<img src="/files/ftp_upload/1746/1746fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. La struttura tridimensionale della cistatina complesso B (blu) con papaina (giallo). Mutato residui cistatina B sono mostrati in rosso. 1. Principi di Label-free Analisi interazione con i sistemi Biacore In un tipico esperimento senza etichetta vincolante con un sistema Biacore, una biomolecola chiamato il &#39;ligand&#39; è attaccato alla superficie di un chip del sensore. Un sistema di canali di flusso porta il suo partner di legame, chiamato il &#39;analita&#39;, a contatto con la superficie del chip, in cui la rilevazione si svolge. Quando l&#39;analita si lega al ligando, con conseguente cambiamento di accumulare massa in superficie è rilevata da risonanza plasmonica superficiale (SPR). La risposta SPR è proporzionale alla quantità di analita vincolanti. Dal momento che l&#39;associazione è misurata in tempo reale, la cinetica di associazione e dissociazione costanti di velocità per una specifica interazione può essere determinato. Da queste costanti, è possibile calcolare l&#39;affinità come la dissociazione costante di equilibrio. E &#39;anche possibile calcolare l&#39;affinità di dati allo steady-state vincolanti. Una metodologia simile può essere utilizzato anche per determinare la concentrazione di una proteina che si lega specificamente ad un ligando sulla superficie. 2. Analizzando le proprietà cinetiche di interazione proteina-proteina In X100 Biacore, analisi cinetiche possono essere eseguite utilizzando a ciclo unico cinetica. In un ciclo unico esperimento di cinetica, una serie concentrazione dell&#39;analita viene iniettato in un ciclo di analisi del singolo senza rigenerazione della superficie tra le iniezioni. Pertanto, a ciclo unico cinetica consente l&#39;analisi cinetica quando è difficile trovare le condizioni adatte rigenerazione. Una volta che i dati di un esperimento di cinetica è stato raccolto, il software X100 Biacore valutazione genera i valori di k A, K d e K D inserendo i dati in un modello di interazione. 3. Approcci per determinare la concentrazione delle proteine Analizzando le interazioni tra biomolecole è importante per capire la loro funzione. Che caratterizza il legame di proteine ​​ad altre proteine, di acidi nucleici, o di piccole molecole è fondamentale per la ricerca biochimica, e trova impiego in molti altri settori tra cui la scoperta di farmaci. Per la misurazione accurata della cinetica interazione tra due proteine ​​interagiscono, è essenziale conoscere la concentrazione di proteine ​​legame specifico nel campione sperimentale che viene utilizzato come analita. Una lettura spettrofotometro di A 280 o test colorimetrici come quella impiegando reagente di Bradford è comunemente usato per determinare la concentrazione di proteine ​​totali. Tuttavia, le impurità proteina può influenzare il risultato. Ancora più importante, entrambe le forme attive e inattive della proteina sono inclusi nella concentrazione di proteine ​​totali. In particolare nel caso di proteine ​​ricombinanti, che può essere inattivo a causa di piegatura errato, è importante per determinare la percentuale di proteine ​​legame specifico nel campione. In X100 Biacore, concentrazione relative a specifiche attività di legame può essere determinato dal confronto dei livelli di risposta legame con una curva di calibrazione derivato da uno standard conosciuto, o utilizzando la calibrazione-Free metodologia più recente introduzione Analisi Concentrazione (ACCP). ACCP non si basa su uno standard. Pertanto, ACCP è particolarmente utile nel caso di studiare forme mutanti di proteine, dove gli standard di solito non sono disponibili. In un esperimento ACCP, il tasso iniziale legame è misurata a diverse portate in condizioni in cui la diffusione di campione alla superficie del chip è rate-limiting. Il coefficiente di diffusione dell&#39;analita, le dimensioni della cella di flusso e le portate vengono presi in considerazione nel calcolo della concentrazione specifici vincolante dal 1,2 iniziale tasso vincolanti. In un esperimento cinetica, la concentrazione dell&#39;analita è utilizzato nel calcolo del tasso costante cinetica di associazione e l&#39;affinità dai dati sperimentali. ACCP e misurazione cinetica nei sistemi Biacore entrambi si basano sulle proprietà stessa interazione. Pertanto, usando la concentrazione specifico legame determinata da analisi Biacore, piuttosto che la concentrazione di proteine ​​totali, aumenta l&#39;affidabilità dei risultati. 4. Usando l&#39;analisi Biacore per caratterizzare l&#39;interazione tra la cistatina B e Papaina Cistatina B dei mammiferi è un inibitore reversibile, inibitore competitivo con le proteine ​​e tight-binding di papaina, come proteinasi cisteina, principalmente catepsina B, H, K, L e S. Queste proteine ​​sono principalmente coinvolti in NONSelettiva degradazione delle proteine ​​intracellulari. Cistatine si presume per proteggere le cellule ei tessuti da proteolisi inappropriate da questi enzimi. Hanno anche inattivare proteinasi cisteina da parassiti e virus e può partecipare alla difesa contro l&#39;invasione di questi agenti infettivi. Inoltre, cistatine inibire diversi cisteina proteinasi vegetali, come la papaina, che è spesso utilizzata come un enzima modello di struttura-funzione studi. La struttura tridimensionale del complesso cistatina B con papaina 3 mostra che l&#39;interazione tra le due proteine ​​è dominato da contatti idrofobiche, che, dal lato inibitori, sono forniti da N-e C-terminale e due anse a gomito ( Figura 1). In questo studio, si esamina l&#39;importanza del C-terminale e il secondo ciclo legame di cistatina B per il legame alla papaina utilizzando bovina cistatina B varianti contenenti mutazioni puntiformi nelle aree di interazione con papaina. Per prima cosa determinare la concentrazione specifico legame delle quattro varianti di cistatina B utilizzati, così come quella della proteina wild-type. Una volta che le concentrazioni specifico legame di cistatina B attivi sono determinati, le costanti di velocità e l&#39;affinità di tipo selvatico e varianti mutanti della cistatina B legame con la papaina sono misurati utilizzando X100 Biacore. 5. Strumenti e reagenti <ol><li> Le varianti cistatina B Cys3Ser/His75Gly, Cys3Ser/Leu73Gly, Cys3Ser/Tyr97Ala e Cys3Ser sono prodotti come descritto in precedenza 4. Tutti i mutanti contengono una sostituzione aggiuntiva di cisteina a serina in posizione 3, per evitare la formazione di disolfuro-linked dimeri inattivi di cistatina B. </li><li> L&#39;obiettivo papaina è anche preparato come descritto in precedenza 5. Si tratta di S-(metiltio) papaina (MMTS-papaina) con un gruppo collegato al metiltio Cys25 nella fessura attiva, rendendo il proteasi cataliticamente inattiva. </li><li> X100 Biacore con X100 Biacore Package Plus è usato per misurare e analizzare le concentrazioni specifiche vincolanti e cinetica vincolanti. </li><li> MMTS-papaina è immobilizzato su CM5 Chip sensore utilizzando Biacore Kit di accoppiamento Amine. </li><li> Le piste sono eseguite a 25 ° C, e il buffer è di 0,01 Hepes M a pH 7,4, 0,15 M di NaCl, 0,0034 M EDTA, e 0,05% polisorbato 20. </li><li> Tra ogni variante di cistatina B, la superficie del sensore è rigenerato con 20 mM NaOH per 30 secondi ad una portata di 10 L / min. </li></ol> 6.Immobilization del Ligand MMTS-papaina Attacco covalente di MMTS-papaina per ACCP analisi ACCP si basa sulla misurazione del tasso di legame in condizioni in cui è limitato il tasso di diffusione delle