constants+of+interacting+biomolecules:+an+analytical+solution+to+the+theory+for+kinetic+and+mass+transport+limitations+in+biosensor+technology+and+its+experimental+verification.">Determination of active concentrations and association and dissociation rate constants of interacting biomolecules: an analytical solution to the theory for kinetic and mass transport limitations in biosensor technology and its experimental verification.</a> Biochemistry. 41 (26), 8263-8276 (2002).</li><li>Stubbs, M. T., Laber, B., Bode, W., Huber, R., Jerala, R., Lenarcic, B., Turk, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+refined+2.4+A+X-ray+crystal+structure+of+recombinant+human+stefin+B+in+complex+with+the+cysteine+proteinase+papain:+a+novel+type+of+proteinase+inhibitor+interaction.">The refined 2.4 A X-ray crystal structure of recombinant human stefin B in complex with the cysteine proteinase papain: a novel type of proteinase inhibitor interaction.</a> EMBO J. 9 (6), 1939-1947 (1990).</li><li>Pol, E., Bj&#246;rk, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+second+binding+loop+and+the+C-terminal+end+of+cystatin+B+(Stefin+B)+for+inhibition+of+cysteine+proteinases.">Importance of the second binding loop and the C-terminal end of cystatin B (Stefin B) for inhibition of cysteine proteinases.</a> Biochemistry. 38 (32), 10519-10526 (1999).</li><li>Bj&#246;rk, I., Pol, E., Raub-Segall, E., Abrahamson, M., Rowan, A. D., Mort, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+changes+in+the+association+and+dissociation+rate+constants+for+binding+of+cystatins+to+target+proteinases+occurring+on+N-terminal+truncation+of+the+inhibitors+indicate+that+the+interaction+mechanism+varies+with+different+enzymes.">Differential changes in the association and dissociation rate constants for binding of cystatins to target proteinases occurring on N-terminal truncation of the inhibitors indicate that the interaction mechanism varies with different enzymes.</a> Biochem. J. 299, 219-225 (1994).</li><li>Pace, C. N., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G., Gray, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+measure+and+predict+the+molar+absorption+coefficient+of+a+protein.">How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein.</a> ProteinScience. 4 (11), 2411-2423 (1995).</li></ol>

著者はこの記事で使用する試薬や器具を生成するGEのヘルスケアで採用されている。

この作業では、4つの変異体と野生型シスタチンBは、シスタチンBと​​パパインの相互作用のための第二の結合ループとC末端の重要性を評価するために生産された。本研究では優位性と特異的結合濃度を決定し、構造と機能の関係を理解するために、タンパク質 - タンパク質相互作用の動態を解析するBiacoreのX100を使用しての使いやすさを示した。我々は、総タンパク質濃度の測定はこの場合には結合親和性と速度の決定に大きな測定誤差を導入する結合活性を、減少しているタンパク質変異体を明らかにしないことを示した。シスタチンBの亜種の特異的結合濃度はBiacore X100をとシミュレーションプロジェクトを使用して測定した。動態解析への入力としてシミュレーションプロジェクトで濃度測定を使用することにより相互作用のメカニズムの右の解釈を可能にする、信頼性の高い率との親和性定数をもたらした。 kはわずかに影響を受けたのに対し、変異体の減少親和性は、ほぼ独占的に増加したK D -値によるものであった。この動作は、2番目の結合ループ領域とC末端の両方がパパインに対する阻害剤の結合率のために重要ではないことを示しています。その代わり、彼らは主に複合体が形成された後、酵素に添付された阻害剤を保つことによって結合親和性に寄与する。

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Biacore&trade; X100 System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1100-73</td>
<td><a href="http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html">http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Biacore&trade; X100 Plus Package</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1007-98</td>
<td><a href="http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html">http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Sensor Chip CM5</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1000-14</td>
<td><a href="http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html">http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Amine Coupling Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1000-50</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acetate buffer pH 4.5, 50 ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1003-50</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HBS-EP+ buffer 10X, 4 x 50 ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1008-26</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic Vials &Oslash; 11 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1002-87</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rubber caps, type 2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1004-11</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

the importance of correct protein concentration for kinetics and affinity determination in structure-function analysis 