molecole di analita alla superficie (limitazione di trasporto di massa). Ciò è favorito da livelli elevati di immobilizzazione del ligando. Immobilizzazione di MMTS-papaina è stata creata ed eseguire utilizzando la procedura guidata immobilizzazione del software di controllo X100 Biacore. <ol><li> Attivare la superficie in cella di flusso 2 per l&#39;iniezione di una miscela di succinimide (NHS) e carbodiimmide (EDC) per 7 minuti ad un flusso di 10 L / min. Cella di flusso 1 è lasciato invariato al fine di essere usato come superficie di riferimento. </li><li> Iniettare MMTS-papaina a 50μg/ml in tampone sodio acetato a pH 4,5 per 15 minuti ad un flusso di 5 microlitri / min. </li><li> Etanolammina viene iniettato per 7 minuti ad un flusso di 10 L / min per disattivare rimanenti esteri attivi. </li></ol> La procedura di accoppiamento tutto dovrebbe tradursi in ~ 3000 RU MMTS-papaina immobilizzato nella cella di flusso 2. Attacco covalente di MMTS-papaina per l&#39;analisi cinetica La stessa procedura viene utilizzata per immobilizzare MMTS-papaina per l&#39;analisi cinetica, con la sola differenza che in analisi cinetica, il livello di immobilizzazione deve essere basso per evitare il tasso di diventare vincolante limitata per diffusione. Cella di flusso 1 è lasciato non modificato in questa fase anche per essere usato come superficie di riferimento. <ol start="4"><li> Dopo l&#39;attivazione della superficie con la miscela di NHS e EDC come in 7.1, MMTS-papaina è iniettato a 1μg/ml per 50 secondi. Dopo che la superficie viene disattivato con un&#39;iniezione di etanolamina come al punto 7.3. </li></ol> Il livello di accoppiamento deve essere di circa il 50 RU dopo questa procedura. 7. Concentrazione di cistatina B Determinazione del saggio di ACCP <ol><li> L&#39;esperimento ACCP è impostato secondo la procedura guidata ACCP in Biacore X100 Plus Package. Circa 10 nM proteina viene iniettata a portate 10 e 100 l / min in duplice copia per 48 secondi. La superficie è rigenerato con 20 mM di NaOH tra ogni ciclo. </li><li> Comprendono le iniezioni in bianco per ogni portata. </li><li> La concentrazione di proteina è quindi determinato dalla associazione dei dati (Figura 3) utilizzando °e ACCP caratteristica valutazione dei X100 Biacore Inoltre la valutazione del software pacchetto. <img src="/files/ftp_upload/1746/1746fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. I risultati dell&#39;analisi ACCP di wild-type cistatina B. I dati specifici concentrazione vincolanti è stato estratto dal sensorgrams ottenuto a portate di 10 e 100 l / min. <img src="/files/ftp_upload/1746/1746fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Concentrazioni Figura 3. Dei mutanti determinato utilizzando A 280 misurazioni (n = 3) e ACCP (n = 2). Gli errori standard sono indicati da barre di errore. I coefficienti di assorbimento molare sono stati calcolati come descritto in (6). Una grande differenza nei valori di concentrazione Cys3Ser/Leu73Gly mutante determinato con i due metodi possono essere osservati. </li><li> Se si confronta la concentrazione determinata da una misura 280 con quella da ACCP, è chiaro che, mentre nella maggior parte dei casi la proteina è pienamente attiva, per la variante Cys3Ser/Leu73Gly, la frazione di proteina attiva è molto basso (Figura 3). La tabella qui sotto mostra le attività della cistatina B varianti legate alla concentrazione totale da A 280. <table border="0"><tbody><tr><td> Campione </td><td> ACCP rispetto ad A 280 (%) </td></tr><tr><td> Tipo selvatico </td><td> 94 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/His75Gly </td><td> 101 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/Leu73Gly </td><td> 9 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/Tyr97Ala </td><td> 99 </td></tr><tr><td> Cys3Ser </td><td> 83 </td></tr></tbody></table></li></ol> 8. Misurazione della Cinetica di cistatina B legame Papaina <ol><li> Sulla base delle misurazioni ACCP, preparare una duplice serie di concentrazione da 2,5 a 40 Nm per ciascuna delle varianti della cistatina B. </li><li> L&#39;esperimento cinetica viene configurato tramite la procedura guidata cinetica in X100 Biacore con l&#39;approccio singolo ciclo. La superficie non viene rigenerato tra iniezioni, ma dopo la fine di ogni ciclo di analisi utilizzando 20 mM NaOH come soluzione di rigenerazione. </li><li> Impostare l&#39;esperimento in modo che ogni ciclo che contiene campione è affiancata da un ciclo di vuoto, dove viene iniettato buffer invece di campione. </li><li> Utilizzare la funzione di valutazione cinetica in X100 Biacore per eseguire automaticamente sottrazioni vuoto di riferimento sottratto i dati prima di montare un modello di interazione 1:1. </li><li> I dati sperimentali ottenuti per il legame di varianti cistatina B di papaina è mostrata in Figura 4. La tabella seguente riassume l&#39;associazione e costanti di velocità di dissociazione e la costante di equilibrio di dissociazione ottenuti nelle analisi cinetica. <table border="0"><tbody><tr><td> Campione </td><td> k un (M -1 s -1) </td><td> k d (s -1) </td><td> K D (M) </td></tr><tr><td> Tipo selvatico </td><td> 1,8 x 10 6 </td><td> 0,41 x 10 -3 </td><td> 2,3 x 10 -10 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/His75Gly </td><td> 1,1 x 10 6 </td><td> 1,7 x 10 -3 </td><td> 1,5 x 10 -9 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/Leu73Gly </td><td> 1,1 x 10 6 </td><td> 23 x 10 -3 </td><td> 2,2 x 10 -8 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/Tyr97Ala </td><td> 1,7 x 10 6 </td><td> 12 x 10 -3 </td><td> 7,1 x 10 -9 </td></tr><tr><td> Cys3Ser </td><td> 0.9 x 10 6 </td><td> 0,53 x 10 -3 </td><td> 5,8 x 10 -10 </td></tr></tbody></table> <img src="/files/ftp_upload/1746/1746fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Profili cinetici per le varianti B cistatina legame MMTS-papaina determinato utilizzando cinetica singolo ciclo. Sensorgrams spettacolo vuoto e di riferimento sottratto dati con fit cinetici per 1:1 modello di interazione sovrapposti in nero. </li><li> Mentre i tassi di associazione dei mutanti sono paragonabili a quella della proteina wild-type (Figura 5, pannello superiore), le costanti di velocità di dissociazione dei mutanti può essere superiore di quasi due ordini di grandezza, con un corrispondente aumento l&#39;equilibrio di dissociazione costante (Figura 5, riquadro inferiore). <img src="/files/ftp_upload/1746/1746fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. I calcoli delle costanti di velocità e l&#39;affinità sono stati basati sulle concentrazioni ottenute da ACCP. I cambiamenti di k A, K d e K D, associato con le mutazioni sono rappresentati nei grafici. </li><li> Dal momento che la concentrazione del campione è un parametro per il calcolo del tasso di associazione costante dai dati sperimentali, èimportante che sia corretta. Utilizzando la concentrazione in base alla misura A 280 invece di CFCA porterebbe alla conclusione che Leu73 è importante per il tasso di associazione, in cui la sostituzione sembra tradursi in circa 10 volte più lento di associazione altre varianti cistatina B. Tuttavia, la concentrazione specifico legame misurata ACCP è solo il 10% delle proteine ​​totali, in questo caso. Quando questo viene preso in considerazione questo diventa chiaro che il tasso di associazione per Leu73 è simile a quella della altre varianti. Pertanto, ACCP permette una corretta valutazione di k a e K D rendendo così possibile l&#39;interpretazione appropriata del meccanismo di interazione. </li></ol>

<ol>
	<li>Christensen, L. L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theoretical+analysis+of+protein+concentration+determination+using+biosensor+technology+under+conditions+of+partial+mass+transport+limitation.">Theoretical analysis of protein concentration determination using biosensor technology under conditions of partial mass transport limitation.</a> Anal. Biochem. 249, 153-164 (1997).</li><li>Sigmundsson, K., M&#226;sson, G., Rice, R., Beauchemin, N., &#214;brink, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+active+concentrations+and+association+and+dissociation+rate+constants+of+interacting+biomolecules:+an+analytical+solution+to+the+theory+for+kinetic+and+mass+transport+limitations+in+biosensor+technology+and+its+experimental+verification.">Determination of active concentrations and association and dissociation rate constants of interacting biomolecules: an analytical solution to the theory for kinetic and mass transport limitations in biosensor technology and its experimental verification.</a> Biochemistry. 41 (26), 8263-8276 (2002).</li><li>Stubbs, M. T., Laber, B., Bode, W., Huber, R., Jerala, R., Lenarcic, B., Turk, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+refined+2.4+A+X-ray+crystal+structure+of+recombinant+human+stefin+B+in+complex+with+the+cysteine+proteinase+papain:+a+novel+type+of+proteinase+inhibitor+interaction.">The refined 2.4 A X-ray crystal structure of recombinant human stefin B in complex with the cysteine proteinase papain: a novel type of proteinase inhibitor interaction.</a> EMBO J. 9 (6), 1939-1947 (1990).</li><li>Pol, E., Bj&#246;rk, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+second+binding+loop+and+the+C-terminal+end+of+cystatin+B+(Stefin+B)+for+inhibition+of+cysteine+proteinases.">Importance of the second binding loop and the C-terminal end of cystatin B (Stefin B) for inhibition of cysteine proteinases.</a> Biochemistry. 38 (32), 10519-10526 (1999).</li><li>Bj&#246;rk, I., Pol, E., Raub-Segall, E., Abrahamson, M., Rowan, A. D., Mort, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+changes+in+the+association+and+dissociation+rate+constants+for+binding+of+cystatins+to+target+proteinases+occurring+on+N-terminal+truncation+of+the+inhibitors+indicate+that+the+interaction+mechanism+varies+with+different+enzymes.">Differential changes in the association and dissociation rate constants for binding of cystatins to target proteinases occurring on N-terminal truncation of the inhibitors indicate that the interaction mechanism varies with different enzymes.</a> Biochem. J. 299, 219-225 (1994).</li><li>Pace, C. N., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G., Gray, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+measure+and+predict+the+molar+absorption+coefficient+of+a+protein.">How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein.</a> ProteinScience. 4 (11), 2411-2423 (1995).</li></ol>