本研究では、我々は、ビアコアのX100を使ってリアルタイムラベルフリー解析により、ウシのシステインプロテアーゼ阻害剤のシスタチンBと​​パパイン（図1）、植物のシステインプロテアーゼの触媒的不活性型との間の相互作用を探る。パパインとの相互作用の分野での点突然変異を持ついくつかのシスタチンBの亜種は、生産されています。各シスタチンBのバリアントのために我々は、キャリブレーションフリーの濃度分析を用いてその特異的結合濃度（シミュレーションプロジェクト）を決定し、によって決定される総タンパク質濃度で得られた値を比較する<sub&gt; 280</sub&gt;。その後、パパインに結合する各シスタチンBの変異の速度は、シングルサイクルカイネティクス（SCK）を使用して測定されます。私達は私達が調べるfourシスタチンBの亜種の一つが結合にのみ部分的にアクティブであることを示します。シミュレーションプロジェクトで明らかにこの部分の活動は、会合速度定数の有意差に変換されます（<em&gt; K</em<sub&gt;</sub&gt;）と親和性（<em&gt; K</em<sub&gt; D</sub&gt;）、総タンパク濃度を用いて計算した値と比較する。構造機能研究における動態解析と組み合わせてシミュレーションプロジェクトを使用すると、信頼性の高い結果を得ることに貢献し、相互作用のメカニズムの右の解釈を行うことができます。

Watch this Scientific Journal Video about The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis at JoVE.com

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

我々は、ラベルフリーの動力学的特性によってパパインには、いくつかのシスタチンBの変異体の結合の構造機能解析のためのビアコアのX100を使用してタンパク質相互作用解析を適用する。キャリブレーションフリーの濃度分析（シミュレーションプロジェクト）は、検量線を必要とせずに保持結合活性を有するタンパク質の濃度を測定する。我々はシミュレーションプロジェクトを使用して濃度のその確認は、動態解析の信頼性を高め、速度定数が確実に組換えタンパク質の活性が低下している場合でも決定できることを示している。

速度論と構造機能解析のアフィニティ定量のための適切なタンパク質濃度の重要性

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

the-importance-correct-protein-concentration-for-kinetics-affinity

Research

JoVE Journal

Biology

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

20.4K ビュー.  GE Healthcare Bio-Sciences AB. 我々は、ラベルフリーの動力学的特性によってパパインには、いくつかのシスタチンBの変異体の結合の構造機能解析のためのビアコアのX100を使用してタンパク質相互作用解析を適用する。キャリブレーションフリーの濃度分析（シミュレーションプロジェクト）は、検量線を必要とせずに保持結合活性を有するタンパク質の濃度を測定する。我々はシミ...

ビデオ: The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

光度計2000C分光光度計を使った微量タンパク質の濃度測定

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

生物学

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purification of the &lt;em&gt;M. magneticum&lt;/em&gt; Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&amp;Delta;41

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

の精製 M. magneticum株AMB - 1 Magnetosome関連タンパク質MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

出芽酵母のタンパク質濃度の関数としての形態学的表現型の開発の分析

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

マイクロインジェクションによる哺乳動物細胞におけるmRNA核外輸送の速度論の解析

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

マイクロボリュームバイオスペックナノ分光光度計を用いて核酸およびタンパク質の濃度測定

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するために磁気ビーズを用いて液相アフィニティキャプチャーアッセイ：ポリオ-nanobodyの例

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

に基づいて、タンパク質 - タンパク質相互作用の同定のためのプロトコル<sup&gt; 15</sup&gt; Nの代謝標識、免疫沈降法、定量的質量分析法と親和性調節

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

マイクロスケール熱泳動によって結合親和性の決定のタンパク質精製·フリー法

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

組換えタンパク質ベイトを用いてファージディスプレイおよび親和性選択のためのプロトコル

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks

Multi-tissue paraffin blocks provide high throughput analysis with increased efficiency, experimental uniformity, and reduced time and cost. Tissue microarrays make up the majority of multi-tissue paraffin blocks, but increasingly, researchers are using non-arrayed blocks containing larger tissues from multiple individuals which can provide many of the advantages of tissue microarrays without substantial investment in planning and equipment. A critical component of any multi-tissue analysis is the orientation method used to identify each individual tissue. Although methods exist to maintain proper orientation and identification of tissues in multi-tissue blocks, most are not well-suited to non-arrayed blocks, may consume valuable space within an array and/or are difficult to produce in the standard histology laboratory. The Specimen Orientation Tag (SpOT) is a simple, low cost orientation tool that is clearly visible in paraffin blocks and all tissue sections for reliable specimen identification in arrayed and non-arrayed layouts. The SpOT provides advantages over existing orientation methods for non-arrayed blocks as it does not require any direct modification to the tissue and allows for flexibility in the arrangement of tissue pieces.

The purpose of the Specimen Orientation Tag (SpOT) is to function as an orientation tool to aid in individual tissue identification in multi-tissue paraffin blocks. These protocols demonstrate how it is constructed easily from common, low-cost histology materials and serves as a reliable visual marker in paraffin blocks and sections.

マルチ組織ブロック内のスポットの正しい組織毎回

Multi-tissue paraffin blocks provide high throughput analysis with increased efficiency, experimental uniformity, and reduced time and cost. Tissue ...