L&#39;autore è un dipendente di GE Healthcare che produce reagenti e strumenti utilizzati in questo articolo.

In questo lavoro, quattro mutanti e selvaggia cistatina B tipo sono stati prodotti al fine di valutare l&#39;importanza del secondo ciclo vincolante e C-terminale per l&#39;interazione tra cistatina B e la papaina. Questo studio ha dimostrato il vantaggio e la facilità di utilizzo X100 Biacore per determinare la concentrazione vincolanti e specifici per analizzare la cinetica di interazioni proteina-proteina al fine di comprendere le relazioni tra struttura e funzione. Abbiamo dimostrato che misura la concentrazione totale di proteine ​​non rivela le varianti proteiche che hanno ridotto l&#39;attività vincolante, che in questo caso introduce un errore significativo di misura nella determinazione di affinità di legame e cinetica. Le concentrazioni specifico legame delle varianti della cistatina B sono stati determinati utilizzando ACCP con X100 Biacore. Mediante misure di concentrazione di ACCP come input per l&#39;analisi cinetica portato a tasso affidabili e costanti di affinità, permettendo così la giusta interpretazione del meccanismo di interazione. Le affinità diminuzione dei mutanti erano quasi esclusivamente a causa di un maggiore K D-value, mentre k uno è stato colpito solo leggermente. Questo comportamento indica che sia la seconda regione ciclo vincolante e il C-terminale non sono importanti per il tasso di legame inibitore alla papaina. Al contrario, contribuiscono ad affinità di legame soprattutto mantenendo l&#39;inibitore attaccato al enzima una volta che il complesso è stato formato.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Biacore&trade; X100 System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1100-73</td>
<td><a href="http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html">http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Biacore&trade; X100 Plus Package</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1007-98</td>
<td><a href="http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html">http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Sensor Chip CM5</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1000-14</td>
<td><a href="http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html">http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Amine Coupling Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1000-50</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acetate buffer pH 4.5, 50 ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1003-50</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HBS-EP+ buffer 10X, 4 x 50 ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1008-26</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic Vials &Oslash; 11 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1002-87</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rubber caps, type 2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>BR-1004-11</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

the importance of correct protein concentration for kinetics and affinity determination in structure-function analysis 

In questo studio, esploriamo l&#39;interazione tra il bovino B inibitore della proteasi cistatina cisteina e una forma cataliticamente inattiva di papaina (Fig. 1), una proteasi cisteina stabilimento, da un&#39;analisi in tempo reale senza etichetta con X100 Biacore. Diverse varianti di cistatina B con mutazioni puntiformi nelle aree di interazione con la papaina, vengono prodotti. Per ogni variante di cistatina B si determina la concentrazione specifico legame con la calibrazione senza analisi concentrazione (ACCP) e confrontare i valori ottenuti con la concentrazione di proteine ​​totali, come determinato da A<sub&gt; 280</sub&gt;. Dopo di che, la cinetica di ogni variante B cistatina legame con la papaina è misurata utilizzando a ciclo unico cinetica (SCK). Abbiamo dimostrato che una delle quattro varianti di cistatina B prendiamo in esame è solo parzialmente attivo per il legame. Questa attività parziale, rivelato da ACCP, si traduce in una differenza significativa nel tasso di associazione costante (<em&gt; K</em<sub&gt; Un</sub&gt;) E di affinità (<em&gt; K</em<sub&gt; D</sub&gt;), Rispetto ai valori calcolati utilizzando concentrazione totale delle proteine. ACCP utilizzando in combinazione con l&#39;analisi cinetica in una struttura-funzione di studio contribuisce ad ottenere risultati affidabili, e contribuisce a rendere la giusta interpretazione del meccanismo di interazione.

Watch this Scientific Journal Video about The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis at JoVE.com

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

Noi applichiamo un&#39;etichetta priva di analisi di interazioni proteina utilizzando X100 Biacore per la struttura-funzione di analisi del legame di mutanti diversi cistatina B di papaina attraverso la caratterizzazione cinetica. Calibrazione senza analisi concentrazione (ACCP) misura la concentrazione di proteine ​​con attività di legame mantenuto senza la necessità di una curva standard. Abbiamo dimostrato che la conferma delle concentrazioni utilizzando ACCP aumenta l&#39;affidabilità delle analisi cinetica e che le costanti cinetiche possono essere affidabile anche se l&#39;attività di una proteina ricombinante è ridotta.

L&#39;importanza della concentrazione della proteina corretta per Cinetica e determinazione affinità nella struttura-funzione di analisi

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

the-importance-correct-protein-concentration-for-kinetics-affinity

Research

JoVE Journal

Biology

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

20.4K Views.  GE Healthcare Bio-Sciences AB. Noi applichiamo un'etichetta priva di analisi di interazioni proteina utilizzando X100 Biacore per la struttura-funzione di analisi del legame di mutanti diversi cistatina B di papaina attraverso la caratterizzazione cinetica. Calibrazione senza analisi concentrazione (ACCP) misura la concentrazione di proteine ​​con attività di legame mantenuto senza la necessità di una curva standard. Abbiamo dimostrato che la conferma delle concentrazioni utilizzando ACCP aum...

Video: The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

Microvolumi Concentrazione Determinazione delle proteine ​​con il NanoDrop 2000c Spettrofotometro

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Ricerca

Biologia

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purification of the &lt;em&gt;M. magneticum&lt;/em&gt; Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&amp;Delta;41

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purificazione della M. magneticum Strain AMB-1 proteina Magnetosome Associated MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

Analisi dello sviluppo di un fenotipo morfologico come funzione della concentrazione di proteine ​​in lievito

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Analisi della cinetica di esportazione mRNA nucleare in cellule di mammifero da Microiniezione

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

Determinazione concentrazione di acidi nucleici e proteine ​​Utilizzando il Micro-volume Bio-spec Spettrofotometro Nano

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

Un liquido fase di cattura test affinità utilizzando biglie magnetiche per studiare interazioni proteina-proteina: il poliovirus-Nanobody Esempio

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

Un protocollo per l&#39;identificazione di interazioni proteina-proteina Sulla base di<sup&gt; 15</sup&gt; N marcatura metabolica, immunoprecipitazione, Spettrometria di massa quantitativa e di affinità di modulazione

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Protein Purification-libera Metodo di Binding Affinity Determinazione Thermophoresis microscala

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

Un protocollo per Phage Display e affinità selezione con esche proteina ricombinante

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks

Multi-tissue paraffin blocks provide high throughput analysis with increased efficiency, experimental uniformity, and reduced time and cost. Tissue microarrays make up the majority of multi-tissue paraffin blocks, but increasingly, researchers are using non-arrayed blocks containing larger tissues from multiple individuals which can provide many of the advantages of tissue microarrays without substantial investment in planning and equipment. A critical component of any multi-tissue analysis is the orientation method used to identify each individual tissue. Although methods exist to maintain proper orientation and identification of tissues in multi-tissue blocks, most are not well-suited to non-arrayed blocks, may consume valuable space within an array and/or are difficult to produce in the standard histology laboratory. The Specimen Orientation Tag (SpOT) is a simple, low cost orientation tool that is clearly visible in paraffin blocks and all tissue sections for reliable specimen identification in arrayed and non-arrayed layouts. The SpOT provides advantages over existing orientation methods for non-arrayed blocks as it does not require any direct modification to the tissue and allows for flexibility in the arrangement of tissue pieces.

The purpose of the Specimen Orientation Tag (SpOT) is to function as an orientation tool to aid in individual tissue identification in multi-tissue paraffin blocks. These protocols demonstrate how it is constructed easily from common, low-cost histology materials and serves as a reliable visual marker in paraffin blocks and sections.

SPOT Tissue corretto ogni volta in blocchi multi-tessuto

Multi-tissue paraffin blocks provide high throughput analysis with increased efficiency, experimental uniformity, and reduced time and cost. Tissue ...